孫華，馬紅霞，丁夢軍，李坡，石潔，劉樹森

?

擬輪枝鐮孢ATMT突變體庫的構(gòu)建及分析

孫華，馬紅霞，丁夢軍，李坡，石潔，劉樹森

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心， 河北保定 071000）

【目的】通過建立適用于擬輪枝鐮孢（）的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系，構(gòu)建綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的擬輪枝鐮孢ATMT（-mediated transformation）突變體庫，并對(duì)突變體庫進(jìn)行篩選分析，為研究擬輪枝鐮孢在玉米果穗上的侵染途徑和致病的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。【方法】篩選頭孢噻肟鈉（cefotaxime sodium，Cefo）和氨芐青霉素鈉（ampicillin sodium，Amp）對(duì)根癌農(nóng)桿菌AGL-1的抑菌濃度和擬輪枝鐮孢對(duì)潮霉素B（hygromycin B）的敏感濃度；以含有綠色熒光蛋白基因（）、潮霉素抗性基因（）的穿梭質(zhì)粒為載體，通過ATMT構(gòu)建GFP標(biāo)記的擬輪枝鐮孢突變體庫；利用潮霉素抗性篩選、的特異性引物進(jìn)行PCR檢測和熒光顯微鏡觀察，檢測分析T-DNA插入情況及轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性；從突變體庫中隨機(jī)挑選9個(gè)轉(zhuǎn)化子菌株并進(jìn)行分析，對(duì)其產(chǎn)孢量、分生孢子萌發(fā)率、致病力等進(jìn)行測定?！窘Y(jié)果】通過農(nóng)桿菌抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cefo/Amp的濃度為150/150 μg·mL-1時(shí)，AGL-1生長受到抑制；當(dāng)潮霉素B的濃度為150 μg·mL-1時(shí)，擬輪枝鐮孢完全喪失生長能力。利用優(yōu)化后的ATMT轉(zhuǎn)化獲得了2 465株GFP標(biāo)記的擬輪枝鐮孢轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)化子在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接5代再轉(zhuǎn)到含潮霉素B的培養(yǎng)基上仍能正常生長，說明成功插入野生型基因組且穩(wěn)定遺傳；利用特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測，測序結(jié)果顯示與NCBI中（登錄號(hào)：LC420351.1）的同源性為99.26%，表明已成功整合到野生型基因組中；轉(zhuǎn)化子菌絲和孢子在熒光顯微鏡下觀察均呈現(xiàn)綠色，而野生型菌株未觀察到任何熒光，表明轉(zhuǎn)移到擬輪枝鐮孢野生型菌株基因組中，且能夠成功表達(dá)。對(duì)部分轉(zhuǎn)化子分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比轉(zhuǎn)化子54的產(chǎn)孢量明顯增多，約為野生型的1.9倍；轉(zhuǎn)化子24的分生孢子萌發(fā)率在相同時(shí)間內(nèi)明顯下降；轉(zhuǎn)化子13的致病力增強(qiáng)，病害級(jí)別達(dá)到9級(jí)，轉(zhuǎn)化子33和16致病力減弱為3級(jí)，轉(zhuǎn)化子4致病力最弱為1級(jí)，部分轉(zhuǎn)化子生物學(xué)性狀未發(fā)生明顯變化?！窘Y(jié)論】構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)GFP標(biāo)記的擬輪枝鐮孢突變體庫，篩選分析獲得了產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、致病力發(fā)生變化的突變體，為進(jìn)一步研究擬輪枝鐮孢侵染玉米果穗的途徑和致病的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

玉米；擬輪枝鐮孢；ATMT；突變體庫；綠色熒光蛋白；轉(zhuǎn)化子

0 引言

【研究意義】玉米是世界三大糧食作物之一[1]，是重要的飼料和工業(yè)原料。近年來，玉米穗腐病的發(fā)生日益嚴(yán)重。擬輪枝鐮孢（）是引起玉米穗腐病的重要致病菌[2-3]，常造成嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失，其產(chǎn)生的毒素還威脅人畜健康[4-5]。目前生產(chǎn)上抗玉米穗腐病的品種較少，對(duì)穗腐病的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，亟需對(duì)其侵染途徑和致病機(jī)理進(jìn)行研究。構(gòu)建帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的擬輪枝鐮孢ATMT突變體庫，并以此為對(duì)象研究穗腐病菌的侵染和致病機(jī)理，對(duì)尋找防治該病害的新策略、新方法具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，對(duì)于擬輪枝鐮孢的產(chǎn)毒類型、生物學(xué)特征、結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制、遺傳多樣性和引起病害的防治等方面已有較為清楚的認(rèn)識(shí)[6-14]。擬輪枝鐮孢對(duì)玉米果穗的侵染途徑也有所報(bào)道，但研究結(jié)果存在爭議。一般認(rèn)為有3種途徑：（1）種傳，通過母系傳播給下一代，首先通過種子進(jìn)入初生根，然后朔根向上進(jìn)入植株的莖髓引起植株的系統(tǒng)侵染[15-16]；（2）氣傳，其分生孢子通過氣流落到葉鞘縫隙處侵染葉鞘組織或莖節(jié)，病原菌向上侵染引起穗腐，或落到花絲上，進(jìn)而侵染籽粒[17-18]；（3）土傳，土壤中的病菌通過菌絲的生長直接侵染玉米植株根系，然后繼續(xù)向上侵染植株地上組織，直到果穗，引起穗腐[19-20]。由于以上結(jié)果的獲得大多采用的是組織化學(xué)染色法、病菌分離法等傳統(tǒng)的方法，需用更有效的方法進(jìn)一步明確。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（-mediated transformation，ATMT）以其受體廣泛、操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、單拷貝比例高等優(yōu)點(diǎn)在真菌研究中被廣泛應(yīng)用[21]，目前已有近100種真菌成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。如黃亞麗[22]以哈茨木霉（）孢子為受體，通過ATMT法構(gòu)建了含有4 500株轉(zhuǎn)化子的突變體庫，其中80%為隨機(jī)單拷貝插入；王梅娟等[23]通過ATMT法構(gòu)建玉米大斑病菌（）突變體庫，大部分菌株菌落形態(tài)和生長速率沒有發(fā)生明顯改變；許苗苗等[24]通過ATMT法構(gòu)建了青色熒光標(biāo)記的禾谷鐮孢（）轉(zhuǎn)化子?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】擬輪枝鐮孢侵染玉米導(dǎo)致穗腐病的侵染途徑和致病機(jī)理存在爭議，采用傳統(tǒng)的組織化學(xué)染色法病菌分離法無法實(shí)時(shí)、活體觀察病原菌，且檢測分辨率低，不能清晰的標(biāo)記定位病原菌，這也是擬輪枝鐮孢侵染機(jī)制存在爭議的原因之一。利用標(biāo)記研究其侵染途徑，利用反向遺傳學(xué)克隆致病相關(guān)基因，成為研究其致病機(jī)制的突破口之一?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以玉米穗腐病樣本上分離到的擬輪枝鐮孢為研究對(duì)象，通過摸索優(yōu)化擬輪枝鐮孢ATMT轉(zhuǎn)化，構(gòu)建具有綠色熒光蛋白標(biāo)記、遺傳穩(wěn)定、致病力變異的轉(zhuǎn)化子突變體庫，為擬輪枝鐮孢侵染玉米導(dǎo)致穗腐病的過程及致病機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 擬輪枝鐮孢、根癌農(nóng)桿菌AGL-1（帶有雙價(jià)載體質(zhì)粒，該質(zhì)粒將pCAMBIA1300骨架中的 pCaMV35S-hph置換為pTrpc，同時(shí)含有和）由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所玉米綜合防控實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 化學(xué)試劑 乙酰丁香酮（AS）、MES、頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素鈉、利福平、卡那霉素等產(chǎn)品均購自Sigma公司；潮霉素Ｂ購自Roche公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司；2×Es Taq MasterMix（含染料），全氏金生物科技有限公司；Biowest Agarose G-10，南京生興生物技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L；LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 L；LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 L；2.5×MM salts：KH2PO43.625 g，K2HPO45.125 g，NaCl 0.375 g，MgSO4·7H2O 1.250 g，CaCl20.125 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0065 g，(NH4)2SO41.250 g，蒸餾水定容至1 L，pH 5.2；IM液體培養(yǎng)基：2.5×MM salts 400 mL，無水葡萄糖1.8 g，甘油5 mL，ddH2O定容到940 mL；IM固體培養(yǎng)基：2.5×MM salts 400 mL，無水葡萄糖0.9 g，甘油5 mL，瓊脂粉14 g，ddH2O定容到940 mL；CYA培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，蒸餾水定容到1 L，瓊脂粉按14 g·L-1分裝到三角瓶，pH 7.4。

1.1.4 儀器 PCR儀，東勝龍ETC-811；DYY-11型電泳儀，北京六一儀器廠；GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；正置熒光顯微鏡，Olmpus BX63。

1.2 方法

2017年在本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化擬輪枝鐮孢突變體構(gòu)建的條件并構(gòu)建突變體庫，2018年將隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)化子在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)其進(jìn)行PCR檢測和熒光觀察，并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率進(jìn)行測定，在試驗(yàn)田對(duì)轉(zhuǎn)化子的致病力進(jìn)行測定。

1.2.1 頭孢噻肟鈉和氨芐青霉素鈉對(duì)根癌農(nóng)桿菌抑菌濃度的測定 將根癌農(nóng)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6后，取150 μL涂布于含頭孢噻肟鈉/氨芐青霉素鈉分別為0/0、50/50、100/100、150/150、200/200 μg·mL-1的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，28℃黑暗培養(yǎng)4 d后觀察菌落生長情況，確定頭孢噻肟鈉/氨芐青霉素鈉的抑菌濃度。

1.2.2 擬輪枝鐮孢野生型對(duì)潮霉素B的敏感性試驗(yàn) 將在PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗培養(yǎng)7 d的擬輪枝鐮孢野生型菌株，用打孔器取相同菌齡和直徑的菌餅，接種到含潮霉素B濃度分別為0、10、25、50、75、100、150 μg·mL-1的PDA培養(yǎng)基中央，27℃培養(yǎng)7 d后觀察菌落生長情況，確定潮霉素B的篩選濃度，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 擬輪枝鐮孢突變體庫的構(gòu)建 參照張小飛等[25]擬輪枝鐮孢ATMT轉(zhuǎn)化方法，并作部分修改。將農(nóng)桿菌在LB平板上（含100 μg·mL-1的利福平和卡那霉素）活化2 d，然后挑單菌落到5 mL的LB液體培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1的利福平和卡那霉素）28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d左右。將活化后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中8 000 r/min離心30 s，棄上清后用IM培養(yǎng)基（含MES 40 mmol·L-1，AS 200 μmol·L-1）沖洗一次，然后溶于0.2 mL的IM培養(yǎng)基內(nèi)，測定OD600，確定濃度，然后加入IM培養(yǎng)基，使終濃度達(dá)到OD600=0.15，29℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，使OD600介于0.5—0.6。將擬輪枝鐮孢在PDA培養(yǎng)基上活化，用5 mL的IM液體培養(yǎng)基將其沖洗后三層擦鏡紙過濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后用IM培養(yǎng)基稀釋到終濃度 1×106cfu/mL，28℃萌發(fā)6 h。將農(nóng)桿菌與擬輪枝鐮孢等量混勻后取200 μL涂IM平板（已加玻璃紙），靜置30 min讓水分吸干后25℃共培養(yǎng)3 d。將玻璃紙轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基CYA（含頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素鈉和潮霉素B，濃度為1.2.1和1.2.2結(jié)果顯示的最適濃度）上，培養(yǎng)7 d后開始挑選可能的轉(zhuǎn)化子到PDA培養(yǎng)基（含頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素鈉和潮霉素B，濃度為1.2.1和1.2.2結(jié)果顯示的最適濃度）進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的PCR檢測和熒光觀察 用真菌基因組提取試劑盒提取擬輪枝鐮孢轉(zhuǎn)化子與野生型的DNA，以野生型的基因組DNA為陰性對(duì)照，質(zhì)粒DNA為陽性對(duì)照，用綠色熒光蛋白特異性引物[26]（Μ61：TAAACGGCCACAAGTTCA；Μ62：TGCTC GGGTAGTGGTTGT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為25 μL：DNA 2 μL，10 μmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL，Tap Mix 12.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 1 min，59℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，染色，照相。PCR產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTn比對(duì)。在熒光顯微鏡下觀察擬輪枝鐮孢轉(zhuǎn)化子的菌絲和孢子。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性檢測 隨機(jī)挑選8個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)到另一不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，如此培養(yǎng)5代后，再轉(zhuǎn)移到含潮霉素B（濃度根據(jù)1.2.2結(jié)果而定）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其生長情況。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)孢量的測定 將野生型菌株和轉(zhuǎn)化子菌株分別接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃黑暗培養(yǎng)7 d后，在菌絲表面滴加20 mL無菌水，用滅菌的載玻片輕輕刮下分生孢子，經(jīng)三層擦鏡紙過濾到50 mL三角瓶中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)分生孢子的數(shù)量。

1.2.7 轉(zhuǎn)化子分生孢子萌發(fā)率的測定 取濃度為1×105個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液200 μL到水瓊脂培養(yǎng)基上涂布均勻，28℃黑暗培養(yǎng)，每2 h在顯微鏡下觀察分生孢子的萌發(fā)率，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)觀察200個(gè)分生孢子，比較野生型菌株和轉(zhuǎn)化子菌株分生孢子萌發(fā)率的差異。

1.2.8 轉(zhuǎn)化子在玉米上的致病力測定 將野生型菌株和轉(zhuǎn)化子菌株分別在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d后，用無菌水沖洗培養(yǎng)基表面，紗布過濾后，配制成濃度為1×106個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，采用花絲噴霧法噴到授粉3 d（吐絲后5—7 d）后的玉米花絲上，套上人工授粉袋。收獲后對(duì)發(fā)病等級(jí)進(jìn)行調(diào)查，并將發(fā)病籽粒在加有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行病原菌分離。

2 結(jié)果

2.1 頭孢噻肟鈉和氨芐青霉素鈉對(duì)根癌農(nóng)桿菌抑菌濃度的測定

農(nóng)桿菌菌液涂于含有不同濃度頭孢噻肟鈉/氨芐青霉素鈉的LB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)4 d后，在濃度為0/0、50/50、100/100 μg·mL-1的處理中均出現(xiàn)菌落，其他濃度無菌落出現(xiàn)。因此，確定頭孢噻肟鈉/氨芐青霉素鈉濃度為150/150 μg·mL-1作為病原菌ATMT轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌抑菌濃度。

2.2 不同濃度潮霉素B對(duì)擬輪枝鐮孢野生型菌株生長的影響

擬輪枝鐮孢在含不同濃度潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，其生長受到不同程度的抑制（圖1）。當(dāng)潮霉素B的濃度為0時(shí)，擬輪枝鐮孢培養(yǎng)7 d后菌落已覆蓋全皿；10—100 μg·mL-1潮霉素B使菌株生長受到強(qiáng)烈抑制，而在150 μg·mL-1潮霉素B上，菌絲完全喪失生長能力，菌株死亡。因此，本研究以150 μg·mL-1潮霉素B來篩選轉(zhuǎn)化子。

2.3 擬輪枝鐮孢ATMT突變體庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性檢測

利用1.2.3的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了含有2 465株轉(zhuǎn)化子的擬輪枝鐮孢ATMT突變體庫。轉(zhuǎn)化子在不含潮霉素B的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5代后轉(zhuǎn)移到含潮霉素B的培養(yǎng)基上仍能正常生長，說明成功插入且穩(wěn)定遺傳。

A—G： 0、10、25、50、75、100和150 μg?mL-1潮霉素B 0, 10, 25, 50, 75, 100 and 150 μg?mL-1 hygromycin B, respectively

從標(biāo)記的擬輪枝鐮孢突變體庫中隨機(jī)選擇10株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析，提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以綠色熒光蛋白特異引物進(jìn)行PCR檢測，以質(zhì)粒載體為陽性對(duì)照，以野生型菌株DNA為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)化子和質(zhì)粒載體均能擴(kuò)增出條帶大小為550 bp左右的片段，而野生型菌株未擴(kuò)出條帶，表明這些轉(zhuǎn)化子基因組中確實(shí)含有基因序列。將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上BLAST比對(duì)，與（登錄號(hào)：LC420351.1）的同源性為99.26%，再次表明已成功轉(zhuǎn)移到野生型菌株基因組DNA中。

2.4 轉(zhuǎn)化子的熒光觀察

因ATMT轉(zhuǎn)化使用的載體含有，如果為陽性轉(zhuǎn)化子，在熒光顯微鏡下應(yīng)能觀測到綠色熒光。將轉(zhuǎn)化子和野生型菌株分別在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)化子的菌絲和孢子均可觀察到綠色熒光，而野生型菌株未觀察到任何熒光，說明已經(jīng)將轉(zhuǎn)移到擬輪枝鐮孢野生型菌株基因組中，且能夠成功表達(dá)（圖3）。

M：100 bp Ladder；1：陽性對(duì)照 Positive control；2—11：轉(zhuǎn)化子Transformants；12：陰性對(duì)照Negative control

圖3 GFP在擬輪枝鐮孢中的表達(dá)

2.5 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)孢量的測定

通過對(duì)9種轉(zhuǎn)化子和野生型菌株進(jìn)行產(chǎn)孢量的測定，轉(zhuǎn)化子54產(chǎn)孢量明顯增多，約為野生型菌株的1.9倍；轉(zhuǎn)化子13、24、49產(chǎn)孢量明顯減少，約為野生型菌株的60%—70%（圖4）。

2.6 轉(zhuǎn)化子分生孢子萌發(fā)率的測定

對(duì)分生孢子萌發(fā)率進(jìn)行觀測（圖5），培養(yǎng)6 h時(shí)轉(zhuǎn)化子24、48的孢子萌發(fā)率不足20%，其他菌株的萌發(fā)率在50%左右，萌發(fā)率在培養(yǎng)6 h后有大幅度的上升，14 h后，轉(zhuǎn)化子24的孢子萌發(fā)率為96.67%，其他菌株均完全萌發(fā)。

2.7 轉(zhuǎn)化子在玉米上的致病力測定

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的致病力，對(duì)野生型菌株和5株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了致病力測定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子13的致病力比野生型菌株強(qiáng)，病害級(jí)別達(dá)到9級(jí)，野生型菌株和轉(zhuǎn)化子24表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，病害級(jí)別達(dá)到5—7級(jí)；轉(zhuǎn)化子33和16致病力較弱，病害級(jí)別為3級(jí)，轉(zhuǎn)化子4的致病力最弱，病害級(jí)別為1級(jí)（圖6）；對(duì)發(fā)病籽粒進(jìn)行病原菌分離純化及熒光觀察，結(jié)果顯示病原菌仍為攜帶綠色熒光蛋白基因的擬輪枝鐮孢。

圖4 部分?jǐn)M輪枝鐮孢轉(zhuǎn)化子和野生型菌株產(chǎn)孢量比較

圖5 部分?jǐn)M輪枝鐮孢轉(zhuǎn)化子和野生型菌株孢子萌發(fā)率的比較

3 討論

微生物遺傳轉(zhuǎn)化方法包括PEG-CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、基因槍法、電激法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ATMT轉(zhuǎn)化等。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ATMT轉(zhuǎn)化方法以其操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到絲狀真菌的研究中，因該技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化子多為T-DNA單拷貝插入，適于突變體庫的構(gòu)建[27]。目前，該方法已經(jīng)應(yīng)用到黑曲霉（）、稻瘟病菌（）和尖鐮孢（）等100多種絲狀真菌中[28-30]。

圖6 部分?jǐn)M輪枝鐮孢轉(zhuǎn)化子和野生型菌株的致病力測定

綠色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用到病原菌與宿主的互作研究中，其可以直觀、實(shí)時(shí)檢測病原菌在宿主內(nèi)的附著、侵染和定殖過程[31]。目前，國內(nèi)外利用成功標(biāo)記了尖鐮孢、水稻紋枯病菌（）、尖孢炭疽菌（）和新月彎孢（）等多種真菌[30-33]。

擬輪枝鐮孢能夠侵染玉米的穗、莖、根等，從而引起玉米穗腐病、莖腐病和根腐病等。吳磊等[34]利用紅色熒光蛋白基因（）和對(duì)引起玉米根腐病的擬輪枝鐮孢進(jìn)行標(biāo)記，并觀察了標(biāo)記的擬輪枝鐮孢在玉米根部的定殖和生長規(guī)律；蓋曉彤[35]用標(biāo)記的擬輪枝鐮孢接種玉米，以明確擬輪枝鐮孢引起玉米莖腐病和穗腐病的關(guān)系。擬輪枝鐮孢是引起玉米穗腐病的主要病原菌，本研究通過測定頭孢噻肟鈉和氨芐青霉素鈉對(duì)根癌農(nóng)桿菌抑菌濃度，擬輪枝鐮孢對(duì)潮霉素B敏感濃度的優(yōu)化，得出頭孢噻肟鈉和氨芐青霉素鈉對(duì)根癌農(nóng)桿菌的最適抑菌濃度為150/150 μg·mL-1，擬輪枝鐮孢對(duì)潮霉素B的敏感濃度為150 μg·mL-1。利用ATMT轉(zhuǎn)化法成功地將插入到擬輪枝鐮孢的基因組中，并通過熒光顯微鏡觀察和PCR分子檢測，獲得遺傳穩(wěn)定、標(biāo)記的擬輪枝鐮孢突變體庫，為擬輪枝鐮孢與玉米果穗間互作機(jī)制的研究提供了條件。

通過對(duì)野生型和隨機(jī)挑選的突變體菌株進(jìn)行產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、致病力測定，發(fā)現(xiàn)了與野生型菌株存在明顯差異的轉(zhuǎn)化子菌株，但大多數(shù)轉(zhuǎn)化子與野生型菌株間沒有明顯差異。這與玉米大斑病菌、玉米彎孢葉斑病菌的轉(zhuǎn)化子與野生型菌株間大多數(shù)無明顯差異，少數(shù)存在差異的研究結(jié)果是一致的[36-37]。這一結(jié)果與T-DNA隨機(jī)整合到基因組中的性質(zhì)有關(guān)，為獲得致病力弱或無致病力的菌株提供了可能。目前，筆者實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)一步擴(kuò)大擬輪枝鐮孢ATMT突變體庫，以期獲得致病力變異的轉(zhuǎn)化子，為研究擬輪枝鐮孢在花絲上的侵染過程和致病的分子機(jī)理打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

優(yōu)化了擬輪枝鐮孢的ATMT轉(zhuǎn)化體系，獲得了含有2 465株轉(zhuǎn)化子的綠色熒光蛋白標(biāo)記且穩(wěn)定遺傳的擬輪枝鐮孢突變體庫，隨機(jī)選取部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析，獲得了產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、致病力發(fā)生變化的突變體，為進(jìn)一步研究擬輪枝鐮孢侵染玉米果穗的途徑和致病的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

[1] 丘卓秋, 吳海燕, 龍彥蓉. 玉米孢囊線蟲發(fā)生危害和生物學(xué)研究進(jìn)展. 植物保護(hù), 2017, 43(4): 16-20.

QIU Z Q, WU H Y, LONG Y R. Research progress in the occurrence and biology of., 2017, 43(4): 16-20. (in Chinese)

[2] ORTIZ C S, RICHARDS C, TERRY A, PARRA J, SHIM W B. Genetic variability and geographical distribution of mycotoxigenicstrains isolated from maize fields in texas., 2015, 31(2): 203-211.

[3] Duan C X, Qin Z H, Yang Z H, Li W X, Sun S L, Zhu Z D, Wang X M. Identification of pathogenicspp. causing maize ear rot and potential mycotoxin production in China., 2016, 8(6): 186.

[4] LANUBILE A, BERNARDI J, MAROCCO A, LOGRIECO A, PACIOLLA C. Differential activation of defense genes and enzymes in maize genotypes with contrasting levels of resistance to., 2012, 78: 39-46.

[5] ZHOU D N, Wang X M, CHEN G K, Sun S L, YANG Y, Zhu Z D, Duan C X. The majorspecies causing maize ear and kernel rot and their toxigenicity in Chongqing, China., 2018, 10(2): 90.

[6] PROCTOR R H, BROWN D W, PLATTNER R D, DESJARDINS A E. Co-expression of 15 contiguous genes delineates a fumonisin biosynthetic gene cluster in., 2003, 38(2): 237-249.

[7] KIM H, WOLOSHUK C P. Role of, a regulator of nitrogen metabolism, during colonization of maize kernels and fumonisin biosynthesis in., 2008, 45(6): 947-953.

[8] MYUNG K, ZITOMER N C, DUVALL M, GLENN A E, RILEY R T, CALVO A M. The conserved global regulator VeA is necessary for symptom production and mycotoxin synthesis in maize seedlings by., 2012, 61(1): 152-160.

[9] BLUHM B H, KIM H, BUTCHKO R A E, WOLOSHUK C P. Involvement ofofin kernel colonization and the regulation of, a putative sugar transporter gene required for fumonisin biosynthesis on maize kernels., 2008, 9(2): 203-211.

[10] CHOI Y E, SHIM W B. Functional characterization of, a gene encoding a putative protein phosphatase 2A catalytic subunit., 2008, 154(1): 326-336.

[11] 孫華, 郭寧, 石潔, 張海劍, 馬紅霞, 劉樹森. 海南玉米穗腐病病原菌分離鑒定及優(yōu)勢種的遺傳多樣性分析. 植物病理學(xué)報(bào), 2017, 47(5): 577-583.

SUN H, GUO N, SHI J, ZHANG H J, MA H X, LIU S S. Characterization of the maize ear rot pathogens and genetic diversity analysis of dominant species in Hainan., 2017, 47(5): 577-583. (in Chinese)

[12] 任旭. 我國玉米穗腐病主要致病鐮孢菌多樣性研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011.

REN X. Diversity analyses ofspp., the main causal agents of maize ear rot in China[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese)

[13] 李曉鴦, 馬周杰, 蓋曉彤, 汪浩德, 姚遠(yuǎn), 孫艷秋, 高增貴. 東北地區(qū)玉米穗腐鐮孢菌種類鑒定及擬輪枝鐮孢菌遺傳多樣性. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 49(2): 136-142.

LI X Y, MA Z J, GAI X T, WANG H D, YAO Y, SUN Y Q, GAO Z G. Identification ofspecies causing maize ear rot in northeast China and the diversity of., 2018, 49(2): 136-142. (in Chinese)

[14] 隋韻涵, 肖淑芹, 董雪, 薛春生, 陳捷. 九種殺菌劑對(duì)和毒力及玉米穗腐病的防治效果. 玉米科學(xué), 2014, 22(2): 145-149.

SUI Y H, XIAO S Q, DONG X, XUE C S, CHEN J. Toxicity and field control effect of nine fungicides againstear rot., 2014, 22(2): 145-149. (in Chinese)

[15] HEADRICK J M, PATAKY J K. Maternal influence on the resistance of sweet corn lines to kernel infection by., 1991, 81(3): 268-274.

[16] MUNKVOLD G P, CARLTON W M. Influence of inoculation method on systemicinfection of maize plants grown from infected seeds., 1997, 81(2): 211-216.

[17] ALESSANDRA L, LUCA P, ADRIANO M. Differential gene expression in kernels and silks of maize lines with contrasting levels of ear rot resistance afterinfection., 2010, 167(16): 1398-1406.

[18] LESLIE J F, PEARSON C A S, NELSON P E, TOUSSOUN T A.spp. from corn, sorghum, and soybean fields in the central and eastern United States., 1990, 80(4): 343-350.

[19] OREN L, EZRATI S, COHEN D, SHARON A. Early events in the-maize interaction characterized by using a green fluorescent protein-expressing transgenic isolate., 2003, 69(3): 1695-1701.

[20] DASTJERDI R, KARLOVSKY P. Systemic infection of maize, sorghum, rice, and beet seedlings with fumonisin-producing and nonproducingstrains., 2015, 31(4): 334-342.

[21] 陳東亮, 李紀(jì)元, 范正琪, 范妙華. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素及應(yīng)用. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(7): 3317-3320.

CHEN D L, LI J Y, FAN Z Q, FAN M H. Influencing factors of genetic transformation in fungi mediated byand its application., 2010, 38(7): 3317-3320. (in Chinese)

[22] 黃亞麗. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)哈茨木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化及突變體分析[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2008.

HUANG Y L. The optimization ofmediatedtransformation system and analysis of T-DNA insertional mutants[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2008. (in Chinese)

[23] 王梅娟, 李坡, 吳敏, 范永山, 谷守芹, 董金皋. 玉米大斑病菌ATMT突變體庫的構(gòu)建及其分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(12): 2384-2392.

WANG M J, LI P, WU M, FAN Y S, GU S Q, DONG J G. Construction and evaluation of ATMT mutant library of., 2012, 45(12): 2384-2392. (in Chinese)

[24] 許苗苗, 蘇前富, 李麗娜, 渠清, 賈嬌, 曹志艷, 董金皋. 青色熒光蛋白標(biāo)記的禾谷鐮孢轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建. 微生物學(xué)通報(bào), 2018, 45(10): 2191-2199.

XU M M, SU Q F, LI L N, QU Q, JIA J, CAO Z Y, DONG J G. Construction of-labeledtransformants., 2018, 45(10): 2191-2199. (in Chinese)

[25] 張小飛, 李曉, 崔麗娜, 鄒成佳, 彭云良, 楊曉蓉. 輪枝鐮孢菌的綠色熒光蛋白基因標(biāo)記. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 27(6): 2374-2376.

ZHANG X F, LI X, CUI L N, ZOU C J, PENG Y L, YANG X R. Green fluorescent protein gene transformation on., 2014, 27(6): 2374-2376. (in Chinese)

[26] 吳磊. 輪枝鐮孢的熒光標(biāo)記及其在寄主-病原菌互作中的應(yīng)用[D]. 秦皇島: 河北科技師范學(xué)院, 2011.

WU L. Fluorescence labelling ofand its application in study of host-fungus interaction[D]. Qinhuangdao: Hebei Normal University of Science and Technology, 2011. (in Chinese)

[27] 趙培寶, 任愛芝, 胡明江, 張秀省, 陳蕾蕾, 宋曉妍, 石梅. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬康氏木霉遺傳轉(zhuǎn)化及T-DNA插入突變體的篩選. 植物保護(hù), 2010, 36(6): 74-76.

ZHAO P B, REN A Z, HU M J, ZHANG X S, CHEN L L, SONG X Y, SHI M.-mediated transformation ofSMF2 and isolation of the T-DNA insertion mutant., 2010, 36(6): 74-76. (in Chinese)

[28] 劉玲, 張鴻飛, 張嵐, 秦酈, 王德培. 黑曲霉高效敲除體系構(gòu)建及基因的敲除. 食品研究與開發(fā), 2018, 39(22): 124-130.

LIU L, ZHANG H F, ZHANG L, QIN L, WANG D P. Construction of high efficient gene knockout system inand knockout of trehalose-6-phosphate synthase., 2018, 39(22): 124-130. (in Chinese)

[29] 張俊華, 劉燁, 韓雨桐, 潘春清, 王中業(yè), 張淋淋, 崔凱旋. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)稻瘟病菌綠色熒光蛋白()遺傳轉(zhuǎn)化研究. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 45(11): 1-7.

ZHANG J H, LIU Y, HAN Y T, PAN C Q, WANG Z Y, ZHANG L L, CUI K X.genetic transformation ofmediated by., 2014, 45(11): 1-7. (in Chinese)

[30] 李春強(qiáng), 梁慧施, 夏亦薺, 彭明. GFP標(biāo)記的尖孢鐮刀菌西瓜?；颓秩疚鞴线^程觀察. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2011, 32(10): 1935-1939.

LI C Q, LIANG H S, XIA Y J, PENG M. Observation of the infection process of watermelon byf. sp.using the GFP marker., 2011, 32(10): 1935-1939. (in Chinese)

[31] 張俊華, 牟明, 常浩, 李云鵬, 范琳, 鐘慶燕, 潘春清, 鄒徳堂. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化水稻紋枯病菌及其對(duì)病原菌穩(wěn)定性和致病力的影響. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 41(6): 67-74.

ZHANG J H, MU M, CHANG H, LI Y P, FAN L, ZHONG Q Y, PAN C Q, ZOU D T.-mediated transformation ofgene and its effects on stability and pathogenicity for., 2016, 41(6): 67-74.(in Chinese)

[32] 林春花, 劉先寶, 蔡吉苗, 李超萍, 李繼鋒, 黃貴修. 橡膠樹尖孢炭疽菌綠色熒光蛋白()標(biāo)記轉(zhuǎn)化株的獲得. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2009, 30(10): 1495-1500.

LIN C H, LIU X B, CAI J M, LI C P, LI J F, HUANG G X.tagged transformants generated from-mediated insertional mutagenesis., 2009, 30(10): 1495-1500. (in Chinese)

[33] 陳茂功. 玉米彎孢葉斑病菌的熒光標(biāo)記及其對(duì)玉米侵染過程的研究[D]. 秦皇島: 河北科技師范學(xué)院, 2012.

CHEN M G. Fluorescence labeling ofand its infection in maize[D]. Qinhuangdao: Hebei Normal University of Science and Technology, 2012. (in Chinese)

[34] 吳磊, 李洪杰, 王曉鳴, 朱振東, 段燦星, 武小菲. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的輪枝鐮孢和遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子特性分析//中國植物病理學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集, 2010: 117.

WU L, LI H J, WANG X M, ZHU Z D, DUAN C X, WU X F.-mediated transformation ofandand characterization of transformants in//, 2010: 117. (in Chinese)

[35] 蓋曉彤. 玉米莖腐病與穗腐病致病鐮孢菌侵染途徑及其致病力差異研究[D]. 沈陽: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018.

GAI X T. Studies on the infection pathway and pathogenic difference offrom stalk rot and ear rot on maize[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2018. (in Chinese)

[36] 張嬌, 谷守芹, 李青為, 韓建民, 董金皋. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米大斑病菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 33(4): 85-88, 108.

ZHANG J, GU S Q, LI Q W, HAN J M, DONG J G. Optimization of factors affecting genetic transformation ofvia., 2010, 33(4): 85-88, 108. (in Chinese)

[37] 倪璇, 姜雪, 李雅乾, 陳捷. 玉米彎孢葉斑病菌ATMT突變株構(gòu)建及致病力分析. 中國生物工程雜志, 2016, 36(1): 23-28.

NI X, JIANG X, LI Y Q, CHEN J. Construction and pathogenicity analysis of ATMT mutant of., 2016, 36(1): 23-28. (in Chinese)

Construction and Evaluation of ATMT Mutant Library of

SUN Hua, MA HongXia, DING MengJun, LI Po, SHI Jie, LIU ShuSen

(Plant Protection Institute, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture/IPM Centre of Hebei Province, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to establish a highly efficient ATMT mutagenesis system of, and to construct ATMT mutant library in which mutant contains green fluorescent protein (GFP). And then this library was used for screening and analysis, which can lay a foundation for studying the infection pathway and molecular pathogenesis ofon maize ear. 【Method】The inhibitory concentration of cefotaxime sodium (Cefo) and ampicillin sodium (Amp) againstAGL-1 and the sensitive concentration of hygromycin B againstwere screened for ATMT mutagenesis system. A shuttle plasmid containingand hygromycin phosphotransferase () genes was used as a vector to construct the ATMT mutants library of. The T-DNA insertion and stability of transformant were detected and analyzed through hygromycin B resistance, PCR identification of-specific primers, and fluorescence microscopy. Nine transformants were randomly selected and the sporulation number, conidial germination rate, and pathogenicity were measured. 【Result】When the concentration of Cefo/Amp was 150/150 μg·mL-1, the growth of AGL-1 was inhibited, and when the concentration of hygromycin B was 150 μg·mL-1, the growth ofwas completely incapacitated. Using the optimized ATMT, a total of 2 465-labeled transformants were obtained, these transformants could still grow normally on PDA medium containing hygromycin B after cultured 5 generations on hygromycin-free PDA medium, which indicated thathad been integrated into wild-type (WT) genome ofand the transformants were stable in their characteristics of genetics. The PCR detection results amplified with-specific primers showed that the homology of transformants with(accession number: LC420351.1) in NCBI was 99.26%, and the hyphae and conidia of transformants showed green fluorescence under the fluorescence microscope, while no fluorescence was observed in WT, indicating thathad been integrated into the WT genome and successfully expressed. Compared with WT strain, the sporulation number of transformant 54 increased significantly, about 1.9 times of that of WT strain, and the conidial germination rate of transformant 24 decreased obviously in the same time. The pathogenicity of transformant 13 was enhanced, the disease grade reached 9, the pathogenicity of transformant 33 and 16 was reduced to grade 3, and the pathogenicity of transformant 4 was the weakest, the disease grade was 1. There was no significant change in biological characters of partial transformants.【Conclusion】ATMT mutant library withofwas constructed, and the mutants with changed sporulation number, conidia germination rate and pathogenicity were obtained through primarily screening. It will lay a foundation for further study on the infection pathway and pathogenic molecular mechanisms ofon maize ear in the future.

maize;; ATMT; mutant library; green fluorescent protein; transformant

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.08.008

2018-11-26；

2019-01-15

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31601590）

孫華，E-mail：1550416593@qq.com。 通信作者 李坡，Tel：0312-5915682；E-mail：lipo-0524@163.com。通信作者石潔，Tel：0312-5915682；E-mail：shij99@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）