陳 廣， 溫貴蘭?， 張喜懿， 程振濤， 王開功，文 明， 周碧君， 張升波， 田 浪， 楊佰啟， 李昌紅， 徐 麗

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550016)

禽白血病(AL)是反轉(zhuǎn)錄病毒科，α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的禽腫瘤性疾病的總稱，包括淋巴細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞增多癥、成髓細(xì)胞性白血病、髓細(xì)胞瘤病、血管瘤、腎瘤和腎胚細(xì)胞瘤、纖維肉瘤和其他結(jié)締組織瘤、骨硬化病以及其他類型的腫瘤[1]。目前ALV可分為ALV-A～ALV-K共11個(gè)亞型[2]。以禽為宿主的有 7 個(gè)亞型，即 A、B、C、D、E、J、K 亞型，其中致病性最強(qiáng)的為J亞型，自ALV-J被發(fā)現(xiàn)以來(lái)對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]，是目前世界上ALV造成經(jīng)濟(jì)損失最大的亞型。A、B、K 3種亞型致病性較J亞型弱，但仍有較強(qiáng)致病性。C、D亞型報(bào)道較少，E亞型為非致病性或者致病性很弱的ALV亞型[4]?，F(xiàn)對(duì)貴州省凱里市某養(yǎng)雞場(chǎng)送檢病料進(jìn)行ALV檢測(cè)與基因序列分析的情況報(bào)道如下，與同行探討。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)病料貴州省凱里市某養(yǎng)雞場(chǎng)4只送檢病死蛋雞的心、肝、脾、肺、腦組織。

1.2 主要試劑(1)RNA提取試劑盒，購(gòu)自世紀(jì)元亨公司。(2)2×EsTaqDNA聚合酶，購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司。(3)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL 2 000 DNA Marker，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)P27蛋白是禽白血病毒核心衣殼蛋白的主要成分，內(nèi)、外源性ALV均含有p27基因，參照文獻(xiàn)[5]根據(jù)p27基因設(shè)計(jì)1對(duì)ALV通用引物，引物序列為p27-EcoR I-F:CGGAATTCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG；p27-XbaI-R:GCTCTAGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC，預(yù)期擴(kuò)增片段744 bp。

A、B、J亞型共用上游引物ALV-A/B/J:5’-CGG AGAAGACACCCTTGCT-3’；ALV-AR:5’-GCATTGC CACAGCGGTACTG-3’，預(yù)擴(kuò)增片段 715 bp。ALVBR:5’-GTAGACACCAGCCGGACTATC-3’，預(yù)擴(kuò)增片段 515 bp。 ALV-JR:5’-CGAACCAAAGGTAACA CACG-3’，預(yù)擴(kuò)增片段 422 bp。

1.4 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書，無(wú)菌環(huán)境下提取病料組織中病毒總RNA，提取完成后于-20℃保存?zhèn)溆?。以提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系:Primer Mix 2 μL、dNTP Mix 4 μL、DTT 2 μL、5×RT Buffer 4 μL、HiFiS-cript 1 μL、RNase-Free Water 5 μL、RNA 2 μL，42 ℃孵育 40 min，85℃ 孵育 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，2 500 r/min，離心10 s，置于 -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-PCR 反應(yīng)反應(yīng)體系:ddH2O 6 μL，2×TaqMasterMix 10 μL，cDNA 2.0 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物1.0 μL，共計(jì)20.0 μL。 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 1 min，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 測(cè)序與分析對(duì)目的條帶割膠后，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。在GenBank下載14株雞源性ALV各亞型毒株各2株(見表1)。用生物學(xué)軟件Megalign對(duì)所得序列與GenBank收錄的14株ALV毒株進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 ALV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

圖1 病料RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果按照RT-PCR反應(yīng)體系和條件，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，ALV通用引物在744 bp處出現(xiàn)特異性條帶，而ALV-A/B/J 3個(gè)亞型引物檢測(cè)為陰性，見圖1。

2.2 同源性分析用生物學(xué)軟件Megalign對(duì)該序列與GenBank收錄的14株ALV毒株進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見圖2。其中同源性最高的為ALV-E中的ev-1株和ev-3株，為99.5%(命名為:ALV-P27)。序列與J亞型代表毒株HPRS-103株的同源性較低，為36.2%。同源性最低是A亞型中的Schmidt-Ruppin A 株，為34.2%。 與 B、C、D、K 4個(gè)亞型間的同源性均在35.5%～37.1%之間，同源性都較低。

圖2 ALV毒株同源性分析結(jié)果

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析根據(jù)GenBank發(fā)布的序列，下載其中14株ALV毒株與序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。所測(cè)基因序列與E亞型的ev-1和ev-3毒株親緣關(guān)系較近，處在相同的1個(gè)分支。其與所有外源性ALV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處在關(guān)系最遠(yuǎn)的2個(gè)大的分支。

圖3 ALV毒株遺傳進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論與討論

3.1通過(guò)RT-PCR檢測(cè)和基因序列比對(duì)，確定檢測(cè)病料中存在ALV-E亞型感染，表明貴州家禽存在內(nèi)源性ALV感染。

3.2禽白血病以引發(fā)腫瘤和免疫抑制為特征，分為內(nèi)源性和外源性兩大類[6]。內(nèi)源性ALV指整合到宿主細(xì)胞染色體基因組中的可通過(guò)染色體垂直傳播的ALV前病毒DNA及其可能產(chǎn)生的ALV粒子。內(nèi)源性ALV一般不致病，但能與外源性ALV發(fā)生重組成為致病性更強(qiáng)的ALV[7]。內(nèi)源性ALV的存在給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了安全隱患，也干擾了對(duì)ALV的診斷。內(nèi)源性ALV就像原癌基因，當(dāng)原癌基因被激活時(shí)就引發(fā)癌癥[8]。內(nèi)源性ALV對(duì)雞來(lái)說(shuō)不是必須的，能否通過(guò)某些技術(shù)(基因編輯)培育出無(wú)內(nèi)源性ALV基因的雞品種還需進(jìn)一步驗(yàn)證。