王毅鈞， 李瑞平， 李力波， 陳實， 張玉奇， 李小悅△

1東莞市人民醫(yī)院胃腸外科(廣東東莞 523059)； 2中山大學附屬第六醫(yī)院胃腸外科(廣東廣州 510655)； 3桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院急診科(廣西桂林 541000)

結直腸癌中不僅包含惡性腫瘤細胞，還包含許多其他非惡性細胞類型如成纖維細胞、內皮細胞和各種浸潤免疫細胞[1]。此外，對于目前結直腸癌的TNM分型方法并未能充分反映結直腸癌的腫瘤生物學行為和患者預后[2]。因此，確定生物標志物以預測腫瘤發(fā)展和進展具有重要意義。目前多項研究[3-4]表明，免疫細胞浸潤可以顯著影響病程的進展和預后。其中腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)通常構成浸潤免疫的重要組成部分細胞，TAMs是參與腫瘤微環(huán)境和炎癥的重要組成部分，其起源于循環(huán)單核細胞，并通過招募到腫瘤組織中。同時，不同的微環(huán)境可能導致兩種不同的極化TAMs：經典激活型M1表型和可選激活的M2表型[5]。M1巨噬細胞被認為是促進炎癥反應和抗腫瘤活性。M2巨噬細胞主要是參與抗炎反應，組織重塑，血管生成和腫瘤細胞活化。雖然TAMs在腫瘤微環(huán)境中的作用及其預后價值已經被表明具有明確的相關性，但在不同的腫瘤中對預后具有不同的影響。如在乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、胃癌和頭頸部腫瘤中[8]，TAMs密度高的患者預后不良。但是，既往的研究表明，癌組織中TAMs密度高的結直腸癌患者具有更好的預后[9]。因此目前對于TAMs在結直腸癌組織中與臨床特征的關系及對預后的影響仍然具有爭議[10-13]，本研究旨在進一步明確TAMs與結直腸癌患者臨床特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2016年3月于我院行手術治療的結直腸癌患者的腫瘤組織和癌旁組織標本共120例，納入標準：(1)經病理確診為結直腸癌；(2)行手術治療的患者；(3)病歷資料完整的患者；排除不能獲得完整隨訪的患者；本研究經醫(yī)院倫理委員會審核并批準。120例結直腸癌患者中均選擇其癌組織作為觀察組，選擇癌旁組織作為對照。納入的120例患者中，男74例，女46例，年齡33～87歲，平均(56.4±12.8)歲。其中腫瘤位于結腸共65例，位于直腸55例，TNM分期為Ⅰ～Ⅳ期。

1.2 病理學檢查 所有手術組織均由本院病理科處理，將來自甲醛溶液固定標本的石蠟塊切成5 μm并用于免疫組織化學檢測，采用蘇木素和伊紅染色切片對腫瘤進行分級。

免疫組化方法：將5 μm厚的組織切片在56℃下烘烤1 h，然后在二甲苯中脫蠟兩次，每次10 min，并在不同濃度乙醇中再水化。然后將切片在蒸餾水中沖洗并在10%蔗糖中浸泡過夜。通過在檸檬酸鹽緩沖液中煮沸30 min來進行抗原提取。冷卻15 min后，將載玻片在pH 7.4的PBS中漂洗，在1.2%過氧化氫的甲醇溶液中溫育30 min，并在pH 7.4的PBS中沖洗15 min。然后用正常山羊血清(C0256，碧云天)將切片封閉30 min。在4℃下與兔單克隆抗人CD68抗體(#76437，CST)孵育過夜后，將載玻片在pH 7.4的PBS中洗滌3次，每次5 min，并與生物素標記的二抗于37℃條件下孵育1 h,在pH 7.4的PBS中沖洗，然后在pH 7.5的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液中沖洗10 min。通過使用在15 mL 0.05 Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫反應2～10 min，并對切片用蘇木精復染，放置后以進行光學顯微鏡檢查。

1.3 CD68+TAMs的評估 每張切片中選擇5個最多CD68+TAMs浸潤最多的視野，計算在高倍鏡視野下(×200)腫瘤組織及CD68+TAMs數(shù)目。具體圖像計數(shù)采用Image J軟件進行，取5個視野中的平均CD68+TAMs數(shù)目；在120例腫瘤組織中，取中位數(shù)為每個視野>60個CD68+TAMs為高表達，≤60個CD68+TAMs為低表達。

1.4 患者資料的收集 記錄所有患者的年齡、性別、腫瘤位置、TNM分期，區(qū)域淋巴和遠處結轉移的情況，記錄患者病理檢查的分化程度和組織學分級，所有患者在術后1、3、6個月返院復診，6個月后每半年返院復診，記錄患者隨訪的生存期和無病生存期。

2 結果

2.1 CD68+TAMs在結直腸癌組織和癌旁組織的浸潤情況 120例結直腸癌患者中的平均腫瘤組織CD68+TAMs浸潤數(shù)為(64.3±26.8)個/高倍鏡，而癌旁組織平均腫瘤組織CD68+TAMs浸潤數(shù)為(21.5±11.7)個/高倍鏡，腫瘤組織CD68+TAMs浸潤細胞數(shù)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.033,P<0.001)。

2.2 CD68+TAMs在結直腸癌組織中的表達與臨床特征的關系 結直腸癌組織中CD68+TAMs細胞密度與臨床特征的關系中，其TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、區(qū)域淋巴結沒有轉移、沒有遠處轉移和病理分級為Ⅰ～Ⅱ患者的CD68+TAMs高表達比例顯著高于CD68+TAMs低表達的比例(P<0.05)，而CD68+TAMs的表達在不同性別比例、年齡、腫瘤位置、浸潤深度、分化程度中的比例對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1和表1。

A：CD68+TAMs在結直腸癌組織的浸潤情況；B：CD68+TAMs在結直腸癌組織的浸潤情況(低表達)；C：CD68+TAMs在結直腸癌組織的浸潤情況(高表達)

圖1 CD68+TAMs在結直腸癌組織和癌旁組織的浸潤情況(×200)

2.3 CD68+TAMs在結直腸癌組織中的表達與預后的關系 120例患者隨訪時間為3～46個月，中位隨訪時間為36個月，其中62例癌組織CD68+TAMs高表達的患者中，CD68+TAMs高表達患者的總體生存率(OS)為79.0%，CD68+TAMs低表達的OS為60.3%，Kaplan-Meier生存曲線結果顯示CD68+TAMs高表達患者的OS和無病生存率(DFS)顯著優(yōu)于CD68+TAMs低表達的患者，差異有統(tǒng)計學意義(OS：HR=0.429，95%CI：0.221～0.834，P=0.013； DFS：HR=0.424，95%CI：0.230～0.782，P=0.006)。見圖2。

3 討論

在腫瘤組織中，除了與腫瘤發(fā)生和進展有關的遺傳和(或)獲得性遺傳因素之外，微環(huán)境對于腫瘤細胞行為，侵襲性和轉移也具有重要意義[12]。微環(huán)境因素包括腫瘤浸潤免疫細胞，包括TAMs，其一般構成腫瘤基質的主要成分。作為腫瘤微環(huán)境的一部分，TAMs對腫瘤進展具有重要的作用。既往研究[13]表明，TAMs對腫瘤具有促進和抑制兩種作用，TAMs被認為在調節(jié)癌癥進展和腫瘤生長中發(fā)揮復雜作用并且影響患者的預后、生存和轉歸，包括結直腸癌患者的預后[14]。在本研究中，我們觀察到結直腸癌組織中的CD68+TAMs表達水平顯著高于正常組織，且CD68+TAMs與臨床和病理特征包括TNM分期、區(qū)域淋巴結轉移、遠處轉移和病理分級具有密切關系。上述臨床病理特征通常與更具侵襲性的腫瘤表型和更差的患者預后相關。此外，在我們的結直腸患者隊列中，腫瘤組織的CD68+TAMs的高密度表達水平顯示了更高的OS和DFS，表明了在結直腸癌中CD68+TAMs是有利的預后因子。

表1 CD68+ TAMs在結直腸癌組織中的表達與臨床特征的關系 例(%)

本研究結果與既往CD68+TAMs在結直腸癌組表達的預后情況結果相一致。據Gulubova等[15]通過210例結直腸癌患者的腫瘤組織免疫組化結果發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中低密度的CD68+TAMs是結直腸癌患者預后的不良因素。還有報道[16]稱，限制性結直腸癌中基質CD163巨噬細胞的增加以及CD163陽性巨噬細胞浸潤增加的趨勢是更好的存活。但對于不同腫瘤中TAMs對臨床特征和預后的結果存在顯著的差異。既往的薈萃分析[11]結果顯示，高密度的TAMs在胃癌患者泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤和頭頸部腫瘤患者顯示出更差的總體生存率。因此，在評價TAMs的作用在不同的腫瘤組織中存在差異時，為何在結直腸癌中更多富集CD68+TAMs 則顯示出良好的預后，其具體的機制仍值得深入探討。

A:OS;B:DFS

由于結直腸癌中浸潤最多的為CD68+巨噬細胞，巨噬細胞代表了作為先天免疫抵御外來病原體的第防一線，巨噬細胞也可以通過腫瘤細胞和非腫瘤發(fā)生細胞區(qū)分腫瘤細胞特異性細胞膜的蛋白并隨后清除惡性細胞。TAM在抗腫瘤M1和促腫瘤M2之間的平衡中動態(tài)地轉移表型[17]。因此，在高表達的CD68+TAMs中，可能存在更多的腫瘤M1表型的TAMs。到目前為止，腫瘤微環(huán)境中的一些因子已經被證明與TAMs的招募和調控分化密切相關。這些刺激物包括巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的CSF-1，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，趨化細胞因子配體2(CCL2)，單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)[18]，還有多種細胞因子如TNF-α、IL-4、IL-13、IL-10、IL-33、IL-25、TGF-β等[19]。因此，對于具體不同個體和結直腸癌組織中，是否存在特異的生物標記物調控TAMs的具體表型仍值得進一步深入研究。

綜上所述，結直腸癌組織較正常結腸組織中CD68+TAMs細胞數(shù)顯著增多，且癌組織CD68+TAMs與腫瘤分期、病理分級、淋巴結及遠處轉移密切相關，高CD68+TAMs表達患者具有更好的臨床預后。