閆偉偉 秦少偉 趙利峰,2*

（1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300）

（2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點實驗室—國家省部共建培育基地，新疆 阿拉爾843300）

流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本（abortive transcript, AT）是一類特殊的非編碼RNA，是指在基因轉(zhuǎn)錄的起始階段由RNA 聚合酶重復(fù)合成并釋放的許多短片段初生RNA，該現(xiàn)象被稱為流產(chǎn)性起始［1-3］。自被發(fā)現(xiàn)以來，流產(chǎn)性起始的發(fā)生機(jī)制以及流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)作用一直都是一個未解之謎。為此國內(nèi)外科研人員也在不停地對它們進(jìn)行著探索。近年來隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，它們的神秘面紗也在被逐漸揭開。

1 流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本和流產(chǎn)性起始的發(fā)現(xiàn)

1976 年Johnston 等在冷泉港實驗室發(fā)現(xiàn)，RNA聚合酶的延伸反應(yīng)在缺少兩種NTP 的轉(zhuǎn)錄體系中被阻止，出乎意料的是，這些新生RNA 被快速釋放出來。然而他們很快又有了新的發(fā)現(xiàn)：當(dāng)四種NTP均存在的情況下RNA 聚合酶開始轉(zhuǎn)錄后仍然產(chǎn)生長度不等的流產(chǎn)性RNA，長度范圍為2～8 nt［4］。1980 年，Carpousis 等再一次在體外實驗中檢測到了2～6 nt 長度不等的流產(chǎn)性RNA，并將其命名為流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本（abortive transcript,AT）。同時發(fā)現(xiàn)在所有長度不等的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本中，2 nt 長的占比例最大，約占總量的50%［5］。后來其他研究者在體外轉(zhuǎn)錄實驗中也得到了類似的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的長度一般在2～10 nt 之間，最長可達(dá)19 nt［6］。流產(chǎn)性起始的重復(fù)過程被稱為流產(chǎn)性循環(huán)，通常要經(jīng)過10～100 個循環(huán)以后，RNA 聚合酶才能從啟動子上逃逸出來，開始正常轉(zhuǎn)錄。體外實驗發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)性起始普遍發(fā)生在細(xì)菌、古菌、真核生物和噬菌體等基因轉(zhuǎn)錄起始階段［6］。2009 年Goldman 等首次在大腸桿菌（Escherichia coli）體內(nèi)證明了流產(chǎn)性起始現(xiàn)象的存在［7］。

2 流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本和流產(chǎn)性起始的發(fā)生機(jī)制及影響因素

流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本和流產(chǎn)性起始一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就立刻引起了世界各地科學(xué)家的興趣。自它們被發(fā)現(xiàn)以來的40 余年時間里，流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本與流產(chǎn)性起始的研究從未間斷，科學(xué)家們對流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本和流產(chǎn)性起始的發(fā)生機(jī)制研究也有了許多成果。

研究發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的發(fā)生和RNA 聚合酶中σ 亞基的結(jié)構(gòu)有關(guān)。σ 亞基中連接其2 個功能域（σ3 和σ4）之間的鏈環(huán)靠近RNA 聚合酶的活性位點，且位于全酶釋放RNA 產(chǎn)物的通道內(nèi)，可能具有阻止RNA產(chǎn)物延伸的作用。該鏈環(huán)與初生RNA之間對該通道的占據(jù)存在競爭作用，當(dāng)鏈環(huán)贏得競爭時，初生RNA 則以流產(chǎn)性產(chǎn)物—流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的形式釋放出來；當(dāng)RNA 分子鏈成功延伸超過12 nt 時，新生成的RNA 鏈則可將該鏈環(huán)置換出來，這時流產(chǎn)性起始停止［8］。σ 亞基的1.2 區(qū)能夠與轉(zhuǎn)錄起始位點-4 位發(fā)生作用，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始位點下游DNA 解旋，但該過程中σ 亞基1.2 區(qū)需要β 亞基lobe 區(qū)的協(xié)助，流產(chǎn)性起始發(fā)生的原因可能在一定程度上與σ 亞基1. 2區(qū)和β 亞基lobe 區(qū)不能正常打開下游DNA 雙鏈有關(guān)［9］。另外，σ 亞基的3. 2 區(qū)在RNA 聚合酶中的位置、His-β1237的突變和β 亞基S531的突變均能改變流產(chǎn)性起始發(fā)生的水平［10-13］。

從流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄起始到全長RNA 合成的轉(zhuǎn)換過程被稱作啟動子逃逸（promoter escape）［6］。流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的原因也與啟動子逃逸的過程密切相關(guān)。流產(chǎn)性起始產(chǎn)生的蜷縮模型認(rèn)為（見圖1），由圖可以看出：在轉(zhuǎn)錄的起始階段，RNA 聚合酶固定在啟動子上并不移動，而是將聚合酶下游的DNA 募集到聚合酶里來，DNA 在聚合酶里以單鏈泡形式堆積，在此過程中形成具有DNA 解旋應(yīng)力和DNA 壓縮應(yīng)力的中間體，其中累積的應(yīng)力用于破壞RNA 聚合酶與啟動子DNA之間以及RNA聚合酶與起始因子之間的相互作用。當(dāng)RNA 聚合酶與啟動子DNA 以及起始因子的作用力被破壞后，RNA 聚合酶才從啟動子上逃逸進(jìn)入轉(zhuǎn)錄的延伸階段［14］，并且在轉(zhuǎn)錄的起始階段，當(dāng)新合成的轉(zhuǎn)錄本達(dá)6 nt和7 nt時，RNA 聚合酶有一個短暫的停留，這導(dǎo)致7 nt 和6 nt 長的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本含量相對也較高［14,15］。研究發(fā)現(xiàn)，啟動子序列與其保守序列越接近越不容易逃逸，所產(chǎn)生的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本就越多［16］。同時啟動子序列還影響流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的長度，15 nt 流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本就是在啟動子突變的T5 噬菌體N25基因轉(zhuǎn)錄實驗中發(fā)現(xiàn)的［6］。

圖1 流產(chǎn)性起始的蜷縮模型

此外，流產(chǎn)性起始還受到起始轉(zhuǎn)錄序列、轉(zhuǎn)錄延伸因子GRE 等的影響。改變轉(zhuǎn)錄起始序列（如將A變成C，將G變成T）不影響轉(zhuǎn)錄起始階段轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成和總體起始轉(zhuǎn)錄的水平，但可以使全長mRNA的合成降低10～25 倍［17,18］。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄延伸因子GRE 能降低流產(chǎn)性起始的發(fā)生。當(dāng)新生轉(zhuǎn)錄本3′端的-OH 不與RNA 聚合酶的催化位點接觸時，RNA 聚合酶停止轉(zhuǎn)錄。此時GRE能與停止轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶相互作用，誘導(dǎo)聚合酶對新生轉(zhuǎn)錄本的切割反應(yīng)，重新激活RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性［19,20］。通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIB 則能促進(jìn)流產(chǎn)性起始的發(fā)生，在真核生物和古菌基因的轉(zhuǎn)錄起始階段，TFIIB 能通過促進(jìn)RNA 聚合酶的招募，從而刺激流產(chǎn)性起始的發(fā)生［21］。

3 流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本和流產(chǎn)性起始的生物學(xué)作用

眾所周知，生物體對自身基因表達(dá)以及物質(zhì)和能量代謝有著嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制。因此，流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本和流產(chǎn)性起始絕非是生命體無意義的行為。雖然目前關(guān)于流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本生物學(xué)作用和流產(chǎn)性起始的生物學(xué)意義知道的很少，但一些研究工作表明流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本是具有生物學(xué)作用的。在它們被發(fā)現(xiàn)以來的40 多年里，研究人員對流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)作用進(jìn)行了深入探索，也取得了許多有意義的成果。

流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本有可能以引物的形式參與RNA 和DNA 的合成。通常，所有細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄起始都是利用單核苷酸作為起始逐一合成一條長鏈RNA。但是體外關(guān)于引物依賴的轉(zhuǎn)錄起始研究表明，無論是真核生物還是原核生物的RNA 聚合酶都能利用2～8 nt長度不等的寡聚核苷酸來引發(fā)轉(zhuǎn)錄的起始［22-30］。2011 年，Goldman 等發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌體內(nèi)的RNA 聚合酶利用2～4 nt人工合成的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本引發(fā)轉(zhuǎn)錄起始，同時發(fā)現(xiàn)能作為引物的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本在序列和長度上有著極其嚴(yán)苛的要求，只有長度在2 nt 到4 nt之間，序列與DNA 模板鏈互補(bǔ)，且5′端在-3到+1之間，3′端在+1 到+3 之間的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本才能夠作為引物促進(jìn)轉(zhuǎn)錄［31,32］。還有研究發(fā)現(xiàn)，原核生物T7 RNA 聚合酶通過合成引物啟動DNA 的復(fù)制。φ1·1B 啟動子的最短引物長度是8 nt，因此8 nt 的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本可作為DNA 復(fù)制的引物。早期DNA 復(fù)制系統(tǒng)似乎利用了DNA 依賴性RNA 聚合酶的流產(chǎn)性循環(huán)，這種循環(huán)在“DNA World”出現(xiàn)前就已存在，原始RNA 聚合酶的進(jìn)化可以引發(fā)DNA 的復(fù)制。因此，流產(chǎn)性循環(huán)可能在“DNA World”的進(jìn)化中發(fā)揮著重要作用［33］。

流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本有轉(zhuǎn)錄抑制的作用。體外轉(zhuǎn)錄實驗表明，流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的長度主要在2～10 nt，最長到19 nt，且主要集中在2 nt、4 nt、6 nt 和7 nt［7,14］。研究發(fā)現(xiàn)如果通過抑制短鏈核酸酶的作用來增加細(xì)胞內(nèi)長度小于或等于4 nt短寡核苷酸的濃度，一些基因的表達(dá)水平增加，但另一些基因的表達(dá)水平則降低［31］。根據(jù)Goldman 等總結(jié)的規(guī)律，2 nt 和3 nt 的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本可以促進(jìn)自身基因的轉(zhuǎn)錄，那么其余不能作為引物的短寡核苷酸則可能具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，而大于或等于4 nt的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本并不符合上述作為引物的要求，所以也可能具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。2016 年，Qin SW 等利用體外轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)合實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）技術(shù)，檢測了3 個大腸桿菌基因meta（homoserine Osuccinyltransferase）、ompa（outer membrane porin A）和reca（recombinase A）的4 nt 和6 nt 流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本對自身基因和其它基因轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本對自身和其它基因的轉(zhuǎn)錄均具有抑制作用，且最大抑制率可達(dá)7.5 倍（圖2），認(rèn)為流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本可能通過影響轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物的穩(wěn)定性從而影響轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行［34］。

流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本可能還有其他的生物學(xué)作用。研究還發(fā)現(xiàn)，噬菌體T710φ 基因產(chǎn)生的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本富含G，恰好能與其終止子上兩個5 nt和6 nt長、富含C 的延伸序列相互作用，阻止發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，從而抑制轉(zhuǎn)錄終止［35］。含有短RNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)揭示了三種結(jié)構(gòu)狀態(tài)：一種是具有2 nt和3 nt 的RNA，其中只有RNA 的3'末端是可檢測的；第二種狀態(tài)是具有4 nt 和5 nt 的RNA，此時RNA-DNA雜合體具有嚴(yán)重扭曲的構(gòu)象；還有一種具有6 nt或更長RNA 的第三種狀態(tài)，這種狀態(tài)基本上與穩(wěn)定的延伸復(fù)合物相同。從第一狀態(tài)到第二狀態(tài)的轉(zhuǎn)變與顯著降低的流產(chǎn)起始頻率有關(guān)。從第二狀態(tài)到第三狀態(tài)的轉(zhuǎn)變與部分“氣泡坍塌”（bubble collapse）和促進(jìn)啟動子逃逸有關(guān)。學(xué)者推測在這個過程中流產(chǎn)性起始可能起著啟動子控制的檢驗點（checkpoint）和校正點（calibration point）作用［36］。

圖2 被不同流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本干擾后基因表達(dá)水平的變化

4 展望和小結(jié)

盡管流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本和流產(chǎn)性起始的發(fā)現(xiàn)至今已有40 余年，但依然存在許多未知的謎團(tuán)。目前對于流產(chǎn)性起始發(fā)生機(jī)制的研究相對較多，但對于流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能研究仍然處于起步階段。制約流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本研究的瓶頸主要是自然產(chǎn)生的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本長度一般不超過10 nt，用qRT-PCR 或常規(guī)探針方法無法對其進(jìn)行定量檢測。目前檢測較短流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的方法有兩種。其中一種是基于特定轉(zhuǎn)錄模板和P32標(biāo)記NTP 的體外轉(zhuǎn)錄實驗，這種方法只能在體外通過放射自顯影技術(shù)檢測流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的長度和含量，并不能對流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的序列進(jìn)行鑒別，也無法對機(jī)體內(nèi)自然產(chǎn)生的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定性和定量分析。另一種則是利用鎖核酸探針對流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測。鎖核酸（locked nucleic acid,LNA）是一種類寡核苷酸衍生物，其結(jié)構(gòu)中的β-D-呋喃核糖的2'-O、4'-C 位通過縮水作用形成剛性的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能降低單體中核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增強(qiáng)局部磷酸骨架穩(wěn)定性。研究表明在探針的核酸序列中每增加一個鎖核酸單體能夠使寡核苷酸鏈的解鏈溫度提高2～8℃，從而提高其與目標(biāo)序列的結(jié)合能力，且比常規(guī)的寡核苷酸具有更高的專一性［37］。Goldman 等正是用鎖核酸探針實現(xiàn)了對啟動子突變的T5噬菌體N25 基因產(chǎn)生的11 nt長流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的直接檢測［7］，該方法較第一種研究方法的優(yōu)勢是可以對特定序列的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行體外檢測，但仍然無法對生物體內(nèi)自然產(chǎn)生且10 nt以下的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量檢測。目前，檢測技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步很快，單分子檢測、熒光原位雜交等新技術(shù)正越來越多地得到應(yīng)用。如果能對機(jī)體內(nèi)的流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本實現(xiàn)定性和定量檢測，則可以在機(jī)體內(nèi)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)人為干擾某一基因流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的含量，從而確定流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能。同時，生物體內(nèi)流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本比全長轉(zhuǎn)錄本高幾十倍甚至上百倍的含量還使其具有成為腫瘤或其他疾病標(biāo)志物的潛在可能，在未來臨床分子診斷和檢測中有著潛在的應(yīng)用價值，一旦在檢測技術(shù)上取得突破，流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本將可能成為一種新型生物標(biāo)志物為人類健康做出巨大貢獻(xiàn)。

總之，流產(chǎn)性起始的發(fā)生由RNA 聚合酶的結(jié)構(gòu)和RNA 轉(zhuǎn)錄起始的模式所決定，是RNA 轉(zhuǎn)錄中必不可少的一種生物學(xué)現(xiàn)象，普遍發(fā)生在一切以RNA 聚合酶為特征的生物的每一次轉(zhuǎn)錄中。目前，對流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄發(fā)生的機(jī)制已基本了解，對其生物學(xué)作用知道的仍然不多，但其存在的廣泛性暗示其可能有重要的生物學(xué)作用，最新的研究也表明流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本在基因的轉(zhuǎn)錄過程中具有重要的調(diào)控作用。相信隨著對體內(nèi)10 nt 以下的寡核苷酸定量檢測技術(shù)的發(fā)展，一定能有效解決目前流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的體內(nèi)定量檢測的問題，也終將對流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能作出闡釋。