馮劍 ，趙景壯 ，劉淼 ，盧彤巖 ，紀(jì)鋒 ，徐黎明

（1.本溪艾格莫林實(shí)業(yè)有限公司，遼寧 本溪 117000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

1 我國虹鱒養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀

虹鱒Oncorhynchus mykiss是鮭科魚類的典型代表和我國主要養(yǎng)殖冷水魚之一。我國虹鱒養(yǎng)殖主要集中在東北、西北及西南等經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，在提供優(yōu)質(zhì)安全蛋白源、促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和提質(zhì)增效、促進(jìn)山區(qū)漁民脫貧致富中發(fā)揮了不可或缺的作用。自20世紀(jì)90代中期我國虹鱒養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷提高，開始進(jìn)入產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展期。但從2006年開始，我國大多數(shù)虹鱒養(yǎng)殖區(qū)的幼魚大規(guī)模死亡，死亡率達(dá)70%～90%，嚴(yán)重時(shí)可近100%[1]，導(dǎo)致我國虹鱒產(chǎn)量急劇下降，國內(nèi)消費(fèi)大部分依賴于進(jìn)口，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。檢測發(fā)現(xiàn)，虹鱒幼魚多死于傳染性造血器官壞死?。↖nfectious hematopoietic necrosis，IHN）。

IHN是由彈狀病毒——傳染性造血器官壞死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）引起的魚類急性、全身性傳染病，被國際獸醫(yī)局（Organisation mondiale de la santé animale，OIE）列為必須申報(bào)的動(dòng)物疫病，是我國水生動(dòng)物二類疫病[2]。由于缺少商品化的IHN疫苗，發(fā)病虹鱒魚苗的存活率僅為20%～30%。全球每年因IHN暴發(fā)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，該病嚴(yán)重制約了虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

2 IHN流行現(xiàn)狀

IHN是全球性鮭科魚常見的急性病毒性傳染病，分布廣泛、發(fā)病率高，對世界鮭養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。IHN最早于20世紀(jì)50年代暴發(fā)于美國俄勒岡州和華盛頓州，70年代先后傳入日本、法國和意大利，80年代末傳入我國，90年代傳入韓國、德國、瑞士等國家[3]。目前IHNV已傳播至幾乎所有的鮭鱒養(yǎng)殖國家。全世界的IHNV分為U、M、L、E和J型5種基因型，其中U型主要流行于美國北部西海岸和日本，M型流行于美國和俄羅斯，L型流行于美國，E型流行于歐洲大陸等國家，J型流行于亞洲等國家。中國IHNV毒株主要為J基因型（圖1）。

圖1 世界范圍內(nèi)IHNV分離株的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of global IHNV isolates

據(jù)可追溯的最早資料顯示，我國于1985年首次暴發(fā)IHN[4]，在20世紀(jì)90年代有零星報(bào)道，但從2006年開始IHN在全國范圍內(nèi)暴發(fā)，導(dǎo)致虹鱒苗種大量死亡[5]。黑龍江水產(chǎn)研究所魚類病害防治課題組連年在黑龍江省、吉林、遼寧省、山東省、甘肅省、青海、四川、云南、新疆等多個(gè)省的虹鱒養(yǎng)殖場開展流行病學(xué)調(diào)查，截止到2017年12月，以省份計(jì)算IHN檢出率為100%，以養(yǎng)殖場計(jì)算為72.7%，說明IHN幾乎流行于我國所有虹鱒養(yǎng)殖區(qū)（圖2）。

IHN在水溫7～16℃內(nèi)均可出現(xiàn)高死亡率，一些水溫適宜的養(yǎng)殖場四季均可發(fā)病。該病主要感染虹鱒苗種，發(fā)病后一周內(nèi)即可達(dá)70%～90%的死亡率。2013年后我國陸續(xù)發(fā)現(xiàn)成魚亦可感染此病，但表現(xiàn)為長期慢性死亡，病程可長達(dá)數(shù)月，累計(jì)死亡率＞80%；病魚均伴隨著嚴(yán)重的繼發(fā)腸道感染癥狀[6]。

圖2 我國養(yǎng)殖虹鱒及IHNV的分布Fig.2 The distribution of rainbow trout farm s and IHNV in China

3 IHN防控現(xiàn)狀

歐美一些冷水魚養(yǎng)殖大國，如加拿大、美國和挪威等先后研發(fā)了多種形式的IHNV疫苗，包括滅活疫苗[7]、弱毒苗[8]和DNA疫苗[3,9-11]等。在長期研究基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)DNA疫苗具有免疫保護(hù)效果好、免疫力持久、制備簡單、安全等優(yōu)勢，國外相關(guān)研究日益聚焦于IHN的DNA疫苗。國際上首個(gè)IHN核酸疫苗Apex-IHN已于2005年在加拿大批準(zhǔn)上市[12]，這是目前唯一一個(gè)用于預(yù)防IHN的商品化疫苗。美國、加拿大等國家已應(yīng)用該疫苗有效控制IHN的大規(guī)模暴發(fā)。由于核酸疫苗的使用，近年國外少有IHN流行暴發(fā)的報(bào)道，大力促進(jìn)了冷水魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

鑒于IHN對我國冷水魚產(chǎn)業(yè)的危害，我國開展了相關(guān)防控技術(shù)的研究。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所篩選出我國現(xiàn)行IHN流行株，以pcDNA 3.1真核表達(dá)載體為基本骨架進(jìn)行表達(dá)載體的改造優(yōu)化，構(gòu)建出應(yīng)用于魚體免疫的高效表達(dá)載體；根據(jù)IHNV基因組測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增IHNV糖蛋白基因，連接至表達(dá)載體中構(gòu)建出了IHN核酸疫苗pIHNch-G（圖3）。體內(nèi)體外鑒定結(jié)果表明，該疫苗能夠在虹鱒細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)IHNV抗原蛋白。通過系統(tǒng)性研究，制定了該疫苗的最佳免疫規(guī)程：采用背鰭基部肌肉注射，免疫劑量為2μg/尾（5～120g虹鱒），一次免疫即可，60度日即可產(chǎn)生免疫保護(hù)。免疫效果綜合分析結(jié)果表明，構(gòu)建的核酸疫苗能夠刺激虹鱒Mx、IFN、STAT及IRF等相關(guān)免疫因子的上調(diào)表達(dá)，表達(dá)高峰為4～7d；同時(shí)刺激炎癥相關(guān)因子IL-8、IL-1β及TNF-α的上升表達(dá)；免疫魚血清IHNV中和抗體效價(jià)最高達(dá)160以上。多批次的試驗(yàn)結(jié)果表明，該IHNV核酸疫苗保護(hù)率可達(dá)90%以上[3]，可有效控制IHN的暴發(fā)，已成功構(gòu)建出具有明顯保護(hù)作用的核酸疫苗。課題組還確定了IHN核酸疫苗大規(guī)模發(fā)酵工藝參數(shù)，完成了該疫苗的臨床前研究。并且對該疫苗的體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布及抗性基因?qū)Νh(huán)境細(xì)菌的影響開展了長期監(jiān)測工作，結(jié)果證明p IHNch-G對免疫動(dòng)物及環(huán)境均是安全的[13,14]。該疫苗已于2017年6月獲得農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室批準(zhǔn)，在黑龍江省開展疫苗的中間試驗(yàn)。目前已完成了中間試驗(yàn)，并提交了環(huán)境釋放申報(bào)材料。黑龍江水產(chǎn)研究所在單價(jià)IHN核酸疫苗的基礎(chǔ)上開展了抗IHN和傳染性胰臟壞死?。╥nfectious pancreatic necrosis,IPN）的二聯(lián)核酸疫苗（p IHN/IPN-Ch）的研究。效力分析結(jié)果顯示p IHN/IPN-Ch不但能夠抵擋IHNV強(qiáng)毒株的攻擊，為免疫虹鱒提供90%以上的相對保護(hù)率，而且能夠顯著降低虹鱒體內(nèi)IPNV病毒載量[15]。該疫苗的構(gòu)建有望通過一次免疫，即可實(shí)現(xiàn)有效防控目前我國虹鱒兩種主要病毒病的目標(biāo)。此外，趙景壯等[16]嘗試?yán)媒湍刚故炯夹g(shù)結(jié)合蛋白額外錨定策略，提高了展示于酵母表面的IHNV的糖蛋白數(shù)量，初步構(gòu)建了口服抗IHN酵母疫苗，效力分析結(jié)果顯示該疫苗能夠?yàn)榭诜庖吆琪V提供近50%的相對保護(hù)率。我國一些科研機(jī)構(gòu)也開展了IHNV組織漿滅活疫苗的研制，亦可不同程度提高虹鱒魚種的成活率[17]。

圖3 IHN核酸疫苗p IHNch-G基因圖譜Fig.3 Genemap of p IHNch-G in IHN nucleic acid vaccine

圖4 二聯(lián)核酸疫苗p IHN/IPN-Ch基因圖譜Fig.4 Genemap of two linked nucleic acid vaccine p IHN/IPN-Ch

一些研究學(xué)者開展了抗病毒藥物研究劑篩選工作。任廣明等[18]開展了抗IHNV多糖的篩選工作，獲得了良好的體外抗IHNV的多糖；代靜等構(gòu)建了轉(zhuǎn)IHNV糖蛋白基因的萊茵衣藻，口服免疫小鼠后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)G基因萊茵衣藻能夠刺激小鼠的T淋巴細(xì)胞的增[19]；曹永生等利用大腸桿菌表達(dá)了虹鱒IFN-γ2，攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫后1d進(jìn)行IHNV攻擊時(shí)，魚死亡率為40%，而免疫后2d進(jìn)行IHNV攻擊時(shí)，魚死亡率達(dá)到80%[20]；王會(huì)英等在細(xì)胞水平上開展了IHNV微型基因組表達(dá)干擾素對病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的抑制作用研究[21]；王宏磊等從虹鱒腸道內(nèi)分離了抗IHNV益生菌一株，為IHNV活載體疫苗候選載體提供參考[22]。

此外，由于我國現(xiàn)階段無商品化IHN疫苗使用，相關(guān)部門根據(jù)我國虹鱒養(yǎng)殖現(xiàn)狀，制定了3個(gè)月魚齡內(nèi)的魚苗管控措施，希望通過消滅傳染源、切斷傳播途徑，保證孵化期魚種的成活率，亦取得了一定的防控效果[23,24]。

4 我國虹鱒IHN防控存在的問題及展望

4.1 疫苗產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程緩慢

疫苗是公認(rèn)的最高效環(huán)保的防控病毒性病害的手段，但在我國現(xiàn)行疫苗審批制度下，疫苗研究成果走出實(shí)驗(yàn)室，走向養(yǎng)殖場的時(shí)間較長。實(shí)驗(yàn)室的成果不能及時(shí)應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)，阻礙了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。美國等國家的做法是，在規(guī)定的苗種養(yǎng)殖場可使用自行研制的疫苗，苗種場可出售經(jīng)免疫的魚苗（種）。我國當(dāng)前可否借鑒此經(jīng)驗(yàn)，允許在可控水域內(nèi)充分證明了疫苗的有效及安全性前提下小規(guī)模應(yīng)用疫苗，以控制該病的流行和暴發(fā)。

4.2 加強(qiáng)重要病害的監(jiān)測

我國虹鱒產(chǎn)業(yè)面臨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大、養(yǎng)殖方式多樣、苗種來源愈加復(fù)雜等現(xiàn)狀，病原的傳播途徑也更加多樣，給虹鱒病毒病的防控提出了新的挑戰(zhàn)。應(yīng)加強(qiáng)對養(yǎng)殖虹鱒開展多種疫病的監(jiān)測工作，及時(shí)掌握疫病流行情況，為病害暴發(fā)提供預(yù)警作用。

4.3 制定綜合防控方案

疫病的防控是系統(tǒng)工程，除特異性疫苗免疫外，切斷病原的傳播途徑也非常重要，如引進(jìn)及外銷的魚苗、魚種進(jìn)行常規(guī)的疫病監(jiān)測、養(yǎng)殖魚的定期疫病監(jiān)測、養(yǎng)殖場所及養(yǎng)殖工具的定期消毒、投喂提高免疫力的中藥及生物制劑等，只有多渠道防控才可能有效控制病害的傳播。

4.4 加快水生動(dòng)物無規(guī)定疫病苗種場的建設(shè)

水生動(dòng)物無規(guī)定疫病苗種場的建設(shè)是從根本上解決病原傳播及病害流行的關(guān)鍵因素之一。針對我國虹鱒養(yǎng)殖的特點(diǎn)，建立一批無IHNV鮭鱒魚苗種場，有效控制流通的受精卵、飼料、苗種、獸藥等環(huán)節(jié)，最大限度地控制病原的傳染源頭，有效遏制病害的大規(guī)模傳播和流行。目前我國已在青海開展了無IHNV鮭鱒魚苗種場的試點(diǎn)工作，應(yīng)在總結(jié)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上加快在我國虹鱒主要養(yǎng)殖地區(qū)開展無規(guī)定疫病苗種場的建設(shè)。

綜上所述，IHN是目前制約我國虹鱒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。歷史的經(jīng)驗(yàn)告訴我們，高效安全疫苗的使用是解決該疫病流行的最有效方式。此外，還需加強(qiáng)養(yǎng)殖過程及苗種流通的綜合管理，推動(dòng)并建立以免疫防治為核心的虹鱒健康養(yǎng)殖新模式。