趙雪飛 ，米博翰 ，梁利群 ，馬勇強(qiáng) ，孫博 ，常玉梅

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱150070；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；4.新疆新源縣普祿科生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，新疆 新源830000）

新疆裸重唇魚Gymnodiptychus dybowskii和斑重唇魚Diptychus maculates同屬裂腹魚亞科Schizothoracinae，同為特化等級的裂腹魚類[1]。前者屬裸重唇魚屬Gymnodiptychus，又稱裸黃瓜魚，分布于我國伊犁河流域和準(zhǔn)噶爾盆地等水域，為新疆維吾爾族自治區(qū)I級水生野生保護(hù)動物；后者屬重唇魚屬Diptychus，又稱斑黃瓜魚，分布于新疆塔里木河水系伊犁河流域，為新疆維吾爾族自治區(qū)II級水生野生保護(hù)動物[2～4]。

21世紀(jì)初由于人類生產(chǎn)活動和利益驅(qū)使，新疆裸重唇魚和斑重唇魚等一些珍稀魚類遭過渡捕撈，資源遭到嚴(yán)重破壞[5]。為了保護(hù)這兩種魚類資源，在伊犁河流域上多座水利水電工程建設(shè)中開展了相應(yīng)的人工救護(hù)和增殖放流工作[6]，并對已建水電站進(jìn)行水生生物及環(huán)境監(jiān)測，控制外來物種入侵,嚴(yán)格按照相關(guān)法規(guī)進(jìn)行增殖放流，保護(hù)新疆土著魚類[7]。目前對這兩個物種的研究多集中于野外調(diào)查和種群進(jìn)化等研究[8～11]，對其種內(nèi)遺傳多態(tài)性的研究尚未見報道。

新疆裸重唇魚和斑重唇魚體表均裸露幾乎無磷，野外群體空間分布具有較高的重疊性和相似性，當(dāng)?shù)厝私y(tǒng)稱兩種魚類為棒子魚[12]，針對兩物種的分子遺傳學(xué)研究未見報道。本研究在已發(fā)表的文獻(xiàn)中選用與兩種魚為同亞科的其他魚類的微衛(wèi)星標(biāo)記共51對，分別對兩個物種的群體DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析兩物種種群的種內(nèi)多態(tài)性與種間遺傳距離，同時篩選出可用于這兩個物種種質(zhì)鑒定的分子標(biāo)記，以期為兩個物種的種群保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年12月，在新疆新源縣普綠科生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，分別采集來自鞏乃斯河上游恰普河的斑重唇魚（BCC）、新疆裸重唇魚（LCC）各 15尾，剪取部分腹鰭組織，置于95%乙醇中保存。

1.2 方法

1.2.1 微衛(wèi)星引物

本研究所用的51對引物分別來自郝卓然、段鵬翔及楊天燕等已發(fā)表的文獻(xiàn)[13～15]，由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。同時對兩物種中隨機(jī)選取的3個樣本，進(jìn)行PCR擴(kuò)增穩(wěn)定性及多態(tài)性進(jìn)行檢測，選擇適宜的微衛(wèi)星標(biāo)記共16個，檢測全部30個樣本的多態(tài)性（表1）。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法，提取鰭條樣品的DNA，用Thermo Nano Drop 8000分光光度計測量濃度，稀釋樣本濃度至10ng/μL備用。

PCR 擴(kuò)增體系為 25μL，包括 2×mix 12.5μL，上下游引物各（10mmol/L）1μL，基因組 DNA 2μL，滅菌ddH2O補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性 45s，退火 45s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)；最后再72℃延伸10min，4℃保溫，退火溫度依引物而定（表1）。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI Veriti96梯度PCR儀上完成。取1μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離(140 V，3.5～4h)，銀染顯色后拍照記錄，分子量標(biāo)準(zhǔn)為DL2000。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用Gel-Pro Analyzer 4.5軟件分析電泳條帶大小。經(jīng)電泳獲得的基因指紋圖譜在引物擴(kuò)增的片段大小范圍內(nèi)，將有正確擴(kuò)增條帶的標(biāo)記用作分析各物種種群的種內(nèi)多態(tài)性，只有單一物種出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的標(biāo)記可用作兩物種的種質(zhì)鑒定。

用Pop Gene32軟件統(tǒng)計微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)（Allele Number，N）、有效等位基因數(shù)（Effective number of allele，Ne）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，H）以及期望雜合度（Expected oheterozygosity，He）。采用Pop Gene32軟件進(jìn)行χ2檢驗估計群體的Hardy-Weinberg平衡偏離，同時統(tǒng)計并計算了Nei氏遺傳距離、遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity index，I）、基因流（Nm）、群體間近交系數(shù)（FST）和多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）等遺傳參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果與分析

51個微衛(wèi)星標(biāo)記對BCC和LCC兩個群體的30尾樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出可用標(biāo)記為16對。其中可用于BCC種內(nèi)多態(tài)性分析的標(biāo)記共13個（HLJ3919、HLJ2228、BW014、HLJ3795、HLJ2217、HLJ2265、HLJ3138、TLM22、QK45、TLM10、HLJ2433、HLJ2510和 HLJ2376），標(biāo)記 HLJ3481和HLJ2147均只有一條帶，標(biāo)記BWY05帶型較雜，可用于兩物種的種質(zhì)鑒定，不能用于BCC的種內(nèi)多態(tài)性分析；可用于LCC種內(nèi)多態(tài)性分析的標(biāo)記為4個（HLJ3919、HLJ2229、HLJ2147 和 HLJ2217），除用于種質(zhì)鑒定的標(biāo)記不能被擴(kuò)增出條帶外，LCC在其他標(biāo)記均為單一條帶，無多態(tài)性；可用作兩物種種質(zhì)鑒定的標(biāo)記為 HLJ3481、HLJ2433、HLJ2510、HLJ2376和BWY05等5個標(biāo)記，這5個標(biāo)記均只能擴(kuò)增物種BCC。全部標(biāo)記擴(kuò)增出穩(wěn)定而清晰片段的長度內(nèi)103～534bp，部分標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見圖1。

表1 微衛(wèi)星引物序列及擴(kuò)增情況Tab.1 The sequences and am plification condition ofm icrosatellitemarkers

2.2 兩個物種的遺傳參數(shù)分析

用Popgen32軟件計算統(tǒng)計了斑重唇魚和新疆裸重唇魚兩物種的多個遺傳參數(shù)（表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩群體平均等位基因數(shù)（N）分別為2.375和1.75，平均有效等位基因數(shù)（Ne）分別為1.879和1.504，平均觀測雜合度（Ho）分別為0.454和0.367，平均期望雜合度（He）分別為0.397和0.245。將每個標(biāo)記的等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)；觀測雜合度與期望雜合度進(jìn)行成對樣本的T檢驗。結(jié)果顯示：BCC和LCC的等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)差異顯著（P＜0.05），而觀測雜合度與期望雜合度差異則為BCC顯著（P＜0.05），LCC不顯著（P=0.128）。Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示，僅LCC群體在標(biāo)記HLJ2147極顯著偏離平衡，表現(xiàn)為雜合子過剩。

圖1 部分標(biāo)記的電泳圖譜Fig.1 Partial labeled electrophoretic maps

表2兩個物種在14個標(biāo)記上的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of the two species at 16m icrosatellitemarkers

斑重唇魚的多態(tài)信息含量（PIC）范圍在0.180～0.616之間，新疆裸重唇魚的多態(tài)信息含量（PIC）范圍在0.124～0.740之間，根據(jù)Botstein等[16]對標(biāo)記多態(tài)水平的劃分標(biāo)準(zhǔn)，BCC和LCC分別有3個和1個標(biāo)記為低度多態(tài)（0＜PIC≤0.25），各占整體的23.1%和25%；各有6個和1個標(biāo)記為中度多態(tài)（0.25≤PIC＜0.5），占整體的46.2%和25%；各有4個和2個標(biāo)記為高度多態(tài)（PIC≥0.5），各占整體的30.7%和50%。BCC和LCC的平均多態(tài)信息含量分別為0.433和0.461，雖然新疆裸重唇魚的平均PIC要高于斑重唇魚，但前者的可用微衛(wèi)星標(biāo)記較少，與斑重唇相比，新疆裸重唇魚在多個微衛(wèi)星標(biāo)記均無多態(tài)性。因此，整體來看，斑重唇魚種群的多態(tài)水平要高于新疆裸重唇魚。

2.3 兩個物種的遺傳分化分析

選取共11個標(biāo)記用作斑重唇魚和新疆裸重唇魚的遺傳分化分析（HLJ3919、HLJ2228、BW 014、HLJ2147、HLJ3795、HLJ2217、HLJ2265、HLJ3138、TLM22、QK45和TLM10）。得到兩物種的群體間近交系數(shù)（FST）平均值為0.357，表明35.7%的遺傳差異來自群體間，基因流（Nm）平均值為0.451，遺傳相似系數(shù)（I）平均值為0.782。兩物種之間的遺傳距離為0.520。利用UPGMA法構(gòu)建的群體遺傳關(guān)系聚類圖顯示，兩個種群分別聚為一支，表面兩個種群間不存在雜交現(xiàn)象（表3）。

表3 群體間遺傳距離與遺傳相似度Tab.3 Nei's genetic distance(above diagonal line)and genetic identity(below diagonal line)

3 討論

2003至2007 年，馬燕武等[17]曾全面調(diào)查了新疆塔里木河水系土著魚類的種類和分布,發(fā)現(xiàn)塔里木河水系土著魚類的大尺度、大空間格局上分布均有縮小趨勢，僅在開都河水系發(fā)現(xiàn)有新疆裸重唇魚分布，范圍較以往狹窄。蔡林鋼等[7]也于2012—2014年連續(xù)3年調(diào)查了新疆伊犁河上、中和下游不同河段的魚類資源，發(fā)現(xiàn)伊犁河上游河段魚類種類稀少，大中型魚類資源更為稀少，優(yōu)勢種多以體型較小的冷水性土著魚類為主，魚類多樣性較低，群落已受到干擾。可見斑重唇魚和新疆裸重唇魚的天然種群生存狀況并不樂觀。本研究對兩種群種內(nèi)多態(tài)性的研究結(jié)果與野外調(diào)查結(jié)果相符，新疆裸重唇魚雖然在4個微衛(wèi)星標(biāo)記顯示種內(nèi)多態(tài)性相對高于斑重唇魚，但在斑重唇魚的13個微衛(wèi)星標(biāo)記中，有10個標(biāo)記均只能擴(kuò)增出單一條帶，遺傳背景相對單一，可見，新疆裸重唇魚種內(nèi)多態(tài)性要低于斑重唇魚，應(yīng)加強(qiáng)對其野外資源的保護(hù)力度。而斑重唇魚的種內(nèi)多態(tài)性分析結(jié)果雖然相對高于新疆裸重唇魚，但對伊犁河上游河段調(diào)查發(fā)現(xiàn)的小型化和低齡化等情況仍不容忽視。因此對于這兩種曾較廣泛分布于新疆的魚類，其野外種群數(shù)量和遺傳多樣性的保護(hù)工作仍需繼續(xù)加強(qiáng)。

本研究通過篩選用于評估新疆裸重唇魚和斑重唇魚種內(nèi)多態(tài)性評估的微衛(wèi)星標(biāo)記共14個，發(fā)現(xiàn)可用于兩物種種質(zhì)鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記5個，并分別分析了兩物種的種內(nèi)多態(tài)性等,發(fā)現(xiàn)新疆裸重唇魚在多個標(biāo)記均不具有多態(tài)性，遺傳背景較單一，而斑重唇魚的種內(nèi)多態(tài)性雖然相對較高，但其野外種群的生存狀況并不樂觀。針對新疆裸重唇魚和斑重唇魚的野外種群保護(hù)雖然已采取了一定的措施，但尚有許多工作還需進(jìn)一步開展。