余美林， 顧云霞， 張靜， 胡衍輝， 劉琴

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科(江西南昌 330006)

缺血預(yù)處理最早在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)作用[1]，不斷增加的研究發(fā)現(xiàn)，吸入麻醉藥預(yù)處理對(duì)心肌具有雙重作用[2]。七氟醚因具有誘導(dǎo)迅速及蘇醒快而完全，血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于臨床麻醉。已有研究表明七氟醚預(yù)處理通過(guò)線粒體ATP敏感性鉀通道，參與心肌缺血再灌注時(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]，氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷中起著重要作用。Lee等[4]研究證實(shí)PKC信號(hào)通路與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，但是，目前在心肌方面的研究仍少見(jiàn)報(bào)道。2016年1月至2017年12月，本研究通過(guò)探討七氟醚預(yù)處理通過(guò)PKC信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的氧化應(yīng)激影響，為明確其機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞的選擇與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，將細(xì)胞隨機(jī)分成5組(n=6):空白對(duì)照組(Sham組)，缺氧/復(fù)氧組(H/R組)，七氟醚預(yù)處理延遲性保護(hù)組(SWOP組)，PKC信號(hào)通路抑制劑組(CHE組)，CHE+SWOP組。

1.2 處理方法 Sham組細(xì)胞不進(jìn)行特殊處理；H/R組細(xì)胞缺氧2 h后復(fù)氧1 h；SWOP組，先用2.5%七氟醚預(yù)處理20 min而后進(jìn)行與H/R組相同的缺氧復(fù)氧，間隔24 h建立H/R模型；CHE組，在培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度為10 μmol/L白屈菜赤堿培養(yǎng)1 h，間隔24 h后建立缺氧復(fù)氧模型；CHE+SWOP組，給予2.5%七氟醚預(yù)處理1 h前15 min在培養(yǎng)基內(nèi)加入白屈菜赤堿，終濃度為10 μmol/L，間隔24 h后建立缺氧復(fù)氧模型。缺氧復(fù)氧方法如下：將細(xì)胞置于95%N2、5% CO2的培養(yǎng)箱中缺氧2 h而后放回95%空氣、5%CO2的培養(yǎng)基中復(fù)氧1 h；七氟醚處理方法如下：將細(xì)胞置于無(wú)菌密閉容器中, 連接麻醉機(jī)呼吸環(huán)路，開(kāi)啟揮發(fā)罐調(diào)節(jié)七氟醚濃度為2.5%，持續(xù)20 min后在95%空氣、5% CO2的培養(yǎng)基中洗脫10 min。

1.3 心肌細(xì)胞存活率測(cè)定 取處理后的心肌細(xì)胞，0.25%胰酶消化后得到單細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104·mL-1，種入96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。處理結(jié)束后加入MTT(5 g/L，溶于PBS)，每孔10 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔內(nèi)MTT溶液，每孔加入200 μL DMSO終止反應(yīng)，室溫下，在搖床上輕微震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定(波長(zhǎng)為570 nm)各孔吸光度A值。空白對(duì)照孔不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基，其他實(shí)驗(yàn)步驟同上。實(shí)驗(yàn)設(shè)10個(gè)復(fù)孔，取平均值。細(xì)胞存活率按以下公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=各實(shí)驗(yàn)組吸光(A)度/空白對(duì)照組(A)吸光度×100%。

1.4 心肌細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量測(cè)定 取處理后的心肌細(xì)胞，利用試劑盒，采用二硫二硝基苯甲酸法檢測(cè)GSH含量，硫代巴比妥酸顯色法檢測(cè)MDA含量。

1.5 心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)含量測(cè)定 取處理后的心肌細(xì)胞，利用ROS熒光探針二氫乙啶(DHE)測(cè)定各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的相對(duì)水平。DHE可穿透心肌細(xì)胞膜進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)，被胞內(nèi)ROS氧化形成氧化乙啶，氧化乙啶可摻入細(xì)胞內(nèi)染色體DNA，最終產(chǎn)生紅色熒光。缺氧復(fù)氧末，于熒光顯微鏡下觀察并拍攝心肌細(xì)胞紅色發(fā)射圖像(激發(fā)波長(zhǎng)480～535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590～610 nm)，紅色熒光強(qiáng)度與ROS水平呈正相關(guān)。

1.6 抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Nrf2及凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的測(cè)定 取處理后的心肌細(xì)胞，于缺氧復(fù)氧末，在心肌細(xì)胞中加入裂解液和磷酸酶抑制劑在超聲下4℃勻漿裂解提取蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白樣品的蛋白含量。取蛋白樣品，電泳結(jié)束后牛奶封閉，加入一抗后孵育過(guò)夜，加二抗。行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，測(cè)定蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 5組缺氧復(fù)氧末心肌細(xì)胞存活率比較 與Sham組相比，H/R組H9c2心肌細(xì)胞的存活率降低(P<0.05)；與H/R組比較，SWOP組心肌細(xì)胞的存活率升高，CHE組的心肌細(xì)胞存活率降低(P<0.05)；與SWOP組相比較，CHE+SWOP組心肌細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 5組缺氧復(fù)氧末心肌細(xì)胞內(nèi)GSH及MDA含量比較 與Sham組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞的GSH降低，MDA均升高(P<0.05)；與H/R組比較，SWOP組心肌細(xì)胞GSH升高，MDA降低(P<0.05)；與SWOP組相比較，CHE+SWOP組心肌細(xì)胞GSH降低，MDA升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別n細(xì)胞存活率Sham組496.5±1.9H/R組455.3±2.6?SWOP組478.7±2.2△CHE組443.8±4.1△CHE+SWOP 組463.3±4.2▲

*與Sham組比較P<0.05；△與H/R組比較P<0.05；▲與SWOP組比較P<0.05

組別GSHMDASham組129.0±2.89.5±1.9H/R組84.2±2.6?34.7±2.8?SWOP組111.5±9.2△19.3±2.2△CHE組74.3±3.5△41.2±2.6△CHE+SWOP 組95.7±4.6▲24.5±1.9▲

*與Sham組比較P<0.05；△與H/R組比較P<0.05；▲與SWOP組比較P<0.05

2.3 缺氧復(fù)氧末各組心肌細(xì)胞ROS含量 與Sham組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞的ROS含量升高(P<0.05)；與H/R組比較，SWOP組心肌細(xì)胞的ROS含量降低，CHE組的ROS含量升高(P<0.05)；與SWOP組相比較，CHE+SWOP組心肌細(xì)胞的ROS含量升高(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

組別nROSSham組492.00±2.58H/R組4228.75±16.52?SWOP組4141.25±6.50?△CHE組4255.00±19.15?▲CHE+SWOP 組4186.00±7.53△▲

*與Sham組比較P<0.05；△與H/R組比較P<0.05；▲與SWOP組比較P<0.05

*與Sham組比較P<0.05；△與H/R組比較P<0.05；▲與SWOP組比較P<0.05

圖1缺氧復(fù)氧末各組心肌細(xì)胞ROS含量

2.4 5組缺氧復(fù)氧末心肌細(xì)胞內(nèi)Nrf2和Caspase-3含量比較 與Sham組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與H/R組比較，SWOP組Nrf2蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，CHE組的Nrf2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，與SWOP組比較，CHE+SWOP的Nrf2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與Sham組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)；與H/R組比較，SWOP組Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，CHE組Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P<0.05)；與SWOP組相比，CHE+SWOP組的Caspase-3蛋白表上調(diào)(P<0.05)。表4、圖2～3。

組別Nrf2Caspase-3Sham組1.03±0.171.00±0H/R組3.20±0.49?3.08±0.10?SWOP組5.20±0.41?△1.93±0.10?△CHE組2.20±0.16?▲3.40±0.08?▲CHE+SWOP 組4.01±0.25?△▲2.60±0.32?△▲

*與Sham組比較P<0.05；△與H/R組比較P<0.05；▲與SWOP組比較P<0.05

3 討論

體外循環(huán)技術(shù)不可避免出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷，缺血心肌在恢復(fù)血流灌注的過(guò)程中，其功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步加重，導(dǎo)致機(jī)體心功能惡化，血流動(dòng)力學(xué)紊亂，心肌梗死面積增加，因此，如何有效地減輕心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，仍為近年來(lái)研究重點(diǎn)。本研究參照文獻(xiàn)[5-6]將H9c2心肌細(xì)胞置于95%N2、5% CO2的培養(yǎng)箱中缺氧2 h而后放回37℃、5%CO2的培養(yǎng)基中復(fù)氧1 h的方法，建立心肌缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明，與Sham組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞存活率顯著升高，提示模型制備成功。

*與Sham組比較P<0.05；△與H/R組比較P<0.05；▲與SWOP組比較P<0.05

圖2 5組缺氧復(fù)氧末心肌細(xì)胞內(nèi)Nrf2含量的表達(dá)

*與Sham組比較P<0.05；△與H/R組比較P<0.05；▲與SWOP組比較P<0.05

圖3 5組缺氧復(fù)氧末心肌細(xì)胞內(nèi)Caspase3含量的表達(dá)

參照文獻(xiàn)[5,7]的方法，將細(xì)胞置于密閉容器內(nèi)通入2.5%七氟醚維持1 h后間隔24 h再建立H/R模型，結(jié)果表明，與H/R組比較，SWOP組細(xì)胞存活率明顯升高，證明了2.5%七氟醚預(yù)處理對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。

研究表明，氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制[8]，心肌再灌注損傷后，體內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)失衡，功能障礙的線粒體產(chǎn)生大量氧自由基和超氧陰離子，進(jìn)而引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。其中MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終末代謝產(chǎn)物，其含量反映細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度。心肌缺血再灌注產(chǎn)生ROS，ROS能與脂質(zhì)反應(yīng)生成H2O2與烷氧自由基，使脂質(zhì)氧化，而高濃度的ROS可通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡直至死亡。而Caspase-3作為Caspase家族的核心效應(yīng)因子，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者。另外，在機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)中，GSH是一種抗氧化劑，研究表明，GSH能釋放電子給高活性的活性氧簇進(jìn)而清除活性氧簇，防止蛋白質(zhì)等大分子被活性氧簇氧化，進(jìn)而抗氧化應(yīng)激[9]。Nrf2作為一種中樞轉(zhuǎn)錄因子，同樣在機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果表明，與H/R組相比，SWOP組心肌細(xì)胞MDA含量降低，ROS水平降低，Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，抗氧化指標(biāo)GSH，Nrf2水平增加，提示七氟醚預(yù)處理后可通過(guò)抑制心肌脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化能力，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，從而改善心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷時(shí)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

PKC信號(hào)通路是心肌缺氧復(fù)氧損傷的重要保護(hù)機(jī)制之一[10]。PKC能夠通過(guò)磷酸化Nrf2激活抗氧化反應(yīng)元件，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。也有研究表明，調(diào)節(jié)PKC活性可介導(dǎo)心肌的保護(hù)作用[12]；Lee等[4]表明PKC信號(hào)通路參與七氟醚預(yù)處理調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，減少大鼠腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮保護(hù)作用。本研究參照文獻(xiàn)[13]的方法，采用終濃度為10 μmol/L的白屈菜赤堿干預(yù)來(lái)抑制PKC信號(hào)通路，結(jié)果表明，與H/R組相比，CHE組心肌細(xì)胞存活率降低，心肌細(xì)胞GSH含量降低，MDA含量增加，ROS含量增加，Nrf2含量降低，Caspase-3含量增加，證明了PKC信號(hào)通路是參與了缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激保護(hù)作用，為了進(jìn)一步驗(yàn)證七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用是否也與PKC信號(hào)通路有關(guān)，本研究在給予2.5%七氟醚預(yù)處理1 h前15 min在培養(yǎng)基內(nèi)加入白屈菜赤堿，終濃度為10 μmol/L，間隔24 h后建立缺氧復(fù)氧模型。結(jié)果表明，給予PKC抑制劑后，相比于SWOP組，其心肌細(xì)胞存活率下降，GSH含量下降，ROS含量增加，Nrf2降低，凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)增加。其心肌保護(hù)效應(yīng)降低，提示PKC信號(hào)通路的激活，參與了七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用。其機(jī)制可能為PKC廣泛的下游作用有關(guān)，KATP是其主要的作用位點(diǎn)[14-15]，活化的PKC直接或間接開(kāi)放KATP通道，擴(kuò)大信號(hào)分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而KATP的激活在七氟醚預(yù)處理或者后處理的機(jī)制中均起著重要的作用，七氟醚通過(guò)刺激KATP的開(kāi)放抑制活性氧爆發(fā)，影響下游的細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的表達(dá)。

綜上所述，七氟醚預(yù)處理可減輕心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，PKC信號(hào)通路可能參與了心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧時(shí)抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。