徐勇 劉春燕 劉延群 李亞強(qiáng) 段亮 姜格寧

組織工程氣管的研究已有近30年的歷史[1]，雖然長(zhǎng)段氣管缺損的修復(fù)依然是目前無法解決的難題，但仍然取得了巨大的進(jìn)展。研究表明，組織工程氣管因生物相容性好、免疫排斥反應(yīng)少、生物活性好，以及相關(guān)組織細(xì)胞再生培養(yǎng)等多方面的優(yōu)點(diǎn)，而被認(rèn)為是最理想、最符合生理要求的氣管缺損修復(fù)的方向。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有來源充足、取材方便、創(chuàng)傷小、增殖能力強(qiáng)、無排斥反應(yīng)、不存在倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為理想的種子細(xì)胞。但是BMSCs易分化成骨，因此單純應(yīng)用BMSCs構(gòu)建完整氣管軟骨組織難度較高。尋找一種能誘導(dǎo)BMSCs穩(wěn)定向軟骨分化的材料顯得尤為重要。

同種異體氣管脫細(xì)胞基質(zhì)具有原始的管狀結(jié)構(gòu)、天然的細(xì)胞生存環(huán)境和適宜的力學(xué)性能，被認(rèn)為是最理想的支架材料。有文獻(xiàn)報(bào)道，脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)能誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化[2-4]，BMSCs與氣管脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)復(fù)合構(gòu)建組織工程氣管軟骨具有較大的可行性。但氣管脫細(xì)胞基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞無法在基質(zhì)內(nèi)部深入生長(zhǎng)，使得構(gòu)建的氣管管壁軟骨再生不全，并會(huì)隨著基質(zhì)的降解，而導(dǎo)致移植段氣管軟化塌陷，而使其無法真正用于臨床[5-7]。

本研究采用激光打孔技術(shù)對(duì)氣管軟骨基質(zhì)進(jìn)行激光打孔處理，以增加其孔隙率，再進(jìn)行脫細(xì)胞處理，形成激光打孔脫細(xì)胞基質(zhì)（LDTM）支架材料。隨后復(fù)合BMSCs并植入兔皮下，擬在兔體內(nèi)培養(yǎng)12周，以期能成功構(gòu)建具有較成熟軟骨組織形態(tài)和一定力學(xué)強(qiáng)度的完整的組織工程氣管軟骨。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

胰蛋白酶（Hyclone公司，美國(guó)）；低糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國(guó)）；胎牛血清（Hyclone 公司，美國(guó)）；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B（Hyclone公司，美國(guó)）；磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司，美國(guó)）；生物力學(xué)分析儀（Instron公司，美國(guó)），DNA含量檢測(cè)試劑盒（天根生化科技有限公司），GAG阿爾新藍(lán)法檢測(cè)試劑盒（生工生物工程股份有限公司）；總膠原蛋白檢測(cè)試劑盒（北京博蕾德生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡新西蘭白兔10只（上海甲干生物科技有限公司），體質(zhì)量約2.5 Kg，雌雄不限。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則。

1.3 氣管基質(zhì)的獲取

清潔條件下切取新西蘭兔氣管約2.5 cm（約8～10個(gè)氣管環(huán)），仔細(xì)剔除多余組織，置入PBS保存液，4℃?zhèn)溆谩９?個(gè)樣本。

1.4 氣管基質(zhì)激光打孔

將上述氣管樣本表面水分擦干，往管腔插入相應(yīng)外徑的內(nèi)支撐棒并放置在打孔處。CO2激光打孔機(jī)以10 W功率和17 ms的脈沖時(shí)間，重復(fù)打孔4次。然后將打孔后的樣本浸在PBS溶液中，超聲波清洗機(jī)持續(xù)清洗30 min，直到將氣管內(nèi)碳化的組織去除干凈。

1.5 激光打孔氣管基質(zhì)進(jìn)行脫細(xì)胞處理

①將樣本浸于蒸餾水中，4℃恒溫振蕩48 h，每12 h更換一次蒸餾水；②4%脫氧膽酸鈉（1∶10）4 ℃恒溫振蕩4 h；③PBS 4℃振蕩漂洗1 h，每15 min更換一次 PBS；④酶消化液（1∶10）25 ℃振蕩 3 h；⑤PBS 4℃振蕩漂洗1 h，每15 min更換一次PBS；⑥循環(huán)重復(fù)②～⑤步驟，共計(jì)循環(huán)12次。

1.6 BMSCs的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增

10 mL注射器吸入含肝素的生理鹽水2 mL，于實(shí)驗(yàn)兔股骨髁處穿刺入股骨髓腔，反復(fù)緩慢輕揉沖洗髓腔，獲取含BMSCs的混懸液。按BMSCs常規(guī)分離培養(yǎng)方法，獲得第2代BMSCs備用。

1.7 BMSCs-LDTM復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)

將第2代BMSCs制備成1.0×108cells/mL的混懸液，均勻接種于支架上，37℃、5%CO2、飽和濕度下放置4 h。5只新西蘭大白兔麻醉后，背部剃毛消毒后作3 cm皮膚切口，并且分離皮下組織，于肌肉上層形成一個(gè)小腔隙。再將BMSCs-LDTM復(fù)合物植入該腔隙中，縫合傷口。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素200萬單位預(yù)防感染，每天2次。分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。于術(shù)后12周取材檢測(cè)。

1.8 組織學(xué)檢測(cè)

取脫細(xì)胞前后標(biāo)本以及體內(nèi)培養(yǎng)12周后的標(biāo)本，大體觀察后將標(biāo)本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，切片 （厚度為5 μm），HE染色及Safranin-O染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)Ⅱ型膠原（軟骨組織特異性細(xì)胞外基質(zhì)）的表達(dá)情況，進(jìn)一步證明構(gòu)建組織的軟骨表型[8]。

1.9 生物力學(xué)與生物化學(xué)檢測(cè)

1.9.1 生物力學(xué)檢測(cè)

取脫細(xì)胞前后標(biāo)本及體內(nèi)培養(yǎng)12周后的標(biāo)本，剪成0.5 cm×1 cm的小塊，置于生物力學(xué)分析儀上，沿垂直氣管壁方向以1 mm/min的速度壓縮，直到樣本組織變形。記錄力與位移曲線和最大拉斷力，并計(jì)算楊氏模量。

1.9.2 生物化學(xué)檢測(cè)

將樣品置于木瓜蛋白酶溶液（Sigma-Aldrich）中于65℃消化12 h。按試劑盒方法，用阿爾新藍(lán)法檢測(cè)硫酸化糖胺聚糖（GAG）含量[9]。在乙醇提取和吸附柱吸附后，在洗脫緩沖液中回收基因組DNA。用核酸蛋白質(zhì)定量檢測(cè)器（Nanodrop2000）檢測(cè)DNA含量。用羥脯氨酸測(cè)定法檢測(cè)總膠原含量。通過堿水解制備樣品，根據(jù)先前描述的方法測(cè)定游離羥脯氨酸水解產(chǎn)物[10]。以上所有樣品的分析重復(fù)3次。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 軟件（Version 5.00，Graph-Pad Software，美國(guó)），數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氣管軟骨激光打孔

兔體內(nèi)的天然氣管是表面光滑的瓷白色管狀軟骨樣組織（圖1A），而激光打孔后表面形成規(guī)則的點(diǎn)陣狀排列的微孔結(jié)構(gòu)，且保留原始管狀結(jié)構(gòu)（圖1B）。

2.2 激光打孔氣管基質(zhì)脫細(xì)胞處理

圖1 天然氣管和激光打孔后的大體觀察Fig.1 Gross observation of native trachea and after laser drillin

圖3 脫細(xì)胞前后楊氏模量和DNA殘余量對(duì)比（P＜0.001）Fig.3 Comparison of Young's modulus and DNA content before and after decellularization(P＜0.001)

經(jīng)過脫細(xì)胞處理后，氣管軟骨基質(zhì)大體基本不g變，且仍能維持其原始的管狀結(jié)構(gòu)（圖2A、D）。組織學(xué)觀察顯示，軟骨陷窩里的細(xì)胞成分基本去除 （圖2B、C、E、F）；DNA 定量檢測(cè)同樣證實(shí)脫細(xì)胞后比脫細(xì)胞前DNA含量明顯減少（圖3B）。同時(shí)，組織學(xué)觀察顯示，脫細(xì)胞后氣管基質(zhì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度松散和破壞（圖2E、F）；力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示脫細(xì)胞后氣管基質(zhì)的楊氏模量下降（圖3A）。

2.3 BMSCs-LDTM支架復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)12周

兔體內(nèi)培養(yǎng)12周后，大體觀察顯示BMSCs在LDTM支架表面及微孔內(nèi)均勻分泌基質(zhì)，并形成新的管狀軟骨，微孔結(jié)構(gòu)基本上被新生軟骨組織填充。該構(gòu)建的軟骨具有明顯的瓷白色特征，且具有較好的彈性和韌性（圖4A、B）。HE和Safranin-O染色顯示，大量軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和均勻的特異性軟骨陷窩形成，Ⅱ型膠原免疫組化進(jìn)一步證明了所構(gòu)建的組織為均勻的軟骨組織（圖4C-F）。組織學(xué)顯示，新生軟骨通過激光微孔完全長(zhǎng)入支架內(nèi)部，并形成完整的整體，且新生的管狀軟骨保有了原始的氣管管狀結(jié)構(gòu)。

生物力學(xué)（楊氏模量）檢測(cè)顯示，該新生氣管軟骨具有天然氣管類似的力學(xué)強(qiáng)度。生物化學(xué)（DNA含量、GAG含量和總膠原含量）分析顯示新生的軟骨均接近天然軟骨（P＜0.05）（圖 5）。

圖2 激光打孔氣管基質(zhì)脫細(xì)胞前后對(duì)比Fig.2 Comparison of laser drilling trachea matrix before and after decellularization

圖4 兔體內(nèi)培養(yǎng)12周的新生氣管軟骨Fig.4 Engineered trachea cartilage after cultured for 12 weeks in vivo

3 討論

氣管具有重要的生理功能，包括呼吸、咳嗽、清除分泌物等，氣管缺損的修復(fù)極為困難。組織工程氣管被認(rèn)為是最理想、最符合生理要求的氣管替代物。但迄今為止，構(gòu)建的組織工程氣管仍無法真正地應(yīng)用于臨床。

氣管脫細(xì)胞基質(zhì)一直被認(rèn)為是理想的組織工程氣管支架材料。本研究將CO2激光打孔技術(shù)應(yīng)用到兔氣管基質(zhì)，以改進(jìn)其結(jié)構(gòu)致密的缺陷。通過CO2激光打孔技術(shù)可以在兔氣管基質(zhì)表面精確地打出點(diǎn)陣狀排列的激光微孔，在擴(kuò)大其孔隙率的同時(shí)又能保持其原始的3D管狀結(jié)構(gòu)和一定的力學(xué)強(qiáng)度。此外，我們?cè)O(shè)想因?yàn)檫@些微孔的存在，可以增加氣管基質(zhì)與脫細(xì)胞液體的接觸面積，從而使脫細(xì)胞過程更加快速?gòu)氐?，甚至在接種BMSCs后，這些微孔可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)的滲入，更有利于軟骨的再生。

激光打孔的原理是利用激光脈沖束聚焦于材料上，使焦點(diǎn)處的材料因高溫而熔化和氣化，當(dāng)脈沖結(jié)束后，即可形成圓錐狀的微孔。激光束功率越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，重復(fù)次數(shù)越多，所得到的激光微孔孔徑就越大[11]。如果激光功率過大，作用時(shí)間太長(zhǎng)，重復(fù)次數(shù)過多，對(duì)氣管基質(zhì)的損傷也越大，甚至破壞氣管原有的管狀結(jié)構(gòu)和力學(xué)強(qiáng)度。如果激光功率太小，作用時(shí)間太短，重復(fù)次數(shù)過少，使得氣管基質(zhì)的孔隙率又太低。為了在保證氣管基質(zhì)完整的3D管狀結(jié)構(gòu)和足夠力學(xué)強(qiáng)度的條件下盡可能增加氣管基質(zhì)的孔隙率，我們對(duì)兔氣管基質(zhì)激光打孔參數(shù)進(jìn)行了大量探索。我們認(rèn)為在10 W的功率、17 ms的脈沖時(shí)間和重復(fù)打孔4次的情況下，所得到的激光微孔最為理想。

圖5 新生氣管軟骨生物力學(xué)和生物化學(xué)檢測(cè)（*：P＜0.05）Fig.5 Biomechanical and biochemistry analyses of engineered trachea cartilage(*:P＜0.05)

本實(shí)驗(yàn)沿用DOA聯(lián)合核酸酶的方法制備氣管脫細(xì)胞基質(zhì)[5，12－13]，但這種脫細(xì)胞方法應(yīng)用于氣管微孔脫細(xì)胞基質(zhì)制備卻是首次，因此需要重新摸索最佳的脫細(xì)胞循環(huán)次數(shù)和最佳的酶消化溫度，以制備去除免疫原性且保留一定力學(xué)強(qiáng)度的激光微孔脫細(xì)胞基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)比了4℃、25℃和37℃的酶消化溫度的作用效果，發(fā)現(xiàn)在4℃的低溫條件下，雖然可以最大程度保護(hù)氣管基質(zhì)不受破壞，但是由于該溫度下酶消化效率不高，很難將細(xì)胞去除干凈；而37℃雖然酶消化效率高，但是卻對(duì)氣管基質(zhì)破壞嚴(yán)重；只有在25℃條件下，才能在保證較高的酶消化效率的同時(shí)，又保證氣管基質(zhì)不至于破壞嚴(yán)重。

本研究將BMSCs-LDTM復(fù)合物植入兔皮下12周，驗(yàn)證了LDTM體內(nèi)誘導(dǎo)BMSCs構(gòu)建軟骨的可行性。組織學(xué)觀察顯示，可再生出均質(zhì)、典型的軟骨組織。同時(shí)，組織學(xué)、軟骨特異性基質(zhì)定量及生物力學(xué)結(jié)果均顯示，兔體內(nèi)再生軟骨組織接近于天然氣管。這可能得益于①激光產(chǎn)生的微孔結(jié)構(gòu)，有利于營(yíng)養(yǎng)交換，又促進(jìn)了軟骨細(xì)胞在整個(gè)LDTM表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的分布，促進(jìn)了相對(duì)均質(zhì)的軟骨再生；②皮下環(huán)境豐富的毛細(xì)血管系統(tǒng)可為植入組織提供物質(zhì)交換的動(dòng)力；③激光微孔脫細(xì)胞基質(zhì)保留軟骨的天然成分，如Ⅱ型膠原、糖胺多糖等，為軟骨再生提供了理想的微環(huán)境，促進(jìn)了BMSCs向軟骨分化[14]；④LDTM基于天然材料制備，避免了免疫炎癥反應(yīng)，有利于軟骨組織穩(wěn)定再生；⑤激光微孔脫細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)生了一些生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族、胰島素生長(zhǎng)因子，為軟骨分化和成熟提供了促進(jìn)因子[15-17]。

綜上所述，LDTM是一種理想的氣管組織工程支架，不僅可解決軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)結(jié)構(gòu)致密的問題，也可在體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs穩(wěn)定再生氣管軟骨。下一步我們將基于該模型探索對(duì)長(zhǎng)段氣管缺損進(jìn)行修復(fù)，以期實(shí)現(xiàn)真正意義上的氣管功能性修復(fù)，并未今后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。