楊立啟，季堅，黃海嬋，孟祥河*，趙黎明，聶小華*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州，310014) 2(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310014) 3(華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，上海，200237)

柑橘是我國重要的經(jīng)濟作物。其果實富含可溶性糖、有機酸、Vc、礦物質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)以及類黃酮、類胡蘿卜素、香豆素類等功能性物質(zhì)[1-2]，且自古以來，橘絡(luò)、枳殼、枳實、青皮、陳皮就是傳統(tǒng)的中藥材，具有理氣健脾，燥濕化痰等作用[3]，在中醫(yī)臨床中應(yīng)用廣泛。我國常見種植品種為寬皮柑橘、橙、柚、檸檬和枸櫞等[4]；據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，2017年我國柑橘總產(chǎn)量達到3 816.78萬t，但加工利用程度遠遠不足，主要集中在橙汁和橘罐頭等產(chǎn)品，鮮銷壓力大，甚至滯銷。

近年來乳酸菌發(fā)酵果蔬汁備受關(guān)注，既提供調(diào)節(jié)腸道微生物平衡、促進消化的益生菌，又可通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵賦予果蔬汁發(fā)酵風(fēng)味[5]，甚至可能影響到果蔬汁中功能性物質(zhì)及其生理作用[6]。目前已有部分國內(nèi)外學(xué)者對乳酸菌發(fā)酵柑橘汁進行研究[7-9]，主要采用去皮果汁為原料進行輕度發(fā)酵，果皮部分的功能性物質(zhì)未能得到很好利用；以柑橘全果汁發(fā)酵基質(zhì)的研究還鮮有報道，僅限于果酒和果醋方面[10-11]。同時，原料品種在很大程度上影響著果實中可溶性糖、有機酸、黃酮、揮發(fā)性物質(zhì)等種類及其含量[12-13]，這些特征均與微生物發(fā)酵、產(chǎn)品品質(zhì)密切相關(guān)[14-15]，因此應(yīng)選擇合適的柑橘品種進行乳酸菌發(fā)酵。

課題組從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選得到植物乳桿菌L.plantarum15，具有良好發(fā)酵性能和高安全性；前期實驗表明其適用于柑橘帶皮渣全果汁的半固態(tài)發(fā)酵，且苦澀味不明顯。本文以市場常見的寬皮柑橘(蜜桔，春見)、柚(胡柚)和橙(臍橙)4種柑橘為研究對象，探討其全果汁在植物乳桿菌L.plantarum15發(fā)酵過程中各物質(zhì)的變化以及發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售蜜桔(C.unshiuMarcow，溫州)、胡柚(C.paradiseMacf，常山)、臍橙(C.sinensisOsbeck，贛南)、春見[(C.unshiuMarcow ×C.sinensisOsbeck) ×C.reticulataBlanco，浦江]，選擇成熟度合適、無明顯缺陷的新鮮果品。植物乳桿菌L.plantarum15為浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程專業(yè)所保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

PHB-4便攜式pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；752型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；Thermo Trace1300-ISQ單四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司；SPME手動進樣裝置、萃取纖維頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美國Supelco公司；YXQ-LS-50高壓滅菌鍋、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；美的JE25C11榨汁機，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柑橘全果汁的發(fā)酵

柑橘全果依次用次氯酸鈉溶液(有效氯質(zhì)量分數(shù)0.06%)和水清洗后，采用電動榨汁機對其進行壓榨，得到富含果肉果皮的渾濁型柑橘全果汁，調(diào)整其pH值為4.5，按100 mL體積分裝到250 mL已滅菌的三角瓶中，無菌條件下接種一定量的植物乳桿菌L.plantarum15，于30 ℃下發(fā)酵10 d。

1.3.2 化學(xué)成分分析

采用酸度計測定pH值；采用硫酸-苯酚法測定總糖含量[16]；采用3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定還原糖含量[16]；采用電位滴定法測定總酸含量[17]；采用硝酸鋁比色法測定總黃酮含量[17]。

1.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

1.3.3.1 頂空固相微萃取條件

3 mL樣液置于15 mL頂空樣品瓶中，加入1.1 g NaCl，40 ℃下平衡5 min后，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，40 ℃吸附20 min；快速取出萃取頭并插入氣相色譜儀進樣口，250 ℃解吸5 min。

1.3.3.2 色譜條件

色譜柱：DB-5 MS毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：30 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min，載氣(He)流速1.0 mL/min，分流比10∶1。

1.3.3.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊(electron impact,EI)離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z40～550，掃描速率0.2 scan/s。

1.3.3.4 定性方法

GC-MS數(shù)據(jù)定性采用各組分在圖譜庫NIST和Xcalibur 3.0(Thermo Fisher Scientific)中匹配度大于80%的鑒定結(jié)果，并與文獻資料[13]相關(guān)化合物保留指數(shù)(retention index, RI)進行比對分析，揮發(fā)性物質(zhì)的相對百分含量按峰面積歸一法進行計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組樣品平行測定3次，均值、標準偏差計算及作圖采用Graphpad Prism 7軟件，主成分分析和顯著性差異分析采用SPSS軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Duncan統(tǒng)計方法，顯著性差異水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌L.plantarum 15發(fā)酵柑橘全果汁過程中pH的變化

植物乳桿菌L.plantarum15發(fā)酵不同品種柑橘全果汁過程中pH變化如圖1所示。結(jié)果表明，蜜桔、胡柚、臍橙和春見全果汁pH值在發(fā)酵前期(1～2 d) 基本保持穩(wěn)定，而后發(fā)生快速下降并逐漸趨于平緩。這是由于果汁起始pH值較低(4.50)，且氮源營養(yǎng)物質(zhì)不足，在此環(huán)境中乳酸菌生長延滯期增加，甚至酸脅迫下其活菌數(shù)量發(fā)生下降[16-18]；RATCHADAPORN等[16]發(fā)現(xiàn)起始pH<4.5條件下，腰果梨汁經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后其pH未有明顯變化。隨著植物乳桿菌L.plantarum15對柑橘全果汁環(huán)境的適應(yīng)，其利用葡萄糖、果糖和蔗糖等進行同型發(fā)酵，產(chǎn)生大量乳酸，當(dāng)乳酸積累達到一定程度時又會抑制其自身的生長，造成pH快速下降。蜜桔全果汁的pH下降時間明顯早于胡柚、臍橙和春見全果汁，且下降程度與后三者之間存在顯著差異，發(fā)酵10 d后，其pH值由4.50降至2.84，低于曹雪丹等[9]報道。這說明原料品種在一定程度上影響著植物乳桿菌L.plantarum15對柑橘全果汁的發(fā)酵進程，其中蜜桔全果汁更適合乳酸菌的生長發(fā)酵。

圖1 植物乳桿菌L.plantarum 15發(fā)酵柑橘全果汁過程中pH的變化Fig.1 Changes in pH of citrus juices during fermentation by L. plantarum 15注：不同小寫字母表示處理組間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 植物乳桿菌L.plantarum 15發(fā)酵柑橘全果汁過程中主要成分的變化

植物乳桿菌L.plantarum15發(fā)酵不同品種柑橘全果汁過程中總糖、還原糖、總酸和總黃酮等含量變化如圖2～圖5所示。

圖2 植物乳桿菌L.plantarum 15發(fā)酵柑橘全果汁過程中總糖含量的變化Fig.2 Changes in total sugar content of citrus juices during fermentation by L. plantarum 15

圖3 植物乳桿菌L.plantarum 15發(fā)酵柑橘全果汁過程中還原糖含量的變化Fig.3 Changes in reducing sugar content of citrus juices during fermentation by L. plantarum 15

圖4 植物乳桿菌L.plantarum 15發(fā)酵柑橘全果汁過程中總酸含量的變化Fig.4 Changes in total acid content of citrus juices during fermentation by L. plantarum 15

圖5 植物乳桿菌L.plantarum 15發(fā)酵柑橘全果汁過程中總黃酮含量的變化Fig.5 Changes in total flavonoids content of citrus juices during fermentation by L. plantarum 15

結(jié)果表明，發(fā)酵過程中蜜桔、胡柚、臍橙和春見全果汁中總糖含量(見圖2)和還原糖(見圖3)含量均發(fā)生下降，但兩者下降幅度并不一致，主要是因為柑橘中葡萄糖、果糖和蔗糖等起始含量不相同，而乳酸菌對各種糖的利用次序不同[19]；經(jīng)植物乳桿菌L.plantarum15發(fā)酵10 d后，春見全果汁中總糖含量顯著降低了64.66%，蜜桔全果汁中還原糖含量明顯降低了50.71%。隨著發(fā)酵時間的增加，蜜桔、胡柚、臍橙和春見等全果汁中總酸含量(見圖4)隨之明顯增加，與pH變化(見圖1)相一致，主要源于乳酸菌同型發(fā)酵所積累的乳酸，發(fā)酵10 d后總酸含量分別增加了22.38、19.94、19.89和18.22 g/L。此外，蜜桔、臍橙和春見等全果汁中總黃酮(見圖5)含量基本發(fā)生下降而后呈現(xiàn)一定程度上的增加，胡柚全果汁中總黃酮含量隨發(fā)酵時間則表現(xiàn)為上升-下降-上升的變化趨勢，曹雪丹等[9]亦發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵甌柑汁中橙皮苷、柚皮苷等黃酮含量明顯降低，但與楊沖等[17]的結(jié)果相反；推測其原因是乳酸菌可分泌糖苷酶[20]，一方面黃酮苷被水解成水不溶的黃酮苷元，另一方面膳食纖維結(jié)合的黃酮得到釋放。值得關(guān)注的是，胡柚發(fā)酵全果汁中總黃酮含量遠高于其他3種柑橘發(fā)酵全果汁。

2.3 柑橘全果汁發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)變化

不同品種柑橘全果汁發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)種類及其相對含量如表1和表2所示。蜜桔、胡柚、臍橙和春見等全果汁及其發(fā)酵全果汁中共檢出46種揮發(fā)性物質(zhì)，均以烯類為主，其中D-檸檬烯相對含量最高(82.04%～88.76%)，這與李汴生[5]、束文秀等[8]報道相一致。與全果汁相比較，發(fā)酵全果汁中烯類相對含量稍有增加，因為乳酸菌分泌糖苷酶，釋放鍵合態(tài)烯類成游離態(tài)[21-22]，其中β-月桂烯和γ-松油烯相對含量的提高可增強橘香風(fēng)味；醛類種類及其相對含量明顯減少，如己醛、辛醛和癸醛等相對含量顯著降低甚至未檢出，CAGNOTRO等[23]認為醛類在外源性乳酸菌代謝作用下還原成為醇類，導(dǎo)致果汁的清香風(fēng)味減弱。但植物乳桿菌L.plantarum15發(fā)酵并未能豐富醇、酯、酮、酸等揮發(fā)性物質(zhì)種類，其中乙醇、芳樟醇相對含量發(fā)生明顯減少，4-萜烯醇相對含量得到顯著提高，而酯類和酮類的相對含量基本無變化，僅在蜜桔發(fā)酵全果汁和胡柚發(fā)酵全果汁中檢出乙酸。

蜜桔、胡柚、臍橙和春見發(fā)酵全果汁在揮發(fā)性物質(zhì)種類與相對含量等方面均存在著很大的差異，如前兩者中醛類種類較少，后者烯類種類較少，而臍橙發(fā)酵全果汁中可檢出香橙烯，且與其全果汁情況基本一致；這說明發(fā)酵全果汁中揮發(fā)性物質(zhì)很大程度上取決于原料品種，其與乳酸菌代謝共同構(gòu)建出嗅感風(fēng)味的復(fù)雜性和典型性。蜜桔發(fā)酵全果汁中主要揮發(fā)性物質(zhì)為檸檬烯、γ-松油烯、β-月桂烯、β-欖香烯、金合歡烯、大根香葉烯D、4-萜烯醇、芳樟醇和乙酸，胡柚發(fā)酵全果汁中主要揮發(fā)性物質(zhì)為檸檬烯、γ-松油烯、β-月桂烯、大根香葉烯D、大根香葉烯B、4-萜烯醇、萘酚乙酸酯和乙酸；臍橙發(fā)酵全果汁中主要揮發(fā)性物質(zhì)為檸檬烯、β-月桂烯、香橙烯、γ-松油烯、癸醛、芳樟醇和4-萜烯醇，春見發(fā)酵全果汁中主要揮發(fā)性物質(zhì)為檸檬烯、γ-松油烯、β-月桂烯、α-蒎烯、癸醛、芳樟醇和4-萜烯醇。

注： “—”代表未檢出。UFM和FM分別代表蜜桔全果汁及其發(fā)酵全果汁； UFHu和FHu分別代表胡柚全果汁及其發(fā)酵全果汁； UFN和FN分別代表臍橙全果汁及其發(fā)酵全果汁； UFHa和FHa分別代表春見全果汁及其發(fā)酵全果汁。下同。

表2 柑橘全果汁發(fā)酵前后的各類揮發(fā)性物質(zhì)相對百分含量 單位：%

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析

4種全果汁及其發(fā)酵全果汁中的主成分分析的特征值及其貢獻率結(jié)果如表3所示。

表3 主成分特征值及其貢獻率Table 3 Eigenvalues and variance contribution rate of principal components

第一主成分和第二主成分對應(yīng)的特征值大于1，所以提取前兩個主成分，方差貢獻率分別為53.080%、23.102%，累積貢獻率達76.182%，基本可以反映全部指標的信息，第一主成分主要反映烯類、醛類、酮類、酸類及其他類的指標，第二主成分主要反映醇類、酯類和烷類的指標。

第一主成分和第二主成分散點圖結(jié)果如圖6所示。其中第一主成分與臍橙全果汁呈高度正相關(guān)；第二主成分胡柚全果汁和胡柚發(fā)酵全果汁呈高度正相關(guān)。根據(jù)距離的遠近，蜜桔、胡柚和臍橙全果汁發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)變化較大；而春見全果汁發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)變化較小。此外，蜜桔全果汁和春見全果汁中揮發(fā)性物質(zhì)比較接近，發(fā)酵后兩者之間差異性得到增加；而植物乳桿菌L.plantarum15發(fā)酵減弱了臍橙全果汁和春見全果汁中揮發(fā)性物質(zhì)的差異性。這進一步說明柑橘發(fā)酵全果汁的揮發(fā)性物質(zhì)主要取決于原料本身，但乳酸菌發(fā)酵可在一定程度上影響到其揮發(fā)性物質(zhì)。

圖6 柑橘全果汁及其發(fā)酵全果汁的主成分散點圖Fig.6 PCA analysis for unfermented and fermented citrus juices

3 結(jié)論

大量研究證實，不同品種的柑橘在理化性質(zhì)、風(fēng)味和生物活性等方面存在著很大的差異[12]。本文以蜜桔、胡柚、臍橙和春見為研究對象，利用植物乳桿菌L.plantarum15對其帶果皮果肉的全果汁進行深度發(fā)酵。由于酸性環(huán)境和氮源營養(yǎng)物質(zhì)的不足，植物乳桿菌L.plantarum15在柑橘全果汁中表現(xiàn)出較長的遲滯期(1～2 d)，且其生長情況與可溶性糖類、有機酸和總黃酮等起始值并無明顯關(guān)聯(lián)；發(fā)酵后期依然存在著較高含量的總糖和還原糖，說明植物乳桿菌L.plantarum15發(fā)酵的終止并不是源于可溶性糖類的耗竭，而是由于乳酸大量積累所致；相比于胡柚、臍橙和春見，蜜桔全果汁更適合植物乳桿菌L.plantarum15的生長發(fā)酵。黃酮是柑橘果實中重要酚類物質(zhì)，一般具有抗氧化、抗癌、防止心血管疾病、消炎鎮(zhèn)痛和抗菌等生物活性[24]。隨著植物乳桿菌L.plantarum15發(fā)酵的進行，柑橘全果汁的總黃酮含量在前期發(fā)生一定程度的下降，但在后期均呈現(xiàn)出增加趨勢，尤其是胡柚發(fā)酵全果汁；蘇卿指出，柑橘中總黃酮與DPPH顯著正相關(guān)[25]，由此推測，乳酸菌深度發(fā)酵后柑橘全果汁的抗氧化活性可得到提高，但與原料品種有著密切關(guān)聯(lián)。揮發(fā)性物質(zhì)是影響柑橘果實及其加工制品的重要因素之一，主要以游離態(tài)和鍵合態(tài)形式存在。GC-MS表明，蜜桔、胡柚、臍橙和春見全果汁發(fā)酵前后的揮發(fā)性物質(zhì)以烯類為主，其中D-檸檬烯占主導(dǎo)地位；經(jīng)植物乳桿菌L.plantarum15深度發(fā)酵后，β-月桂烯和γ-松油烯相對含量得到提高，可增強發(fā)酵全果汁的柑橘特征香氣，己醛、辛醛和癸醛等相對含量降低甚至消失在一定程度上減弱其青草風(fēng)味，但并不能增加醇、酯、酮、酸等揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量。PCA分析也說明柑橘發(fā)酵全果汁的揮發(fā)性物質(zhì)主要取決于原料本身，僅在一定程度上受乳酸菌發(fā)酵的影響。