陸玉成，王麗娟，車峰遠(yuǎn)，于繼徐，姜良軍，張禮忠，李少欽

1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030000；2.臨沂市人民院 中心實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276000；3.臨沂市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 臨沂 276000；4.臨沂市人民醫(yī)院 病理科，山東 臨沂276000；5.江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221000

中心體是由2 個(gè)中心粒及其周圍物質(zhì)組成的非膜細(xì)胞器，存在于哺乳動(dòng)物和低等植物細(xì)胞中。它是細(xì)胞的微管組織中心，對(duì)于細(xì)胞分裂和維持基因組穩(wěn)定性非常重要[1]。在正常細(xì)胞中，中心體負(fù)責(zé)產(chǎn)生兩極有絲分裂紡錘體，促進(jìn)染色體分離成2 個(gè)相同的子細(xì)胞，在每個(gè)子細(xì)胞中均包含1 個(gè)中心體。中心體異常擴(kuò)增，是在一個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)超過(guò)2 個(gè)中心體的情況?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)中心體異常擴(kuò)增存在于各種類型的癌癥中，包括各種實(shí)體腫瘤和白血病[2]。

膠質(zhì)瘤是人腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于其與腦組織邊界不清晰，且常常呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，所以手術(shù)不易將其完全切除，并且術(shù)后常出現(xiàn)高復(fù)發(fā)率和高致殘率。雖然現(xiàn)在對(duì)膠質(zhì)瘤采用手術(shù)切除和術(shù)后放、化療等綜合治療，但總體治療效果不好[3]。先前研究報(bào)道[4]，中心體擴(kuò)增與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但目前還沒(méi)有關(guān)于膠質(zhì)瘤方面的報(bào)道。

我們收集正常腦組織和各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤共50 例，用HE 染色和免疫組化檢測(cè)Ki67 陽(yáng)性表達(dá)來(lái)確定腦膠質(zhì)瘤的分級(jí)，并采用免疫組化和免疫熒光方法檢測(cè)中心體擴(kuò)增與膠質(zhì)瘤分期的相關(guān)性，旨在探討中心體擴(kuò)增在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集臨沂市人民醫(yī)院2017年1～12月的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本40 例（實(shí)驗(yàn)組），收集重癥腦外傷手術(shù)患者的正常腦組織標(biāo)本10 例（對(duì)照組），依據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，包括Ⅰ/Ⅱ級(jí) 20 例、Ⅲ級(jí) 10 例、Ⅳ級(jí) 10 例。本研究通過(guò)了臨沂市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且所選患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 材料

光學(xué)顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus 公司；γ-微管蛋白抗體和Ki-67 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；光譜型SP 試劑盒、DAB 顯色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 蘇木精-伊紅（HE）染色

取材置于4%多聚甲醛溶液中，過(guò)夜固定；次日進(jìn)行乙醇由低到高梯度脫水和二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋；包埋后切片，置于載玻片上，再用二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，接著再進(jìn)行乙醇由高到低梯度至水洗，再行蘇木精染色，水洗1～2 min，鹽酸乙醇分化，水洗1～2 min，0.5%氨水水洗反藍(lán)，水洗1～2 min，伊紅染色，90%乙醇1 min，無(wú)水乙醇2 次，每次2 min，封片保存，并在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織的病理變化。

1.4 免疫組化

組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，經(jīng)枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）抗原修復(fù)處理，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用10%小牛血清封閉，然后加入γ-微管蛋白和Ki67 抗體，PBS 沖洗，加入二抗及SP/HRP，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。

1.5 免疫熒光

連續(xù)切片2 μm，將切片貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，乙醇復(fù)水，經(jīng)枸櫞酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH6.0）抗原修復(fù)處理，滴加小牛血清封閉處理，滴加γ-微管蛋白抗體，用于顯示中心體，于4℃冰箱中過(guò)夜，滴加二抗（室溫下避光濕盒孵育1 h），加入DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色，用抗熒光淬滅劑封片。從制備的標(biāo)本中隨機(jī)抽取2～4 張切片，以一抗不加γ-微管蛋白的同步染色作為陰性對(duì)照。

1.6 結(jié)果判定

1.6.1 免疫組化結(jié)果評(píng)價(jià) 隨機(jī)抽取制備的切片，在雙盲情況下由2 名病理科同事觀察評(píng)價(jià)結(jié)果并采集病理圖像。γ-微管蛋白染色陽(yáng)性定位為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈均勻著色的棕黃色，其中細(xì)胞核處會(huì)著色深；Ki67 染色陽(yáng)性定位為細(xì)胞核著色為棕黃色。計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6.2 中心體觀察與計(jì)數(shù) 具有以下特征之一可判定為中心體異常擴(kuò)增：①在一個(gè)細(xì)胞中觀察到3 個(gè)或3 個(gè)以上中心體；②中心體直徑大于同一張切片中心體直徑的2 倍或以上；③形狀異常中心體，包括長(zhǎng)形中心體、線狀中心體、成塊狀中心體及成簇堆積中心體。

在熒光顯微鏡10×100 倍數(shù)下，每張切片選取腫瘤區(qū)10 個(gè)視野，首先計(jì)數(shù)視野內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)，接著計(jì)數(shù)具有異常中心體的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每個(gè)樣本異常中心體細(xì)胞占所計(jì)數(shù)的腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分率，即中心體異常擴(kuò)增率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量材料采用x±s，2組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色檢測(cè)組織標(biāo)本的病理變化

正常腦組織層次分明，細(xì)胞密度均勻，細(xì)胞核規(guī)則，無(wú)異型性細(xì)胞；Ⅰ/Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞密度增加，異型性較明顯，核深染但較規(guī)則，可出現(xiàn)少數(shù)多核或瘤巨細(xì)胞；Ⅲ級(jí)細(xì)胞大小形態(tài)不一致，細(xì)胞排列紊亂，核異型性更加明顯；Ⅳ級(jí)細(xì)胞大小形態(tài)極不一致，出現(xiàn)多核瘤巨細(xì)胞，核膜不清晰，可多至數(shù)個(gè)核，出現(xiàn)大面積壞死灶（圖1）。

2.2 Ki67在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其相關(guān)性

Ki67 在正常腦組織中沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)；在Ⅰ/Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中，13 例陽(yáng)性表達(dá)，7 例陰性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為65%；Ⅲ級(jí)中8 例陽(yáng)性表達(dá)，2 例陰性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為80%；Ⅳ級(jí)中10 例全部陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為100%（圖2）。分析表明Ki67 在不同腦組織中的表達(dá)強(qiáng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=24.753，P＜0.01）（表1）。與正常腦組織相比，Ⅰ/Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織的Ki67 陽(yáng)性表達(dá)率均較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。

2.3 免疫組化檢測(cè)γ-微管蛋白的表達(dá)

γ-微管蛋白是微管蛋白家族成員，具有控制有絲分裂紡錘體復(fù)制的功能，是中心體復(fù)制的重要蛋白[5]。當(dāng)前在中心體的研究中，都是通過(guò)檢測(cè)γ-微管蛋白來(lái)評(píng)估中心體的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果顯示，在正常組織中，僅有3 例細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淺黃色，其余均為陰性表達(dá)；Ⅰ/Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中，有10 例出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)黃色，并且有的細(xì)胞核附近出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)；Ⅲ級(jí)中有8 例出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，并且細(xì)胞核及其周圍出現(xiàn)棕黃色；Ⅳ級(jí)中全部10 例出現(xiàn)細(xì)胞核與周圍胞質(zhì)棕褐色表達(dá)，并且表達(dá)情況明顯強(qiáng)于其他級(jí)別與正常腦組織（圖3）。對(duì)γ-微管蛋白表達(dá)情況做了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖1 正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織HE染色結(jié)果（×200）

圖2 正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中Ki67的表達(dá)（×200）

表1 Ki67在正常腦組織和各膠質(zhì)瘤級(jí)別中的表達(dá)

2.4 免疫熒光檢測(cè)中心體的表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖4。細(xì)胞核呈藍(lán)色，γ-微管蛋白在細(xì)胞中呈紅色，顯示此處為中心體。中心體異常擴(kuò)增表現(xiàn)在中心體數(shù)目增加（多于2 個(gè)）、中心體體積增大、中心體形狀異常。正常對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)中心體異常，Ⅰ/Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中分別有2.25%±1.15%、5.04%±2.12%和5.25%±2.23%的中心體異常擴(kuò)增。

3 討論

膠質(zhì)瘤是原發(fā)性的顱內(nèi)神經(jīng)惡性腫瘤。2016年，世界衛(wèi)生組織將其分為4 個(gè)級(jí)別，其中Ⅰ/Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ/Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤。級(jí)別越低越容易治療，且預(yù)后相對(duì)較好，生存時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，而高級(jí)別膠質(zhì)瘤難治療，預(yù)后較差，生存時(shí)間也相對(duì)較短。當(dāng)前膠質(zhì)瘤的診斷主要依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)（如頭痛頭暈、惡心嘔吐和視覺(jué)障礙等），再加以輔助檢查（如顱腦CT 平掃、顱腦核磁共振平掃和PET 等）。對(duì)膠質(zhì)瘤級(jí)別的判斷還須進(jìn)行病理學(xué)分析。我們的結(jié)果顯示，與正常腦細(xì)胞相比，Ⅰ/Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞密度增加，異型性較明顯，胞核深染但較規(guī)則，出現(xiàn)少數(shù)多核或瘤巨細(xì)胞；Ⅲ級(jí)細(xì)胞大小形態(tài)不一致，細(xì)胞排列紊亂，核異型性更加明顯；Ⅳ級(jí)細(xì)胞大小形態(tài)極不一致，出現(xiàn)多核瘤巨細(xì)胞，核膜不清晰，可多至數(shù)個(gè)核，出現(xiàn)大面積壞死灶。

圖3 正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中γ-微管蛋白的表達(dá)（×1000）

表2 γ-微管蛋白在正常腦組織和各膠質(zhì)瘤級(jí)別中的表達(dá)

Ki67 是一種細(xì)胞核抗原，它的表達(dá)情況常常與腫瘤的形成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等惡性程度相關(guān)，所以Ki67 通常作為腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)。最近有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，Ki67 在許多惡性腫瘤中表達(dá)程度的升高造成了差的臨床療效及預(yù)后。我們的實(shí)驗(yàn)表明，正常腦組織中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Ki67的表達(dá)，Ⅰ/Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中Ki67 陽(yáng)性表達(dá)率為65%，Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中Ki67 陽(yáng)性表達(dá)率為80%，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中Ki67 陽(yáng)性表達(dá)率為100%。從以上結(jié)果可以觀察到，Ki67 陽(yáng)性表達(dá)率與膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高呈正相關(guān)。Smith 等[7]也發(fā)現(xiàn)正常腦組織中Ki67沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)；Wanyne[8]和 Okumura 等[9]也報(bào)道了Ki67 在不同病理級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤中均陽(yáng)性表達(dá)，并且隨著腫瘤級(jí)別升高，表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度均升高。這和本研究結(jié)果相一致。

圖4 免疫熒光檢測(cè)中心體擴(kuò)增（×1000）

中心體是動(dòng)物細(xì)胞中主要的微管組織中心，參與維持細(xì)胞極性、染色體的正確分離。γ-微管蛋白作為中心體微管蛋白家族成員之一，控制著有絲分裂紡錘體的復(fù)制[5]，是有絲分裂中心體復(fù)制中的關(guān)鍵蛋白，實(shí)驗(yàn)中通常以檢測(cè)γ-微管蛋白的表達(dá)來(lái)反映中心體狀態(tài)。中心體擴(kuò)增是指1 個(gè)細(xì)胞中包含2 個(gè)以上的中心體。眾所周知，中心體擴(kuò)增可以引起染色體不穩(wěn)定，從而引起基因組的不穩(wěn)定，造成腫瘤發(fā)生，可以增加腫瘤的侵襲性并使患者的預(yù)后變差[10-11]。鑒于此，中心體擴(kuò)增在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越多。Pihan 等[12]報(bào)道，在子宮頸癌、膀胱癌和乳腺癌中，中心體擴(kuò)增均發(fā)生在癌癥早期階段。Mahathre 等[13]報(bào)道，在結(jié)直腸癌中，中心體擴(kuò)增可以作為一個(gè)生物標(biāo)志物，并可作為個(gè)性化治療的靶點(diǎn)。Yamamoto 等[14]報(bào)道，中心體擴(kuò)增可以作為尿路上皮癌分類與預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。我們的結(jié)果顯示，在正常腦組織中未發(fā)生中心體擴(kuò)增，但在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤樣本中都檢測(cè)到了中心體擴(kuò)增，并且從低級(jí)別到高級(jí)別的進(jìn)展中，中心體在細(xì)胞中的擴(kuò)增率是逐漸升高的，表明在膠質(zhì)瘤中中心體擴(kuò)增也可以作為腫瘤發(fā)展和臨床病理分級(jí)的標(biāo)志物。

總之，中心體異常擴(kuò)增隨著膠質(zhì)瘤的級(jí)別升高呈逐漸遞增趨勢(shì)，說(shuō)明中心體擴(kuò)增是膠質(zhì)瘤發(fā)展過(guò)程中不可缺少的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)然，我們的發(fā)現(xiàn)還須大量樣本進(jìn)一步檢驗(yàn)。相信未來(lái)對(duì)中心體擴(kuò)增的研究將有利于改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。