倪琦 林化

皮膚創(chuàng)面的血供是影響創(chuàng)面愈合的一個重要因素, 新生血管不僅向皮膚創(chuàng)面提供必要的營養(yǎng)物質(zhì), 同時也是創(chuàng)面肉芽組織的重要組成部分和創(chuàng)面愈合的基質(zhì)。因此, 促進皮膚創(chuàng)面血管的再生有利于皮膚創(chuàng)面的修復(fù)。有研究表明, 桂林西瓜霜噴劑可以加快Ⅰ、Ⅱ期壓瘡創(chuàng)面的愈合［1］。作者前期的研究也表明桂林西瓜霜對小鼠的皮膚創(chuàng)面愈合有一定的促進作用, 其機制可能與其促進皮膚創(chuàng)面組織微血管新生有關(guān)［2］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在血管再生過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究中, 探討桂林西瓜霜對小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織VEGF 表達的影響,探討桂林西瓜霜促進小鼠皮膚創(chuàng)面微血管再生的機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 桂林西瓜霜噴劑(桂林三金藥業(yè)股份有限公司, 國藥準字Z45021599), 10%水合氯醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司), Trizol提取液(美國Invitrogen公司), TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］, SYBR Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］, VEGF(小鼠)ELISA試劑盒(美國Novus公司)。低溫高速離心機(Eppendorf 5804R, 德國), 實時熒光定量PCR儀(ABI7500, 美國), 酶標分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

1.2 動物模型制備［2］清潔級小鼠80只(體重15~25 g), 由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供, 喂以固體平衡飼料, 自由飲水。飼養(yǎng)3 d后, 剃去小鼠背部區(qū)域的毛。以10%的水合氯醛(0.01 ml/g)腹腔注射麻醉后, 碘伏消毒, 運用打孔器于脊柱雙側(cè)皮膚, 制造2個直徑1.2 cm的圓形全層皮膚損傷創(chuàng)面, 相鄰創(chuàng)面之間至少間距1.5 cm, 然后用生理鹽水潤濕, 清潔創(chuàng)面血跡, 創(chuàng)面止血后使用無菌紗布覆蓋, 上述處理后單籠詞養(yǎng)。

1.3 分組與給藥 將皮膚創(chuàng)傷模型小鼠隨機分為對照組及實驗組, 各40只, 各組分為造模后3、7、14及21天4個亞組(各個亞組10只)。對照組小鼠皮膚創(chuàng)面僅予以生理鹽水清潔, 實驗組小鼠皮膚創(chuàng)面使用生理鹽水清潔后, 噴灑西瓜霜噴劑覆蓋全部創(chuàng)面, 每日早晚各1次, 連續(xù)給藥10 d。分別于造模后第3、7、14、21天, 以斷頸法處死小鼠, 取皮膚創(chuàng)面肉芽組織檢測VEGFmRNA和蛋白的表達。

1.4 實時熒光定量PCR(Quantitative Realtime PCR)檢測小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織VEGF mRNA的表達 取皮膚創(chuàng)面組織,用1×PBS清洗后, 按試劑說明書要求抽提總核糖核酸(RNA),測定其純度及含量。采用20 μl反應(yīng)體系, 按42℃60 min、72℃5 min反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒說明書以cDNA作為模板進行PCR反應(yīng)。VEGF引物序列：正向引物為5'-CTCGCAGTCCGAGCCGGAGA-3', 反向引物為5'-GCAGCCTGGGACCACTTGGC-3'；β-actin引物序列：正向引物5'-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3', 反向引物5'-CTTCTCCATGTCGTCCCA GT-3'。擴增條件：95℃預(yù)變性30 s, 95℃變性5 s, 60℃退火延伸34 s, 40個循環(huán)。運用2-△△Ct法計算基因相對表達量。

1.5 ELISA 測定皮膚創(chuàng)面肉芽組織勻漿VEGF蛋白的表達取50 mg創(chuàng)面組織, 用1×PBS清洗后剪成小塊, 放入組織研磨器中, 加入0.5 ml 1×PBS, 制成勻漿, 然后置于-20℃過夜。反復(fù)凍融2次破壞細胞膜后, 將組織勻漿于4℃(5000×g)離心5 min, 取上清液待測。將100 μl待測樣品與VEGF標準品分別加入包被有VEGF抗體的96孔板中, 37℃孵育1 h；加入100 μl檢測溶液A, 37℃孵育1 h；加入100 μl檢測溶液B, 37℃孵育1 h；然后加入底物溶液90 μl, 37℃ 避光顯色20 min。當(dāng)標準品孔呈現(xiàn)明顯梯度藍色時, 加入終止液50 μl終止反應(yīng)。酶標儀450 nm波長處檢測各孔光密度(OD)值,繪制標準曲線, 通過標準曲線方程計算待測樣本VEGF含量。

1.6 觀察指標 觀察并比較兩組造模后第3、7、14、21天小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織VEGFmRNA和勻漿VEGF蛋白表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示, 采用t 檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組造模后第3、7、14、21天小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織VEGFmRNA表達水平比較 造模后第3、7 天, 實驗組小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織VEGFmRNA 表達水平均明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。造模后第14、21 天, 兩組小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織VEGFmRNA 表達水平比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 兩組造模后第3、7、14、21天小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織勻漿VEGF蛋白表達水平比較 造模后第3、7 天, 實驗組小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織勻漿VEGF 蛋白表達水平均明顯高于對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。造模后第14、21 天,兩組小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織勻漿VEGF 蛋白表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表1 兩組造模后第3、7、14、21天小鼠皮膚創(chuàng)面創(chuàng)面肉芽組織VEGF mRNA表達水平比較

表1 兩組造模后第3、7、14、21天小鼠皮膚創(chuàng)面創(chuàng)面肉芽組織VEGF mRNA表達水平比較

注：與對照組比較, aP＜0.05, bP>0.05

組別 例數(shù) 第3天(n=10) 第7天(n=10) 第14 天(n=10) 第21天(n=10)對照組 40 1.98±0.23 1.99±0.20 1.36±0.23 1.16±0.28實驗組 40 2.45±0.40a 2.38±0.31a 1.46±0.28b 1.21±0.26b t 6.442 6.686 1.745 0.828 P <0.05 <0.05 0.05 0.05

表2 兩組小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織勻漿VEGF蛋白表達水平比較, pg/ml)

表2 兩組小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織勻漿VEGF蛋白表達水平比較, pg/ml)

注：與對照組比較, aP＜0.05, bP>0.05

組別 例數(shù) 第3天(n=10) 第7天(n=10) 第14 天(n=10) 第21天(n=10)對照組 40 112.48±14.60 122.13±18.99 80.18±12.94 71.06±14.08實驗組 40 132.89±17.94a 148.01±17.44a 85.52±13.76b 73.98±14.38b t 5.581 6.348 1.788 0.918 P <0.05 <0.05 0.05 0.05

3 討論

創(chuàng)面肉芽組織的形成對于創(chuàng)面愈合的程度有直接的影響, 是創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵步驟, 而肉芽組織的本質(zhì)是大量的毛細血管和豐富的成纖維細胞［3］。新生毛細血管網(wǎng)的形成具有極其重要的作用, 不僅為創(chuàng)面修復(fù)提供了所必需的氧及營養(yǎng)物質(zhì), 而且可以充實肉芽組織, 促進創(chuàng)面愈合［4］。VEGF 已被證實是血管發(fā)生過程中最重要調(diào)節(jié)因子, 具有促進血管生成、增加血管通透性、誘導(dǎo)間質(zhì)膠原酶和絲氨酸的蛋白酶表達等作用［5］。皮膚內(nèi)VEGF 主要分布在血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞的胞膜和胞質(zhì)中, 當(dāng)機體皮膚受到損傷后局部VEGF的表達即升高［6］。既往的研究顯示, 體表損傷后VEGF 的表達明顯升高, 在創(chuàng)傷的修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用［7］。

桂林西瓜霜含有西瓜霜、黃柏、鍛硼砂、甘草、山豆根、黃連、青黛、黃芩等成分, 具有清熱解毒、消腫止痛及一定的殺菌作用, 并兼顧滋陰、收斂、祛腐、生肌、化瘀、疏風(fēng)、燥濕等功能［8-10］。作者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)桂林西瓜霜噴劑對皮膚創(chuàng)面愈合有一定的促進作用。

本研究結(jié)果顯示, 造模后第3、7 天, 實驗組小鼠皮膚創(chuàng)面肉芽組織勻漿VEGF 蛋白表達水平均明顯高于對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示桂林西瓜霜可以在早期通過增強創(chuàng)面肉芽組織中VEGF 的表達促進創(chuàng)面微血管生成。桂林西瓜霜促進血管生成的作用, 可改善局部創(chuàng)面的微循環(huán),這一作用可能是其“活血化瘀”功效的一種表現(xiàn)；另一方面,新生毛細血管為肉芽組織的重要組成部分, 其生長加速可直接促進肉芽組織的新生, 此作用可能為其“生肌”作用的體現(xiàn)［11-13］。但桂林西瓜霜噴劑促進VEGF 表達的具體機制及通路仍需要進一步深入探討。

目前在創(chuàng)面修復(fù)再生領(lǐng)域的研究顯示, 許多治療皮膚創(chuàng)面的方法包括中醫(yī)外治法都顯示了較好的療效, 如回陽生肌膏、生肌象皮膏、生肌紅玉膏等都具有較好的促進創(chuàng)面愈合的效果, 但由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法存在價格昂貴、技術(shù)難度較高,而中藥方具有方劑的配制較為復(fù)雜等缺點, 使其在臨床上的使用和推廣都受到了一定的限制［14-18］。

綜上所述, 桂林西瓜霜噴劑使用方法簡單易行, 可直接作用于患處, 具有吸收好、止痛快、療程短、價格低廉的特點,研究為桂林西瓜霜噴劑應(yīng)用于皮膚創(chuàng)面的臨床治療提供了一定的理論依據(jù), 其應(yīng)用前景值得期待。