余飛，孫俊峰，劉鵬飛，劉艷，王洲，薛正蓮

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖,241000)

硫酸新霉素(neomycin sulfate)是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的2-DOS氨基糖苷類抗生素[1-2]，作為一種理想的干擾蛋白質(zhì)合成的殺菌劑，硫酸新霉素在臨床和獸醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用[3-5]。當(dāng)今發(fā)酵工業(yè)中，誘變育種是提高菌種生產(chǎn)能力，使所需要的代謝產(chǎn)物過(guò)量積累的有效方法之一。而高通量篩選是誘變后能從大量突變株中快速篩選高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵步驟。

目前在工業(yè)上微生物突變株的篩選工作中常用的是隨機(jī)篩選或者理化性質(zhì)篩選，然后再利用搖瓶發(fā)酵，逐個(gè)篩選[6-7]。傳統(tǒng)的篩選方法工作量大、篩選效率低、成本大，而近些年發(fā)展起來(lái)的微孔板的高通量篩選技術(shù)以微孔板為載體，目前已廣泛地應(yīng)用在放線菌生物活性物質(zhì)篩選、菌種的篩選以及新藥的研發(fā)等方面[8-11]，它兼具平行、微型及自動(dòng)等特點(diǎn)；而與分光光度計(jì)[12-13]、高效液相色譜(HPLC)[14-15]和管碟法[16]等相比，酶標(biāo)儀可以1次處理大量的樣品，同時(shí)需要量少，可以節(jié)約試劑的使用；這些方法在篩選高產(chǎn)突變株的工作中都可以提高篩選效率，為高通量篩選硫酸新霉素高產(chǎn)菌株提供了較好的參考。

目前關(guān)于高通量篩選硫酸新霉素高產(chǎn)菌株的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，本研究采用新型常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)育種方法[17-20]誘變硫酸新霉素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌，建立多孔板發(fā)酵及酶標(biāo)儀檢測(cè)的高通量篩選模型(如圖1所示)，為后續(xù)高通量選育其他抗生素高產(chǎn)菌株提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

弗氏鏈霉菌野生型(S.fradiaeGC6010)菌株及指示菌大腸桿菌均為實(shí)驗(yàn)室保藏；HTS-T008孔板搖床，上海甘薇生物技術(shù)有限公司；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；ARTP誘變育種儀，清華大學(xué)無(wú)錫應(yīng)用技術(shù)研究院生物育種研究中心；硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品(642 U/mg)，安徽新宇藥業(yè)股份有限公司。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏1，蛋白胨3，玉米漿3，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.3～7.8，115 ℃滅菌30 min，30 ℃ 培養(yǎng)7 d。

種子培養(yǎng)基(g/L)：淀粉10，花生餅粉10，酵母粉20，(NH4)2SO41，葡萄糖30，玉米漿10，蛋白胨5，Na2HPO41，CaCO310，豆油2，pH 7.3～7.8，115 ℃滅菌30 min，2 mL/孔板、30 mL/250 mL搖瓶，35 ℃、260 r/min培養(yǎng)7 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：淀粉70，花生餅粉28，酵母粉6，(NH4)2SO46，葡萄糖20，玉米漿2.5，蛋白胨9，中溫豆餅粉5，NaCl 4.5，高溫淀粉酶0.3，Na2HPO40.4， CaCO34，豆油3，pH 6.8～7.3，115 ℃滅菌30 min，2 mL/孔板、 30 mL/250 mL搖瓶，35 ℃、260 r/min培養(yǎng)7 d。

圖1 ARTP誘變育種流程圖Fig.1 Scheme of ARTP mutagenesis for microbial breeding

1.2 酶標(biāo)儀測(cè)定硫酸新霉素方法的建立

1.2.1 硫酸新霉素測(cè)定原理及方法

實(shí)驗(yàn)原理：硫酸新霉素與曲利本藍(lán)(TB)反應(yīng)后，生成藍(lán)色離子締合物，并出現(xiàn)明顯的顯色峰，在一定波長(zhǎng)下可測(cè)定待測(cè)溶液中硫酸新霉素效價(jià)[12]。

酶標(biāo)儀：吸取發(fā)酵液200 μL于1.5 mL EP管中，加入1.0×10-4mol/L曲利本藍(lán)溶液500 μL，pH 6.5的BR緩沖液100 μL，用蒸餾水定容至1 mL，搖勻，10 min后吸取反應(yīng)液200 μL于酶標(biāo)板中，以試劑空白為參比，在最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

1.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

于1.5 mL EP管中，依次加入500 μL 1.0×10-4mol/L 的TB溶液，100 μL的25.68 U/mL的硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，100 μL pH 6.5的BR緩沖溶液，用水稀釋至1 mL，搖勻，以試劑空白為參比，10 min 后在酶標(biāo)儀下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定反應(yīng)物的最大吸收峰波長(zhǎng)。

1.2.3 TB溶液添加量對(duì)吸光度的影響及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取25.68 U/mL的硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、150、200、250、300、350、400 μL，分別加入1.0×10-4mol/L TB溶液100、200、300、400、500 μL，100 μL pH 6.5的BR緩沖溶液，用水稀釋至1 mL，搖勻，以試劑空白為參比，10 min后在678 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，確定反應(yīng)體系的TB溶液添加量并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度試驗(yàn)

取已知質(zhì)量濃度的發(fā)酵液，分為2份，分別加入25.68 U/mL硫酸新霉素工作液75 μL和375 μL，制備待測(cè)溶液，按優(yōu)化后的方法在678 nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，計(jì)算硫酸新霉素效價(jià)，每組樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取25.68 U/mL硫酸新霉素工作液200 μL，置1.5 mL EP管中，按優(yōu)化后的方法，放置0、10、20、30、40、50、60 min，在678 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

1.2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已知質(zhì)量濃度的發(fā)酵液，分為5份，分別加入25.68 U/mL硫酸新霉素工作液75、125、175、225、275、325、375 μL，制備待測(cè)溶液，按優(yōu)化后的方法在678 nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，計(jì)算回收率。

1.2.7 酶標(biāo)儀與其他3種方法測(cè)定硫酸新霉素的擬合驗(yàn)證

按優(yōu)化后的方法在678 nm下，分別使用酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)、HPLC和管碟法測(cè)定由ARTP誘變所獲得的25株突變株經(jīng)24孔板發(fā)酵后其中的硫酸新霉素效價(jià)，并利用Origin9.1軟件對(duì)酶標(biāo)儀與其他3種方法所測(cè)硫酸新霉素效價(jià)進(jìn)行擬合曲線分析。

1.3 多孔板發(fā)酵

1.3.1 孔板類型的選擇及優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選經(jīng)ARTP誘變后的29株突變株，通過(guò)對(duì)其24、48孔板與搖瓶發(fā)酵效價(jià)之間相關(guān)性的對(duì)比，選擇更適合高通量篩選的微孔板，并對(duì)所選擇的孔板發(fā)酵條件進(jìn)行正交優(yōu)化。

1.3.2 微孔板孔間差異考察

采用S.fradiaeGC6010菌株的均一搖瓶發(fā)酵液上清，通過(guò)酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)的樣本用Origin 9.1軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本的t-Test，考察酶標(biāo)板孔間差異；若差異不大，再用同一菌株的24孔板發(fā)酵上清去檢測(cè)，考察24孔板孔間差異大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標(biāo)儀測(cè)定硫酸新霉素方法的建立

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由圖2可見(jiàn)，硫酸新霉素與曲利本藍(lán)反應(yīng)形成的藍(lán)色絡(luò)合物在678 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故選擇678 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 硫酸新霉素紫外吸收?qǐng)D譜Fig.2 UV absorption spectra of NM

2.1.2 TB溶液添加量對(duì)吸光度的影響及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖3-a與圖3-b所示，當(dāng)硫酸新霉素濃度在1.284～10.272 U/mL內(nèi)，TB的添加量在100～400 μL/mL時(shí)，都不滿足硫酸新霉素含量與吸光度呈線性關(guān)系，可能是因?yàn)槭贵w系中硫酸新霉素完全形成藍(lán)色絡(luò)合物，TB必須達(dá)到過(guò)飽和。

圖3 TB溶液添加量對(duì)吸光度的影響及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.3 The influence of TB on absorbance and establishment of standard curve

而由于TB的添加量不夠，不足以使反應(yīng)進(jìn)行完全；只有當(dāng)TB的添加量達(dá)到500 μL時(shí)，吸光度與樣品濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：Y=0.032 0X-0.026 2 (R2=0.998 8)。因此，本試驗(yàn)TB的添加量采用500 μL/mL。

2.1.3 精密度試驗(yàn)

為了盡可能減少實(shí)驗(yàn)誤差，使得試驗(yàn)更準(zhǔn)確，提高試驗(yàn)精密度在工業(yè)檢測(cè)中是必不可少的。由表1可知，各組在低濃度和高濃度的RSD均小于0.5%，表明該方法測(cè)定硫酸新霉素效價(jià)精密度高。

表1 精密度試驗(yàn)Table 1 Accuracy examinations

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

從表2可知，體系中剛剛滴加完硫酸新霉素與TB反應(yīng)后立即檢測(cè)，藍(lán)色絡(luò)合物的形成并未達(dá)到飽和，吸光度偏?。环磻?yīng)10 min后，藍(lán)色絡(luò)合物幾乎達(dá)到飽和，吸光度達(dá)到最大值。在實(shí)際過(guò)程中，檢測(cè)誘變后大量突變株經(jīng)孔板發(fā)酵后效價(jià)需要一定的操作時(shí)間，而從表2可知，硫酸新霉素工作液在10～60 min吸光度基本保持不變，穩(wěn)定性良好，滿足實(shí)際需求。

表2 硫酸新霉素工作液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The stability test of NM working solution

2.1.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了驗(yàn)證樣品的前處理過(guò)程是否對(duì)樣品的測(cè)定產(chǎn)生影響以及測(cè)量過(guò)程中是否有基體干擾，必須進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。由表3可知，平均回收率為98.468 4%，RSD為3.270 0%。結(jié)果表明，采用酶標(biāo)儀測(cè)定硫酸新霉素加樣回收率較高，前處理過(guò)程及水溶液基體對(duì)樣品的測(cè)定影響幾乎忽略不計(jì)。

表3 加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of spiked sample

2.1.6 酶標(biāo)儀與其他3種方法測(cè)定硫酸新霉素的擬合驗(yàn)證

相關(guān)強(qiáng)度由相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值決定，相關(guān)系數(shù)的正負(fù)系數(shù)是相關(guān)方向。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)家提出了相關(guān)性強(qiáng)度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將R2= 0.7作為1個(gè)較高的相關(guān)系數(shù)[21]。由圖4可知，擬合曲線的R2=0.940 7、0.911 7和0.927 9，表明酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)、HPLC與管碟法測(cè)定24孔板發(fā)酵液中硫酸新霉素效價(jià)具有很好的正相關(guān)性，可以利用酶標(biāo)儀快速、高效測(cè)定較多發(fā)酵樣品中硫酸新霉素的效價(jià)。

a-酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)法；b-酶標(biāo)儀與HPLC法；c-酶標(biāo)儀與管碟法圖4 酶標(biāo)儀與其他3種方法測(cè)定硫酸新霉素效價(jià)之間的相關(guān)性Fig.4 The relationship between microplate reader and other three methods for determination of NM potency

2.2 多孔板發(fā)酵

2.2.1 孔板類型的選擇

如何從數(shù)量龐大的突變株中省時(shí)、省力地篩選出生產(chǎn)性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，是菌株篩選工作的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選經(jīng)ARTP誘變后的29株突變株，通過(guò)對(duì)其24、48孔板與搖瓶發(fā)酵效價(jià)之間相關(guān)性的對(duì)比，選擇更適合高通量篩選的微孔板，結(jié)果見(jiàn)圖5。

a-24孔板發(fā)酵；b-48孔板發(fā)酵圖5 突變株24、48孔板效價(jià)與搖瓶效價(jià)之間的相關(guān)性Fig.5 The relationship between potency of different microplates and shake flask

由圖5結(jié)果可知，在樣本數(shù)為29時(shí)，搖瓶與24、48孔板發(fā)酵效價(jià)的相關(guān)性分別達(dá)到0.882 3、 0.842 9，相關(guān)性都較良好，但24孔板的發(fā)酵效價(jià)比48孔板更接近搖瓶，所以為提高硫酸新霉素產(chǎn)生菌選育的效率，選擇24孔板作為硫酸新霉素高產(chǎn)突變體快速篩選的工具，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需要對(duì)24孔板發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高24孔板發(fā)酵單位。

2.2.2 微孔板孔間差異考察

本試驗(yàn)均采用的是同一菌株，由表4可知，在P=0.05顯著水平下，酶標(biāo)板孔間差異不顯著；由表5可知，在酶標(biāo)板孔間差異不顯著以及P=0.05顯著水平下，24孔板孔間差異不顯著。因此，在復(fù)篩過(guò)程中可排除系統(tǒng)誤差。

表4 酶標(biāo)板孔間差的t檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of t-Test on difference between the holes of ELISA plate

表5 24孔板孔間差的t檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of t-Test on difference between the holes of 24-well microplate

2.2.3 孔板發(fā)酵條件正交優(yōu)化

根據(jù)弗氏鏈霉菌產(chǎn)硫酸新霉素發(fā)酵過(guò)程中對(duì)氧的需求量較大，而轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量都對(duì)溶氧有一定的影響，基于前期單因素[22]預(yù)實(shí)驗(yàn)，本試驗(yàn)選定轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量3種因素作為考察對(duì)象，選擇3個(gè)水平，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[23-24]。因素水平見(jiàn)表6，24孔板發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 因素水平表Table 6 Factor level table

表7 24孔板發(fā)酵結(jié)果與分析Table 7 The result and analysis of 24-well microplate plate fermentation

由表7試驗(yàn)結(jié)果的極差分析得知，3個(gè)因素對(duì)弗氏鏈霉菌產(chǎn)硫酸新霉素發(fā)酵水平的影響主次順序?yàn)锳>B>C(即轉(zhuǎn)速>裝液量>接種量)。正交試驗(yàn)的最優(yōu)組為試驗(yàn)6，而直觀分析得出的最優(yōu)組為A2B2C1，將試驗(yàn)組6、A2B2C1與原發(fā)酵條件對(duì)照組進(jìn)行3次同期24孔板對(duì)比試驗(yàn)，得到硫酸新霉素發(fā)酵效價(jià)試驗(yàn)組A2B2C1>6>對(duì)照組，試驗(yàn)組A2B2C1平均效價(jià)為(6 825±77) U/mL，比對(duì)照組的(5 357±68) U/mL 提高了27.40%，由此可見(jiàn)，該試驗(yàn)方案穩(wěn)定可行，最后得出24孔板最優(yōu)結(jié)果為：接種量為8%，轉(zhuǎn)速為220 r/min，裝液量為2 mL。

3 討論

目前文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于硫酸新霉素的檢測(cè)方法主要包括：(1)高效液相色譜法。在抗生素的含量與雜質(zhì)的測(cè)定中，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、使用范圍廣，在食品殘留硫酸新霉素的檢測(cè)中，這種方法檢測(cè)效果良好，也適合在科研中有高準(zhǔn)確度測(cè)定要求中使用；(2)微生物法。在靈敏度及多樣品處理時(shí)表現(xiàn)較好，可用于硫酸新霉素產(chǎn)生菌菌種選育，但是這種測(cè)定方法的影響因素多，測(cè)定耗時(shí)長(zhǎng)，故在工業(yè)生產(chǎn)中使用較少；(3)分光光度計(jì)法。在硫酸新霉素產(chǎn)量的測(cè)定中，簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，適合工業(yè)中使用。但以上方法大多成本高、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜，不宜用于大批量樣品的檢測(cè)。而酶標(biāo)儀滿足吸光物質(zhì)濃度在一定波長(zhǎng)下與吸光度成線性相關(guān)的規(guī)律，是實(shí)驗(yàn)室常用的設(shè)備[25]，適用于物質(zhì)的檢測(cè)定量分析，且能夠一次性快速檢測(cè)大量的樣品，在硫酸新霉素高產(chǎn)菌株的選育中具有高效性。

對(duì)于菌種的選育工作來(lái)說(shuō)，高產(chǎn)突變株的篩選是一項(xiàng)重要的工作，篩選方法的選擇對(duì)于篩選的效率有著重要的影響。而近些年來(lái)基于微孔板的高通量篩選已廣泛應(yīng)用于各個(gè)方面，同一塊微孔板可以提供大量有相同的流體動(dòng)力學(xué)特性和相同形狀的微型生物反應(yīng)器，這使得在試管、搖瓶上的菌體培養(yǎng)可以在微型化的孔板上進(jìn)行。JOHN等通過(guò)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的96微孔板發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)得該培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣傳遞速率，并發(fā)現(xiàn)了在微孔板、搖瓶以及發(fā)酵罐培養(yǎng)的生長(zhǎng)參數(shù)具有良好的一致性[26]。同時(shí)，由于微孔板體積小、裝液量少，因此篩選大量突變株時(shí)耗費(fèi)的培養(yǎng)基及樣品量也少，同時(shí)檢測(cè)時(shí)需要的試劑量也減少，這極大節(jié)省了篩選的成本。

本文基于多孔板發(fā)酵及酶標(biāo)儀檢測(cè)高通量選育模型，成功建立酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)酵液中硫酸新霉素的方法，并對(duì)24孔板發(fā)酵條件進(jìn)行單因素和正交優(yōu)化，使優(yōu)化后硫酸新霉素的效價(jià)較原發(fā)酵條件提高了27.40%。