孫恒 蔣海越 馬世澤 劉霞 滕利
細(xì)胞三維培養(yǎng)更接近體內(nèi)環(huán)境,更有利于維持細(xì)胞表型或功能[1-3]。研究認(rèn)為,三維的培養(yǎng)環(huán)境和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激有助于組織工程軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[4-6]。其中,微載體空間利用率高,成為貼壁細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)最常用的技術(shù),微載體三維培養(yǎng)方法可在快速擴(kuò)增軟骨細(xì)胞的同時(shí)保持軟骨細(xì)胞的表型[7-8]。
多種商用微載體已經(jīng)問世,但大部分微載體不可降解,且多是實(shí)心結(jié)構(gòu)。后來出現(xiàn)了多孔微載體,可提供的表面積更大。微載體材料方面,也出現(xiàn)了可降解材料,在收獲細(xì)胞時(shí)無需胰酶消化,等材料自然降解即可。多孔微載體除了用作培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的載體,還可用作構(gòu)建可注射組織工程軟骨的支架。目前常用的商業(yè)化微載體中,滿足孔徑合適且可降解要求的僅有Cultispher微載體,其孔徑約為20 μm,有研究將其用于構(gòu)建組織工程軟骨[9]。但相比Cultispher微載體,我們制備的PLLA(左旋聚乳酸)多孔微球孔徑更大,約為25 μm,且孔隙率更高。本研究主要比較PLLA多孔微球和商業(yè)多孔微球Cultispher G對(duì)豬耳郭軟骨細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的影響。
DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone,USA),胎牛血清(Gibco,USA),0.25%胰酶(Hyclone,USA),Ⅱ型膠原酶(sigma,USA),CCK-8試劑盒、DIO細(xì)胞膜綠色熒光探針(碧云天,中國), RNeasy mini kit(QIAGEN,德國),Cultispher G 多孔微載體(PercellBiolytica,瑞典),PLLA 多孔微球(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)。
RCCS 生物反應(yīng)器(Synthecon,USA),LightCyclerR480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Roche,瑞士)。
3只健康長楓雜交豬,雌雄不限,50~60日齡,體質(zhì)量6~8 Kg。無菌條件下切取雙側(cè)耳朵,于超凈臺(tái)分離出耳軟骨,剪切至1 mm3大小,加入5倍體積0.25%胰蛋白酶于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化40 min,再加入5倍體積0.2%Ⅳ型膠原酶,37℃恒溫?fù)u床內(nèi)震蕩消化8 h。將消化的細(xì)胞懸液經(jīng)濾網(wǎng)過濾后,收集并離心,以2×104cells/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中,每3天換液一次。細(xì)胞生長達(dá)到80%~90%融合時(shí)1∶3傳代,本實(shí)驗(yàn)選用第1代軟骨細(xì)胞。
將PLLA、Cultispher G兩種多孔微球各150 mg用無鈣、鎂離子的PBS浸泡過夜,再用PBS洗滌兩次,高溫高壓滅菌30 min,再以DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次,并浸泡于DMEM培養(yǎng)基中,置4℃冰箱中備用。
將軟骨細(xì)胞用綠色熒光探針染色(DIO)后,分別接種于兩種微球上(各4×107cells),加入到盛有RCCS的容器中,并補(bǔ)加 DMEM培養(yǎng)基至容器內(nèi)充滿液體為止。將RCCS反應(yīng)器置于培養(yǎng)箱中,于5%CO2、100%濕度、37℃常規(guī)條件下培養(yǎng),調(diào)整RCCS容器旋轉(zhuǎn)速度,使微載體可以懸浮于培養(yǎng)容器中,隔天換液。接種后第1天待細(xì)胞貼附于微載體后,取樣品測量接種率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。接種率=微球上細(xì)胞數(shù)/總接種細(xì)胞數(shù)×100%。在體外培養(yǎng)7、21 d時(shí)以熒光倒置顯微鏡觀察微球形態(tài)和細(xì)胞生長情況。
取兩組空白微球和體外培養(yǎng)7、21 d的細(xì)胞培養(yǎng)樣品,PBS清洗3次,加2%戊二醛固定24 h,隨后乙醇梯度脫水,再用乙酸異戊酯置換2次,二氧化碳臨界干燥器干燥后,真空噴濺鉑金離子,用SU-8010冷場發(fā)射掃描電鏡觀察細(xì)胞生長狀況并拍照。
于培養(yǎng) 第 1、5、9、13、17、21 天時(shí), 二組分別取1 mL 樣品,加入 100 μL CCK-8,培養(yǎng)箱孵育 2 h,熒光酶標(biāo)儀測量450 nm吸光度值。
培養(yǎng)14、21 d后,兩組分別取適量細(xì)胞-微球復(fù)合物,根據(jù)RNA提取試劑盒使用說明提取RNA,取1 000 ng RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)規(guī)則在pubmed上設(shè)計(jì)及驗(yàn)證(表1),由擎科公司合成(中國,北京)。qPCR測量通過Roche480系統(tǒng)完成。采用2^-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
表1 引物序列Table 1 Primer sequences
采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用 t檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
電鏡和組織切片觀察兩種空白微球可見:PLLA多孔微球表面孔徑(25 μm左右)比Cultispher G(20 μm左右)略大,而且PLLA多孔微球孔隙率高,內(nèi)部孔徑也較Cultispher G微球均勻(圖1)。PLLA多孔微球的細(xì)胞接種率為(37.67%±2.33%),Cultispher G的接種率為(73.67%±3.53%)(圖 2)。Cultispher G 高于PLLA微球,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
培養(yǎng)7 d時(shí)(圖3),熒光倒置顯微鏡下看PLLA組細(xì)胞量少于Cultispher G組,電鏡觀察顯示細(xì)胞在微球表面呈單層分布,細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則扁平狀,周邊舒展,生出偽足,緊附于微載體表面。PLLA組細(xì)胞未完全覆蓋多孔微球,Cultispher G組細(xì)胞已將多孔微球完全覆蓋。由于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌,微球間產(chǎn)生連接,聚集在一起,但不太緊密。培養(yǎng)21 d時(shí)(圖4),熒光倒置顯微鏡下軟骨細(xì)胞數(shù)量在微球上進(jìn)一步增殖,電鏡下見細(xì)胞呈多層生長,細(xì)胞外基質(zhì)也明顯增加,將微球完全包裹,細(xì)胞外基質(zhì)將多個(gè)微球緊緊包裹,形成不易分開的整體。兩組材料均長滿細(xì)胞,但PLLA組微球體積更大,細(xì)胞可黏附面積也更大。
圖1 空白微球電鏡和切片照片F(xiàn)ig.1 SEM and section photos of blank ball
圖3 軟骨細(xì)胞在PLLA、Cultispher G多孔微球生長7 d時(shí)DIO熒光和電鏡照片F(xiàn)ig.3 DIO fluorescence and SEM photos of chondrocytes on PLLA and Cultispher G porous microspheres in the 7 days
Cultispher G多孔微球組細(xì)胞接種量高,也更早趨于飽和,至2周左右后細(xì)胞總量不再增加;PLLA多孔微球組接種細(xì)胞量低,初始細(xì)胞總數(shù)少,到達(dá)細(xì)胞最大量時(shí)間較Cultispher G多孔微球組晚,但其細(xì)胞總數(shù)至觀察終點(diǎn)時(shí)仍在緩慢增長。雖然PLLA多孔微球組開始接種細(xì)胞量少,但是培養(yǎng)21 d后,細(xì)胞總數(shù)高于Cultispher G多孔微球組(圖5)。
培養(yǎng)21 d后,PLLA多孔微球組軟骨分化基因ACAN、COL2、SOX9、COMP 的表達(dá)量均高于 Cultispher G多孔微球組。軟骨肥大分化基因COL10表達(dá)量在培養(yǎng)14 d后兩組未見差異,培養(yǎng)21 d后PLLA多孔微球組表達(dá)量更高;COL1表達(dá)量在培養(yǎng)14 d后Cultispher G多孔微球組更高,而培養(yǎng)21 d后兩組未見差異(圖6)。
圖2 PLLA和Cultispher G多孔微球接種率(P<0.05)Fig.2 Inoculation rates of PLLA and Cultispher G porous microsphere(P<0.05)
圖4 細(xì)胞在PLLA、Cultispher G多孔微球生長21 d時(shí)DIO熒光和電鏡照片F(xiàn)ig.4 DIO fluorescence and SEM photos of chondrocytes on PLLA and Cultispher G porous microspheres in the 21 days
圖5 軟骨細(xì)胞生長曲線Fig.5 Growth curve of chondrocytes
微載體可分為多孔微載體和實(shí)心微載體,多孔微載體可以提供更大的表面積,有利于營養(yǎng)物質(zhì)的交換和吸收及細(xì)胞的生長。Chung等[10]發(fā)現(xiàn),軟骨細(xì)胞不但在多孔微球上黏附和增殖多于無孔微球,且軟骨表型維持更好。與無孔微球相比,多孔微球細(xì)胞在微球內(nèi)部可避免外部機(jī)械力沖擊,更好地生長[11]。另外,同樣體積多孔微球材料比無孔微球少很多,降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響也更小,多孔微球密度也較無孔微球低,在容器中更容易懸浮[12]。
微載體孔徑大小對(duì)細(xì)胞生長也有影響,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在大孔微球上比小孔微球上增殖更快,且分布更均勻;小孔微球僅在表面長出一層細(xì)胞,且死細(xì)胞比大孔微球多,因?yàn)樾】讖较拗屏藸I養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交流。
Cultispher G是明膠材料,細(xì)胞親和性好、黏附率高,細(xì)胞利用率高。合成聚合物材料和天然聚合物相比,細(xì)胞親和性弱,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣顯示PLLA多孔微球細(xì)胞接種率低。細(xì)胞增殖方面可見PLLA多孔微球培養(yǎng)21 d后細(xì)胞增殖總量大于Cultispher G多孔微球,可能是因?yàn)镻LLA多孔微球孔徑和孔隙率高于Cultispher G多孔微球,細(xì)胞更易長入多孔微球內(nèi)部,空間更大更有利于細(xì)胞的進(jìn)一步增殖。維持軟骨細(xì)胞表型方面,Cultispher G多孔微球不如PLLA多孔微球。培養(yǎng)21 d后,軟骨相關(guān)基因表達(dá)均為PLLA多孔微球更高。
本研究對(duì)比了軟骨細(xì)胞在兩種微球上的黏附、增殖和分化。PLLA微球雖然細(xì)胞親和性稍差,但總體優(yōu)于Cultispher G。后續(xù)將對(duì)PLLA多孔微球進(jìn)行表面修飾,改善其細(xì)胞親和性。
圖6 相關(guān)基因表達(dá)量Fig.6 Related gene expression