趙森峰，豆松萌，李崇輝，黃皚雪，張?zhí)?，邵寧生，劉?/p>

1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；3.解放軍總醫(yī)院 肝膽外科，北京 100853

膽囊結(jié)石是危害人類健康的常見疾病，并隨著人們生活習(xí)慣、生存環(huán)境的改變而呈現(xiàn)增長趨勢[1-2]。在我國，膽囊結(jié)石的發(fā)病率高達(dá)10%，其患者入院率高，達(dá)到普通外科入院率的11.5%。

microRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，主要通過特定的匹配方式綁定到靶基因mRNA 3'端非編碼區(qū)（UTR），降解靶向mRNA 或者抑制其翻譯[3-4]。近年越來越多的研究表明miRNA 可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡等細(xì)胞過程，與多種疾病的進(jìn)展具有重要聯(lián)系[5-6]。Yang 等[7]發(fā)現(xiàn) miRNA 對膽囊結(jié)石的形成有重要影響，miR-133a、miR-891a 和miR-210 等在膽囊結(jié)石患者的膽囊組織中異常表達(dá)。

有關(guān)膽囊結(jié)石與血清miRNA的研究較少，基于此，我們利用miRNA 測序技術(shù)篩選膽囊結(jié)石患者與健康人血清中的差異表達(dá)miRNA，探討其靶基因及潛在功能，為膽囊結(jié)石臨床診斷及防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

采集2018年3～11月在解放軍總醫(yī)院肝膽外科因膽囊結(jié)石診治的患者血清25 例（試驗(yàn)組），及在本院體檢中心查體的健康人血清25 例（對照組）。試驗(yàn)組男10 例，女15 例，平均年齡（47.68±12.16）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）（23.66±2.98）kg/m2；對照組男 9 例，女 16 例，平均年齡（49.60±14.23）歲，平均BMI（24.41±3.54）kg/m2。兩組患者的性別、年齡、BMI 等信息無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理確診為膽囊結(jié)石，且膽囊組織無急性炎癥；②無病毒性肝炎、內(nèi)分泌性疾病或自身免疫性疾??；③在3個月內(nèi)未使用任何抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他膽囊疾?。耗懩蚁偌“Y、膽囊息肉、膽囊癌、急性膽囊炎、壞疽性膽囊炎。

TRIzol LS購于Invitrogen公司；M-MLV RT購于Promega公司；RiboLock RNase抑制劑購于Fer?mentas公司；dNTP購于Tiangen公司；大腸桿菌poly（A）聚合酶、10×大腸桿菌 poly（A）聚合酶反應(yīng)緩沖液和ATP 購于New England Biolabs 公司；Thunderbird SYBR Green qPCR Mix 購于Toyobo公司；RT-PCR 及qPCR 引物由上海生工生物工程公司合成；cel-miR-39 由廣州銳博公司合成。

1.2 血清收集

研究對象禁食12 h 后，于次日清晨經(jīng)肘靜脈采集外周血5 mL，采集后4℃靜置0.5～1 h；4℃、1600 r/min 離心 10 min，上清液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 無RNA 酶的 Eppendoff 管中；4℃、16 000 r/min 離心10 min，以徹底除去細(xì)胞碎片與雜質(zhì)；將上清分裝至 1.5 mL 無 RNA 酶的 Eppendoff 管中，于-80℃超低溫冰箱中冷凍保存。

1.3 血清RNA提取及質(zhì)量鑒定

每 0.25 mL 血清中加入 1 μL 1 μmol/L 外參cel-miR-39（5'-TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3'），按TRIzol LS試劑說明書提取血清 RNA 后稀釋于 15 μL DEPC 水中，-80℃保存。用Quawell Q5000檢測RNA的濃度及D260mm/D280mm值 ，用 Agi?lent 2100 Bioanalyzer 測定其完整性。

1.4 miRNA測序

取研究組與對照組各4 例凍存血清miRNA，于干冰條件下當(dāng)日送至北京安諾公司分析血清miRNA 質(zhì)量，RNA 質(zhì)量合格后對每例血清miRNA進(jìn)行建庫測序。

1.5 血清RNA逆轉(zhuǎn)錄

取 600 ng 血清 RNA，用 DEPC 水補(bǔ)至 12.8 μL，加入 12.2 μL 反應(yīng)體系［包括 2.5 μL 10 mmol/L MnCl2、2.5 μL 10×大腸桿菌poly（A）聚合酶反應(yīng)緩沖液、2.5 μL dNTP、2.5 μL ATP、1.0 μL QmiR-RT Primer（5'-GCGAGCACA GAATTA?ATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'）、0.5 μL 大腸桿菌 poly（A）聚合酶、0.5 μL M-MLV RT、0.2 μL RiboLock RNase 抑制劑］，混勻后30℃水浴逆轉(zhuǎn)錄90 min，70℃水浴滅活15 min，DEPC 水稀釋至250 μL，-20℃保存。

1.6 qPCR

用Stratagene 公司的Mx3000P qPCR 儀檢測待測miRNA的相對水平。取3 μL cDNA，加入17 μL 反應(yīng)體系［反應(yīng)體系包括10 μL SYBR Green qPCR Mix、6 μL DEPC 水、1 μL 待測 miRNA 引物（表1）］。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性 15 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，40 個循環(huán)。每個qPCR 重復(fù)3 次。

1.7 生物信息學(xué)分析

用PITA、miRanda 和TargetScan 預(yù)測差異miRNA靶基因，保留至少存在于2 種預(yù)測軟件中的靶基因；對差異miRNA的靶基因進(jìn)行GO（Gene Ontology）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge?nomes）分析，GO 分析中，P≤0.05 為差異表達(dá)miRNA的靶基因在GO 條目中顯著性富集。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，計量資料以x±s描述，2 組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)。計數(shù)資料以頻數(shù)描述，2 組數(shù)據(jù)間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 時具有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 qPCR所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 樣本miRNA序列分析

各樣本序列長度主要集中于 20～25 nt，4 例試驗(yàn)組和4 例對照組血清miRNA 序列數(shù)量平均分別為 14 899 245 和 11 783 121 個 ，其 miRNA 種類平均分別為 686 和 633 個，差異 miRNA 共 16 個，均為下調(diào)（表2）。

2.2 GO和KEGG功能分析

差異 miRNA 預(yù)測靶基因共 5832 個，GO 分析顯示，在生物過程上其主要富集于細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生物調(diào)節(jié)和代謝過程等，在細(xì)胞組成上其主要富集于細(xì)胞成分和細(xì)胞器成分等，在分子功能上其主要富集于結(jié)合和活性催化等（圖1）。差異miRNA的靶基因KEGG 功能分析顯示，其參與了122 條信號通路，主要包括環(huán)腺苷酸（cAMP）信號通路、催產(chǎn)素信號通路、生理周期通路等（表3）。

2.3 qPCR驗(yàn)證

隨機(jī)挑取4 個差異表達(dá)倍數(shù)較大的miRNA（miR-1228、miR-1249、miR-3614 和 miR-766）進(jìn)行qPCR，利用外參cel-miR-39 對其進(jìn)行相對定量。結(jié)果表明 miR-1228、miR-1249、miR-3614 和miR-766 在膽囊結(jié)石患者血清中均下調(diào)，其表達(dá)變化趨勢與測序結(jié)果基本一致，但miR-1228、miR-3614 和miR-766 在2 組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，而miR-1249 無統(tǒng)計學(xué)差異（圖2）。

表2 差異表達(dá)的miRNA

2.4 驗(yàn)證miRNA的靶基因功能分析

miR-1228、miR-1249、miR-3614 和 miR-766預(yù)測靶基因分別為 3965、566、153 和 101 個，參與GO 分析的靶基因分別為 3486、543、136 和 96 個，參與KEGG 功能分析的靶基因分別為2295、367、93 和 72 個，各 miRNA 預(yù)測靶基因在 GO 和 KEGG主要通路上的分布見表4。

圖1 差異miRNA的靶基因GO分析

表3 差異miRNA的靶基因KEGG功能分析

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA 在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，不論良性疾病，還是惡性腫瘤，其在分子水平上對疾病的發(fā)生具有重要影響[8-9]。我們通過基因測序技術(shù)，初步建立膽囊結(jié)石患者和健康人的血清miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了16個差異miRNA，預(yù)測并分析了其靶點(diǎn)及功能。另外，通過 qPCR 方法驗(yàn)證了 miR-1228、miR-1249、miR-3614、miR-766 在 2 組間差異趨勢與測序結(jié)果基本一致，說明測序結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

圖2 2組miRNA相對差異水平（*P＜0.05）

表4 miRNA預(yù)測靶基因在GO和KEGG主要通路上的分布

Yang等[7]發(fā)現(xiàn)膽囊組織中miR-133a、miR-891a、miR-210 和 miR-200c 等異常表達(dá)，miR-210可以靶向調(diào)節(jié)ATP11A，從而可能影響膽囊結(jié)石的形成。本研究預(yù)測的血清差異miRNA的靶基因基本涵蓋了Lammert 等[10-11]總結(jié)的膽囊結(jié)石相關(guān)致石基因，ABCG5、ABCG8、ABCB4、FXR、NR1H4 等重要致石基因均在其靶點(diǎn)預(yù)測范圍中。

多數(shù)學(xué)者[12-15]認(rèn)為miRNA 是膽囊結(jié)石形成的重要分子之一，因?yàn)槟懝檀即x異常對膽囊結(jié)石的形成具有決定性作用，而miRNA 可以影響膽固醇代謝過程。比如，miR-122a、miR-422a 可以抑制 CYP7A1的表達(dá)[16]、miR185 可以抑制 SREBP-2的表達(dá)[17]、miR-33a 可以促進(jìn) ABCA1的表達(dá)[18]，這些途徑都會影響膽固醇合成、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。本研究發(fā)現(xiàn)的部分血清差異miRNA 在膽固醇代謝過程中發(fā)揮重要作用，miR-223 可通過抑制HMGCoA-S1 和SC4MOL的表達(dá)而抑制膽固醇的合成，miR-223 也可以提高ABCA1的表達(dá)而促進(jìn)膽固醇外流[19]；miR-24 可通過抑制SR-B1的表達(dá)而抑制膽固醇合成[20]。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)了膽囊結(jié)石相關(guān)新的血清差異miRNA，并采用生物信息學(xué)方法分析了其差異miRNA的靶點(diǎn)及功能，這對揭示膽囊結(jié)石形成的病理機(jī)制具有重要影響，有助于我們進(jìn)一步深入探討miRNA 對膽囊結(jié)石形成的具體分子機(jī)制。