李樂晨 朱國忠 蘇秀娟,2 郭旺珍,*

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適于海島棉指紋圖譜構(gòu)建的SNP核心位點(diǎn)篩選與評(píng)價(jià)

李樂晨1朱國忠1蘇秀娟1,2郭旺珍1,*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 雜交棉創(chuàng)制教育部工程研究中心, 江蘇南京 210095;2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 新疆烏魯木齊 830052

海島棉具有纖維品質(zhì)好、抗病性強(qiáng)等優(yōu)異性狀, 不僅為紡織工業(yè)提供優(yōu)質(zhì)棉纖維原料, 也是陸地棉相關(guān)性狀改良的重要供體材料。然而, 與陸地棉相比, 開展海島棉的遺傳多樣性和基因分型研究相對(duì)較少。本研究基于CottonSNP80K芯片對(duì)282份不同來源的海島棉品種/材料進(jìn)行基因組SNP分型研究, 以選擇高效鑒別海島棉材料的核心位點(diǎn)組合。按照檢出率大于95%、具多態(tài)性、最小等位頻率(MAF)大于0.01、雜合率小于0.05、無冗余位點(diǎn)等條件篩選, 獲得2594個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)。對(duì)上述位點(diǎn)設(shè)置不同數(shù)目梯度篩選, 確定最優(yōu)核心位點(diǎn)數(shù)。隨著位點(diǎn)個(gè)數(shù)的增多, 位點(diǎn)組合對(duì)海島棉材料的識(shí)別率逐漸增加。當(dāng)位點(diǎn)數(shù)為200時(shí), 識(shí)別率為89%; 位點(diǎn)數(shù)提高到1500時(shí), 識(shí)別率可達(dá)99%。進(jìn)一步增加位點(diǎn)數(shù), 識(shí)別率無顯著變化。利用中選的1500個(gè)SNP位點(diǎn)檢測供試材料, 其平均MAF值0.14, 平均雜合率0.007, 平均多態(tài)信息含量0.21。SNP位點(diǎn)的聚丙烯凝膠電泳驗(yàn)證表明, SNP-PCR與芯片分型結(jié)果一致性達(dá)98.3%。本研究提供了適于海島棉指紋圖譜構(gòu)建、含1500位點(diǎn)的一套核心SNP位點(diǎn)組合, 可用于海島棉遺傳多樣性分析和品種身份鑒定。

基因芯片; DNA指紋圖譜; SNP; 海島棉

中國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國之一, 植棉歷史悠久[1]。棉花屬于錦葵科()棉屬(), 分為52個(gè)種, 包括非洲棉(,2= 26, A1)、亞洲棉(, 2= 26, A2)、陸地棉(, 2= 52, [AD]1)和海島棉(, 2= 52, [AD]2) 4個(gè)栽培種。海島棉也稱長絨棉, 原產(chǎn)于中美洲、南美洲和加勒比地區(qū)。20世紀(jì)50年代, 海島棉被引入中國, 在河南、江蘇、新疆等地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)種植[2]。20世紀(jì)80年代后, 海島棉主要在新疆地區(qū)種植。相較于陸地棉, 海島棉種植面積小, 占世界棉花產(chǎn)量的5%左右[3], 但其纖維優(yōu)質(zhì)細(xì)長, 以海島棉織造的衣服有極佳的觸感及良好的透氣性與吸汗力, 是生產(chǎn)高檔或特殊棉紡織品的首選[4]。此外, 海島棉還具有耐寒、耐旱、抗病和抗蟲等其他重要性狀[5], 常常被作為改良陸地棉農(nóng)藝性狀和提高抗性的供體親本。

中國的海島棉主要種植在新疆塔里木盆地和吐魯番盆地[6]。自20世紀(jì)50年代海島棉引種成功后, 育種家一直致力于引種、系統(tǒng)選擇、雜交育種等新品種培育研究, 選育出勝利1號(hào)、軍海1號(hào)、新海系列等海島棉品種50余個(gè), 有效服務(wù)了海島棉生產(chǎn)與市場需求, 也積累了較豐富的海島棉種質(zhì)資源[7-8]。然而, 在育種實(shí)踐中, 對(duì)海島棉種質(zhì)資源遺傳多樣性研究不多, 針對(duì)不同來源的種質(zhì)資源不能有效區(qū)分; 由于少數(shù)骨干親本使用, 新育成品種相對(duì)早期品種遺傳多樣性降低; 也存在“套牌”、亂雜現(xiàn)象, 阻礙了海島棉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。制定科學(xué)、可靠的品種鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn), 開展海島棉品種鑒定, 具有重要的科學(xué)和生產(chǎn)意義。

基于分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行棉花品種鑒定及遺傳多樣性分析, 在陸地棉中已有深入研究[9-10], 而海島棉品種/材料的基因分型及指紋圖譜構(gòu)建進(jìn)展相對(duì)緩慢。幾個(gè)代表性報(bào)道集中在利用SSR/SRAP標(biāo)記進(jìn)行不同來源海島棉材料遺傳多樣性分析。潘兆娥等[11]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)來自俄羅斯、埃及、美國、阿爾巴尼亞、中國等的56份海島棉種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。李金榮等[12]利用SSR標(biāo)記對(duì)14個(gè)新疆自育海島棉品種進(jìn)行了聚類分析。李武等[13]利用SRAP標(biāo)記, 對(duì)我國引入海島棉以來培育的36個(gè)國內(nèi)品種及20個(gè)國外品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。上述研究揭示出海島棉種質(zhì)資源總體上遺傳多樣性豐富, 但中國培育的海島棉品種遺傳基礎(chǔ)較為狹窄, 品種間平均相似系數(shù)較高。在大范圍品種鑒定過程中, 低通量的分子標(biāo)記技術(shù)具有較大局限性。

近年來, 海島棉基因組序列解析及應(yīng)用取得顯著進(jìn)展。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)結(jié)合海島棉和陸地棉F2分離群體重測序分析, 構(gòu)建含4,999,048個(gè)SNP位點(diǎn), 覆蓋4042 cM的超高密度SNP和SSR整合海陸遺傳圖譜, 并成功用于四倍體陸地棉基因組組裝及scaffolds方向及順序確定[14]?；谌蚪M測序分析, 溢達(dá)集團(tuán)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)分別公布了海島棉新海21及3-79的基因組框架信息[15-16]。這些研究為進(jìn)一步篩選適宜于海島棉不同基因型鑒定的高多態(tài)SNP位點(diǎn), 用于遺傳多樣性分析和品種身份鑒定奠定基礎(chǔ)。

本研究選擇不同來源的282份海島棉品種/材料, 利用實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的高密度棉花SNP芯片(CottonSNP80K)[17]開展基因分型研究。通過分析不同SNP位點(diǎn)遺傳多樣性信息, 篩選出一套高效用于海島棉品種/材料身份鑒定的SNP位點(diǎn)集合。該研究是我室基于全基因組篩選完成適于陸地棉品種身份鑒定的SNP核心位點(diǎn)組合后[18], 提供的適于另一個(gè)栽培四倍體棉種海島棉身份鑒定的SNP核心位點(diǎn)組合。該研究為開展海島棉遺傳多樣性分析、品種確權(quán)和保障育種者和消費(fèi)者權(quán)益提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海島棉品種/材料共282份(附表1)。其中16份早期國外引進(jìn)品種和中國自育品種由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所國家棉花種質(zhì)中期庫提供, 其余266份由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院蘇秀娟收集自交保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和質(zhì)量檢測 取新鮮的棉花嫩芽約0.1 g置1.5 mL離心管中, 采用CTAB法提取基因組DNA[19]。分離出的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳, DNA條帶明亮且單一, 表明DNA濃度高且沒有被降解。同時(shí)借助超微量分光光度計(jì)(One Drop-OD 1000)進(jìn)一步檢測DNA的質(zhì)量和濃度, OD260nm/OD280 nm在1.8~2.0之間代表DNA純度較高, 按照所示DNA濃度將每一樣品濃度均一化至100 ng μL–1。

1.2.2 SNP位點(diǎn)篩選 供試材料的SNP檢測與數(shù)據(jù)分析方法同朱國忠等[18]。經(jīng)CottonSNP80K芯片掃描的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入GenomeStudio軟件(V2011.1, Illumina, Inc.)進(jìn)行SNP分型。根據(jù)SNP位點(diǎn)特性確定篩選條件(位點(diǎn)檢出率大于95%, 最小等位基因頻率大于0.01, 雜合率小于0.05)獲得位點(diǎn)組合。進(jìn)一步利用位點(diǎn)篩選工具LociScan_V1.0對(duì)中選位點(diǎn)進(jìn)行梯度篩選, 基于R對(duì)不同梯度位點(diǎn)之間進(jìn)行相關(guān)性分析, 統(tǒng)計(jì)分析評(píng)價(jià)不同位點(diǎn)組合鑒定效率。LociScan_V1.0位點(diǎn)篩選軟件由北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心提供。

1.2.3 SNP結(jié)果驗(yàn)證 隨機(jī)選取12個(gè)核心位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)真實(shí)性驗(yàn)證。利用WebSNAPER (https://pga. mgh.harvard.edu/cgi-bin/snap3/websnaper3.cgi)進(jìn)行SNP特異引物設(shè)計(jì), 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。隨機(jī)選取芯片檢測具有多態(tài)性的材料進(jìn)行引物多態(tài)性的初步篩選, 利用篩選獲得的多態(tài)引物進(jìn)一步檢測10份不同來源的材料, 評(píng)價(jià)芯片的分型準(zhǔn)確率。設(shè)計(jì)作為內(nèi)標(biāo)對(duì)照, 檢測不同樣本模板PCR擴(kuò)增結(jié)果, 確保模板濃度的相對(duì)一致性。檢測的SNP-PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循環(huán)數(shù)為28; 72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)非變性PAGE電泳(恒壓200 V, 1.00~1.25 h), 通過銀染DNA顯帶, 記錄多態(tài)性數(shù)據(jù)。比較聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果與芯片分型結(jié)果, 計(jì)算其一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP位點(diǎn)特性評(píng)估

利用本研究室研發(fā)的高密度SNP芯片(Cotton SNP80K)[17]對(duì)282份不同來源的海島棉品種/材料進(jìn)行基因分型?；诜中徒Y(jié)果進(jìn)行位點(diǎn)檢出率、雜合率和多態(tài)性評(píng)估。CottonSNP80K中包含77,774個(gè)有效的SNP位點(diǎn)。通過對(duì)282份品種/材料的位點(diǎn)檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn), 芯片中完全未檢出的SNP位點(diǎn)有225個(gè), 占0.3%; 檢出率大于0.95的有72,138個(gè), 占92.8%, 其中檢出率為1的SNP位點(diǎn)有36,697個(gè)(圖1-A)。表明該芯片SNP位點(diǎn)對(duì)海島棉檢測效率高, SNP本身也顯示很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。SNP位點(diǎn)雜合率評(píng)估表明, 90.7%的位點(diǎn)(70,565)雜合率均小于0.05; 有5679個(gè)位點(diǎn)的雜合率大于0.5, 占7.3% (圖1-B)。這些位點(diǎn)的高雜合率可能是由于異源四倍體棉花A、D亞基因組間部分同源位點(diǎn)干擾造成。在77,774個(gè)SNP位點(diǎn)中, 有34,635 (44.5%)個(gè)SNP位點(diǎn)具有多態(tài)性。其中最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于0.01的位點(diǎn)有10,369個(gè), 占30.7% (圖1-C)。這可能是由于海島棉和陸地棉具有獨(dú)立進(jìn)化和馴化特征[20], 而該芯片主要側(cè)重于陸地棉種內(nèi)基因分型開發(fā), 對(duì)海島棉的基因型多態(tài)性分型效率比陸地棉低。

圖1 77,774個(gè)SNP位點(diǎn)特性評(píng)估

橫坐標(biāo)代表被統(tǒng)計(jì)的SNP特征參數(shù), 依次為位點(diǎn)檢出率(call frequency)、雜合率(heterozygosity)和最小等位基因頻率(minor allele frequency), 縱坐標(biāo)代表SNP的分布數(shù)目。

The abscissa represents statistical SNP characteristic parameters, including loci call frequency, heterozygosity, and minor allele frequency. The ordinate represents the number of SNPs.

2.2 核心SNP位點(diǎn)篩選和指紋圖譜構(gòu)建

基于對(duì)CottonSNP80K中77,774個(gè)SNP位點(diǎn)的特性評(píng)估, 確定用于基因型分型的位點(diǎn)篩選條件。(1)篩選檢出率大于95%的SNP位點(diǎn), 共72,138個(gè); (2)篩選MAF大于0.01的位點(diǎn), 獲7498個(gè); (3)篩選雜合率小于0.05的位點(diǎn), 余3245個(gè); (4)去除基因型相同的位點(diǎn), 獲2594個(gè)位點(diǎn)。利用2594個(gè)SNP位點(diǎn)組合, 其基因型檢出率為99.3%, 其中, 815個(gè)位點(diǎn)MAF大于0.2。

用LociScan_V1.0位點(diǎn)篩選工具對(duì)2594個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分層篩選。分別設(shè)置200、300、400、500、1000、1500、2000、2500共8種不同數(shù)量位點(diǎn), 進(jìn)行識(shí)別效率信息統(tǒng)計(jì)。在200~1500位點(diǎn)時(shí), 隨著位點(diǎn)個(gè)數(shù)的增多, 識(shí)別效率增加。當(dāng)位點(diǎn)為200時(shí), 識(shí)別率為89%; 當(dāng)位點(diǎn)為1500時(shí), 識(shí)別率為99%。當(dāng)位點(diǎn)超過1500時(shí), 識(shí)別率增長趨于平緩, 都穩(wěn)定在99%以上(表1)。對(duì)8種不同位點(diǎn)組合基于R進(jìn)行相關(guān)性分析(圖2), 8種不同位點(diǎn)組合兩兩之間值都小于0.001, 表明具有極顯著的線性相關(guān)。其中, 1500、2000和2500位點(diǎn)組合其相互間線性相關(guān)性最高。因此, 選擇1500位點(diǎn)作為適于海島棉指紋圖譜構(gòu)建的核心SNP位點(diǎn)組合。

表1 核心位點(diǎn)的分層篩選

利用1500個(gè)SNP位點(diǎn)組合檢測282份供試材料, 其平均MAF值0.14, 平均雜合率0.007, 平均多態(tài)信息含量0.21, 99%以上的海島棉材料能被有效區(qū)分。本研究分別選擇3組來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所國家棉花種質(zhì)中期庫和新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)自交保存的同名材料, 即3-79、Pima 1和新海5號(hào), 進(jìn)一步評(píng)估核心SNP位點(diǎn)組合的分辨力。結(jié)果表明, 不同來源的3-79基因型一致性為82.30%, 其17.70%的異質(zhì)性中, 97.3%由純合SNP位點(diǎn)差異造成; 不同來源的Pima 1基因型一致性為84.19%, 其15.81%的異質(zhì)性中, 99.58%由純合SNP位點(diǎn)差異造成; 不同來源的新海5號(hào)基因型一致性為91.67%, 其8.33%的異質(zhì)性中, 22.13%由雜合SNP位點(diǎn)差異造成。同名海島棉材料, 在不同單位、不同環(huán)境種植保存中, 由于天然突變或異交會(huì)導(dǎo)致基因型變化, 通過自交保存, 遺傳變異進(jìn)一步穩(wěn)定?；诤诵腟NP位點(diǎn)組合可有效鑒定親緣關(guān)系相近的材料間遺傳差異及穩(wěn)定性。

2.3 核心SNP位點(diǎn)準(zhǔn)確性驗(yàn)證

為驗(yàn)證核心SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性, 分別從海島棉四倍體A、D亞組中各隨機(jī)挑選6個(gè)SNP位點(diǎn)開發(fā)特異性SNP引物, 并選擇10份海島棉材料進(jìn)行基于PCR-PAGE電泳檢測SNP位點(diǎn)多態(tài)性和芯片分型結(jié)果一致性的驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示, 芯片分型結(jié)果與SNP-PCR一致性高達(dá)98.3% (表2和圖3), 進(jìn)一步證明這些核心SNP位點(diǎn)的可利用性和基于芯片SNP分型的準(zhǔn)確性。

3 討論

海島棉具有纖維品質(zhì)好、抗病等優(yōu)異性狀, 是高檔和特種棉紡織品的重要原料, 同時(shí), 作為優(yōu)異的供體材料, 被廣泛用于陸地棉纖維品質(zhì)、抗性等性狀改良。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和海島棉海7124為親本, 通過回交和分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建了一套陸地棉背景的海島棉染色體片段漸滲系。進(jìn)一步選育出背景單一、優(yōu)質(zhì)、抗病性表現(xiàn)突出的漸滲系材料, 用于改良陸地棉品種的纖維品質(zhì)和黃萎病抗性[21]。中國最早種植的海島棉, 是從埃及、美國、前蘇聯(lián)、蘇丹、秘魯?shù)葒N, 進(jìn)一步系統(tǒng)選育和雜交育種, 自主培育出的[22]。其中, 從“2依3”天然變異株中系選培育的“勝利1號(hào)”是中國第一個(gè)長絨棉品種[23]。從“9122依”天然變異單株中系選培育的“軍海1號(hào)”是中國長絨棉生產(chǎn)歷史上種植時(shí)間最長、推廣面積最大的海島棉品種[23]?！败姾?號(hào)”也是新疆海島棉育種的重要基礎(chǔ)種質(zhì), 后續(xù)選育的“新海”系列品種很多均有“軍海1號(hào)”的系譜, 也導(dǎo)致其遺傳相似性較高[23]。為有效區(qū)分不同海島棉品種, 鑒定其純度和真實(shí)性, 本研究選擇282份不同來源的海島棉品種/材料, 利用CottonSNP80K芯片進(jìn)行全基因組SNP分型分析, 獲得一套適于構(gòu)建海島棉材料指紋圖譜的SNP核心位點(diǎn)組合, 從DNA水平上為海島棉遺傳多樣性分析和材料鑒定提供依據(jù)。DNA指紋圖譜是指通過品種間的差異有效鑒別不同品種的圖譜, 具有多位點(diǎn)性、高變異性和穩(wěn)定的遺傳性。利用分子標(biāo)記技術(shù)開展棉花品種鑒定, 在陸地棉上已有系統(tǒng)深入的研究[9]。近年來, 基于基因組序列信息解析, SNP標(biāo)記被廣泛用于品種遺傳多樣性分析和品種身份鑒定。孫正文等[24]利用CottonSNP63K芯片篩選出393個(gè)基因組特異的SNP位點(diǎn)。朱國忠等[18]利用CottonSNP80K芯片, 篩選出含4857個(gè)SNP位點(diǎn), 高效鑒定陸地棉品種身份的核心SNP位點(diǎn)組合。與陸地棉相比, 基于全基因組的海島棉遺傳多樣性分析和品種身份鑒定相關(guān)研究還較缺乏。潘兆娥等[11]利用SSR標(biāo)記對(duì)56份海島棉進(jìn)行遺傳多樣性分析, 兩兩之間相似系數(shù)位于0.6~0.8之間。吳大鵬等[25]利用SSR標(biāo)記對(duì)4個(gè)不同國家20份海島棉進(jìn)行遺傳多樣性分析, 相似系數(shù)在0.66~0.94之間。這些研究表明, 育種進(jìn)程中, 海島棉遺傳基礎(chǔ)狹窄, 多數(shù)品種之間相似系數(shù)偏高, 品種資源的同質(zhì)化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。此外, 來源于不同單位不同環(huán)境種植的同名海島棉材料, 表現(xiàn)不同程度的異質(zhì)性。因此, 不同來源的海島棉材料需要進(jìn)一步從基因組水平上明確其遺傳多樣性和穩(wěn)定性, 為海島棉種質(zhì)資源有效利用提供依據(jù)。

圖2 核心位點(diǎn)分層篩選的相關(guān)性分析

對(duì)角線提供了不同位點(diǎn)下遺傳距離的分布; 下三角形(對(duì)角線的左下方)是不同類型SNP位點(diǎn)兩兩間的散點(diǎn)圖, 顯示出不同位點(diǎn)條件下的線性相關(guān)程度; 上三角形(對(duì)角線的右上方)數(shù)字表示不同類型SNP位點(diǎn)兩兩間的相關(guān)系數(shù), ***表示在0.001水平顯著相關(guān)。

The diagonal gives the distribution of genetic distances at different loci. The lower triangle (the lower left of the diagonal) is a scatter plot between the two types among different SNP loci combinations, which shows the degree of linear correlation under different loci combinations conditions. The upper triangle (the upper right of the diagonal) represents the correlation value between the two types among different SNP loci combinations. *** means the significance at the 0.001 level.

表2 SNP位點(diǎn)信息及驗(yàn)證結(jié)果

(續(xù)表2)

SNP標(biāo)記SNP marker染色體Chr.位置Position (bp)不匹配數(shù)目Unmatched No.引物Primer (5￠-3￠) TM58458D05527011300F: TTTTTATCTTTAAGGTCGCCGCATGTGACR: ACCGATTGATTTTAAAGTTCCAAAAGAGAAGTTTG TM73511D1064546040F: GGGCACCTATCTTCTCTACACCTAACCCTTGR: AGAGCCAAACAAATGCACCAAATAGGGT TM80347D1354109371F: ATCTATTCCCTTTTTGACCTTCTCGACCAAAR: AAAACAACACTGTTTCAGGTAAAAGCTGACCA TM80357D1354644130F: TGACATGTGTTTGACATATTTGGATATGGATCTGR: AATGAAACCAATTTTAAAAGACCAATGCCTAAAGA Ghhis3D034814901F: CGGTGGTGTGAAGAAGCCTCATR: AATTTCACGAACAAGCCTCTGGAA

圖3 基于SNP-PCR技術(shù)驗(yàn)證SNP位點(diǎn)芯片分型結(jié)果

M: DNA marker;: 內(nèi)標(biāo)對(duì)照; 1: 塔海901; 2: AW2046; 3: 農(nóng)科10; 4: K339; 5: C6020; 6: K146; 7: 農(nóng)科A16; 8: 司605; 9: 6--20; 10: AW2026。

M: DNA marker;: internal control; 1: Tahai 901; 2: AW2046; 3: Nongke 10; 4: K339; 5: C6020; 6: K146; 7: Nongke A16; 8: Si 605; 9: 6--20; 10: AW2026.

品種鑒定結(jié)果的可靠程度主要依賴于分子標(biāo)記的穩(wěn)定性和多態(tài)性[26], 使用低通量分子標(biāo)記進(jìn)行海島棉品種鑒定, 效率不高。隨著高通量測序和芯片技術(shù)的發(fā)展, 挖掘高質(zhì)量SNP位點(diǎn)組合為海島棉品種遺傳多樣性及身份鑒定提供了有效途徑。本研究通過CottonSNP80K芯片篩選獲得了2594個(gè)高效鑒別海島棉材料的SNP位點(diǎn), 且利用其中1500個(gè)位點(diǎn)即可對(duì)供試海島棉材料達(dá)到99%的識(shí)別率。這套SNP核心位點(diǎn)組合是用于海島棉指紋圖譜構(gòu)建和身份鑒定的首次報(bào)道, 將為海島棉遺傳多樣性分析、品種身份鑒定和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與利用提供技術(shù)支撐。

SNP指紋圖譜的構(gòu)建方式也與SNP檢測分型技術(shù)相關(guān), SNP檢測分析方法有很多種。以凝膠電泳檢測為基礎(chǔ)的檢測技術(shù), 包括等位基因特異性PCR[27]和單鏈構(gòu)象多態(tài)性[28], 具有檢測效率高、成本低的優(yōu)勢, 已廣泛使用。該技術(shù)主要通過在正向引物的3￠端引入錯(cuò)配堿基設(shè)計(jì)等位基因特異引物, 從而降低變異位點(diǎn)的產(chǎn)物擴(kuò)增效率。由于模板濃度、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、退火溫度、錯(cuò)配堿基數(shù)目和類型以及不同SNP位點(diǎn)的側(cè)翼序列等因素影響, SNP-PCR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生部分非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。Drenkard等[29]通過大量的擬南芥SNP擴(kuò)增分析, 發(fā)現(xiàn)超過1000倍的模板濃度差異和10個(gè)PCR循環(huán)數(shù)差異會(huì)對(duì)部分非特異等位基因的擴(kuò)增效率產(chǎn)生較大影響, 同時(shí)SNP旁側(cè)序列會(huì)影響等位基因特異引物設(shè)計(jì)。本研究通過控制相同模板濃度和統(tǒng)一PCR程序獲得有效區(qū)分SNP位點(diǎn)的引物。在相同PCR擴(kuò)增條件下, 使用內(nèi)標(biāo)檢測不同模板PCR擴(kuò)增結(jié)果, 以確保模板濃度的相對(duì)一致性。此外, 本研究也選擇2個(gè)SNP位點(diǎn)(TM20245, TM53439)在多態(tài)性樣本材料中進(jìn)行測序驗(yàn)證, 證實(shí)該SNP多態(tài)位點(diǎn)在不同海島棉材料中存在的真實(shí)性。基于上述結(jié)果, 盡管部分SNP-PCR引物會(huì)產(chǎn)生低擴(kuò)增效率的PCR產(chǎn)物, 在PCR-PAGE電泳檢測時(shí)顯現(xiàn)較弱的擴(kuò)增條帶, 但在檢測條件一致的情況下, 特異性強(qiáng)帶和非特異性弱帶易于區(qū)分, 不影響檢測結(jié)果的真實(shí)性。

隨著技術(shù)發(fā)展, 基于直接測序法、基因芯片技術(shù)[30]和競爭性等位基因特異性PCR[31]等檢測方法已有效用于高通量的SNP分型研究。本實(shí)驗(yàn)核心位點(diǎn)的梯度篩選分析表明, 200個(gè)SNP位點(diǎn)就可以達(dá)到89%的識(shí)別率, 對(duì)于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的海島棉品種, 可以選用這200個(gè)SNP位點(diǎn)集合, 使用KASP或定點(diǎn)測序?qū)ζ渖矸蓁b定; 對(duì)于親緣關(guān)系較近的品種, 需要采用高密度SNP位點(diǎn)集合結(jié)合基因芯片技術(shù)高通量鑒定, 本研究報(bào)道的含1500位點(diǎn)的SNP組合可用于其特異性分析。隨著海島棉基因組測序和重測序研究的進(jìn)一步開展, 未來可以結(jié)合新的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)一步改進(jìn)和完善, 形成高效繪制海島棉指紋圖譜的位點(diǎn)組合。

4 結(jié)論

基于CottonSNP80K芯片的分型結(jié)果, 綜合考慮位點(diǎn)多態(tài)性、雜合率、準(zhǔn)確性、高通量等參數(shù), 篩選出適于海島棉指紋圖譜構(gòu)建、含1500位點(diǎn)的一套核心SNP位點(diǎn)組合, 可實(shí)現(xiàn)海島棉品種及資源材料的身份鑒定。

附表 請見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.china-crops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

[1] Dai J, Dong H. Intensive cotton farming technologies in China: achievements, challenges and counter measures., 2014, 155: 99–110.

[2] 汪志國, 王思明. 美棉在中國的引種與發(fā)展. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2006, 22: 421–426. Wang Z G, Wang S M. Introduction and development of American cotton in China., 2006, 22: 421–426 (in Chinese with English abstract).

[3] 宋憲亮, 孫學(xué)振, 張?zhí)煺? 王洪剛. 棉花遺傳多態(tài)性研究進(jìn)展. 西北植物學(xué)報(bào), 2004, 24: 2393–2397. Song X L, Sun X Z, Zhang T Z, Wang H G. Advances on genetic diversity of cotton ()., 2004, 24: 2393–2397 (in Chinese with English abstract).

[4] 姚賀盛, 張亞黎, 易小平, 薛軍, 羅毅, 羅宏海, 張旺鋒. 海島棉和陸地棉葉片光合特性、冠層結(jié)構(gòu)及物質(zhì)生產(chǎn)的差異. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48: 251–261. Yao H S, Zhang Y L, Yi X P, Xu J, Luo Y, Luo H H, Zhang W F. Study on differences in comparative canopy structure characteristics and photosynthetic carbon assimilation of field-grown pima cotton () and upland cotton ()., 2015, 48: 251–261 (in Chinese with English abstract).

[5] Liu N, Tu L L, Tang W X, Gao W H, Lindsey K, Zhang X L. Small RNA and degradome profiling reveals a role for miRNAs and their targets in the developing fibers of., 2014, 80: 331–344.

[6] 孔慶平. 我國海島棉生產(chǎn)概況及比較優(yōu)勢分析. 中國棉花. 2002, 29(12): 19–23. Kong Q P. Analysis on the situation and comparative advantages of island cotton production in China., 2002, 29 (12): 19–23 (in Chinese).

[7] 劉霞, 白玉林, 王繹衡, 杜斌, 楊勇, 王承強(qiáng), 李小童. 海島棉育種現(xiàn)狀、未來方向以及生產(chǎn)建議. 中國棉花, 2015, 42(10): 11–13. Liu X, Bai Y L, Wang Y H, Du B, Yang Y, Wang C Q, Li X T. Breed situation, future development direction and production suggest of sea island cotton in China., 2015, 42(10): 11–13 (in Chinese).

[8] 邰紅忠, 練文明, 盧金寶. 新疆海島棉育種現(xiàn)狀及存在問題. 中國棉花, 2013, 40(6): 15–17. Tai H Z, Lian W M, Lu J B. Current situation and problems in island cotton breeding in Xinjiang., 2013, 40(6): 15–17 (in Chinese).

[9] Kuang M, Wei S J, Wang Y Q, Zhou D Y, Ma L, Fang D, Yang W H. Development of a core set of SNP markers for the identification of upland cotton cultivars in China., 2016, 15: 954–962.

[10] Sheidai M, Riazifar M, Hoordadian A, Alishah O. Genetic finger printing of salt- and drought-tolerant cotton cultivars () by IRAP-REMAP and SRAP molecular markers., 2018, 14: 12–19.

[11] 潘兆娥, 何守樸, 賈銀華, Podolnaya L P, 孫君靈, 王立如, 杜雄明. 引進(jìn)海島棉種質(zhì)的SSR遺傳多樣性分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2014, 15: 399–404. Pan Z E, He S P, Jia Y H, Podolnaya L P, Sun J L, Wang L R, Du X M. Genetic diversity analysis of the sea island cotton introduced using SSR markers., 2014, 15: 399–404 (in Chinese with English abstract).

[12] 李金榮, 王小國, 朱永軍, 張西英, 張薇. 利用SSR標(biāo)記對(duì)14個(gè)海島棉品種的聚類分析. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 46: 237–241. Li J R, Wang X G, Zhu Y J, Zhang X Y, Zhang W. Cluster analysis on 14 sea-island cotton by SSRs., 2009, 46: 237–241 (in Chinese with English abstract).

[13] 李武, 倪薇, 林忠旭, 張獻(xiàn)龍. 海島棉遺傳多樣性的SRAP標(biāo)記分析. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34: 893–898. Li W, Ni W, Lin Z X, Zhang X L. Genetic diversity analysis of sea-island cotton cultivars using SRAP markers., 2008, 34: 893–898 (in Chinese with English abstract).

[14] Wang S, Chen J D, Zhang W P, Hu Y, Chang L J, Fang L, Wang Q, Lü F N, Wu H T, Si Z F, Chen S Q, Cai C P, Zhu X F, Zhou B L, Guo W Z, Zhang T Z. Sequence-based ultra-dense genetic and physical maps reveal structural variations of allopolyploid cotton genomes., 2015, 16, doi: 10.1186/s13059-015- 0678-1.

[15] Liu X, Zhao B, Zheng H J, Hu Y, Lu G, Yang C Q, Chen J D, Chen J J, Chen D Y, Zhang L, Zhou Y, Wang L J, Guo W Z, Bai Y L, Ruan J X, Shangguan X X, Mao Y B, Shan C M, Jiang J P, Zhu Y Q, Jin L, Kang H, Chen S T, He X L, Wang R, Wang Y Z, Chen J, Wang L J, Yu S T, Wang B Y, Wei J, Song S C, Lu X Y, Gao Z C, Gu W Y, Deng X, Ma D, Wang S, Liang W H, Fang L, Cai C P, Zhu X F, Zhou B L, Chen Z J, Xu S H, Zhang Y G, Wang S Y, Zhang T Z, Zhao G P, Chen X Y.genome sequence provides insight into the evolution of extra-long staple fiber and specialized metabolites., 2015, 5, doi: 10.1038/srep14139.

[16] Yuan D J, Tang Z H, Wang M J, Gao W H, Tu L L, Jin X, Chen L L, He Y H, Zhang L, Zhu L F, Li Y, Liang Q Q, Lin Z X, Yang X Y, Liu N A, Jin S X, Lei Y, Ding Y H, Li G L, Ruan X A, Ruan Y J, Zhang X L. The genome sequence of Sea-Island cotton () provides insights into the allopolyploidization and development of superior spinnable fibres., 2015, 5, doi: 10.1038/srep17662.

[17] Cai C P, Zhu G Z, Zhang T Z, Guo W Z. High-density 80 K SNP array is a powerful tool for genotypingaccessions and genome analysis.s, 2017, 18, doi: 10.1186/s 12864-017-4062-2.

[18] 朱國忠, 張芳, 付潔, 李樂晨, 牛二利, 郭旺珍. 適于陸地棉品種身份鑒定的SNP核心位點(diǎn)篩選與評(píng)價(jià). 作物學(xué)報(bào), 2018, 44: 1631–1639. Zhu G Z, Zhang F, Fu J, Li L C, Niu E L, Guo W Z. Genome-wide screening and evaluation of SNP core loci for identification of upland cotton varieties., 2018, 44: 1631–1639 (in Chinese with English abstract).

[19] Zhang J, Stewart J M. Economical and rapid method for extracting cotton genomic DNA., 2000, 4: 193–201.

[20] Fang L, Gong H, Hu Y, Liu C X, Zhou B L, Huang T, Wang Y K, Chen S Q, Fang D D, Du X M, Chen H, Chen J D, Wang S, Wang Q, Wan Q, Liu B L, Pan M, Chang L J, Wu H T, Mei G F, Xiang D, Li X H, Cai C P, Zhu X F, Chen Z J, Han B, Chen X Y, Guo W Z, Zhang T Z, Huang X H. Genomic insights into divergence and dual domestication of cultivated allotetraploid cottons., 2017, 18, doi: 10.1186/s13059-017-1167-5

[21] Wang P, Ding Y Z, Lu Q X, Guo W Z, Zhang T Z. Development ofchromosome segment substitution lines in the genetic standard line TM-1 of., 2008, 53: 1512–1517.

[22] 馬麒, 宿俊吉, 寧新柱, 李吉蓮, 劉萍, 陳紅, 林海, 鄧福軍. 新疆海島棉種質(zhì)資源表型性狀遺傳多樣性分析. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 53: 197–206. Ma Q, Su J J, Ning X Z, Li J L, Liu P, Chen H, Lin H, Deng F J. Genetic diversity analysis on phenotypic traits of sea island cotton () germplasm resources in Xinjiang., 2016, 53: 197–206 (in Chinese with English abstract).

[23] 李劍峰. 中國長絨棉研究與生產(chǎn)概況. 江西棉花, 2008, 30(3): 8–11. Li J F. Survey of long-staple cotton research and production of China., 2008, 30(3): 8–11 (in Chinese with English abstract).

[24] 孫正文, 匡猛, 馬峙英, 王省芬. 利用CottonSNP63K芯片構(gòu)建棉花品種的指紋圖譜. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50: 4692–4704. Sun Z W, Kuang M, Ma Z Y, Wang S F. Construction of cotton variety fingerprints using CottonSNP63K array., 2017, 50: 4692–4704 (in Chinese with English abstract).

[25] 吳大鵬, 房嫌嫌, 馬夢楠, 陳進(jìn)紅, 祝水金. 四個(gè)國家海島棉品種資源的親緣關(guān)系和遺傳多態(tài)性研究. 棉花學(xué)報(bào), 2010, 22: 104–109. Wu D P, Fang X X, Ma M N, Chen J H, Zhu S H. Genetic relationship and diversity of the germplasms inL. from four different countries using SSR markers., 22: 104–109 (in Chinese with English abstract).

[26] Ghislain M, Zhang D, Fajardo D, Huamán Z, Hijmans R J. Marker-assisted sampling of the cultivatedcollection using RAPD markers., 1999, 46: 547–555.

[27] Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. Allele-specific polymerase chain reaction: a method for amplification and sequence determination of a single component among a mixture of sequence variants., 1991, 192: 82–84.

[28] Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction., 1989, 5: 874–879.

[29] Drenkard E, Richter B G, Rozen S, Stutius L M, Angell N A, Mindrinos M, Cho R J, Oefner P J, Davis R W, Ausubel F M. A simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis., 2000, 124: 1483–1492.

[30] Schmalzing D, Belenky A, Novotny M A, Koutny L, Salas-Solano O, EI-Difrawy S, Adourian A, Matsudaira P, Ehrlich D. Microchip electrophoresis: a method for high-speed SNP detection., 2000, 28: e43.

[31] Semagn K, Babu R, Hearne S, Olsen M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement., 2014, 33: 1–14.

Genome-wide screening and evaluation of SNP core loci for fingerprinting construction of cotton accessions ()

LI Le-Chen1, ZHU Guo-Zhong1, SU Xiu-Juan1,2, and GUO Wang-Zhen1,*

1State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement, Hybrid Cotton R&D Engineering Research Center (the Ministry of Education), Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China;2College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China

Sea-island cotton (), characterized by its extra-long staple (ELS), strong and fine fibers, and disease resistance, provides important natural fiber for textile industry, also key donor for improving agronomic traits of upland cotton. However, compared to, there are few studies on genetic diversity and genotyping in. To obtain the SNP core loci for fingerprinting construction of sea-island cotton accessions, we performed SNP genotyping within 282 accessions using the CottonSNP80K array. A total of 2594 high-quality SNP loci were obtained based on the selective criteria of call frequency for each locus > 0.95, loci with polymorphism, minor allele frequency (MAF) > 0.01, heterozygosity rate < 0.05, and the removal of same genotype. Further, the number of optimized core loci was screened by gradients analysis. With the number of loci increasing, the discrimination ability of the sea-island cotton accessions increased gradually. When the loci were 200, the recognition rate was 89%, and when the number of the loci increased to 1500, the recognition rate was 99%. When the loci were further increased, no significantly improved recognition rate was detected. Based on the detection using the 1500 core loci combination, the average MAF value was 0.14, the average heterozygosity rate was 0.007, and the average polymorphism information content was 0.21. The polyacrylamide gel electrophoresis for the core SNP loci verified the consistency as high as 98.3% between SNP-PCR and chip genotyping. This study provides a set of core SNP loci suitable for constructing fingerprinting of sea-island cotton accessions, which can be used for genetic diversity analysis and fingerprinting identification of sea-island cotton.

gene array; DNA fingerprint; SNP; sea-island cotton

2018-09-20;

2019-01-12;

2019-02-19.

10.3724/SP.J.1006.2019.84123

郭旺珍, E-mail: moelab@njau.edu.cn

E-mail: 2017101076@njau.edu.cn

本研究由國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0102000)和江蘇現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心(No. 10)項(xiàng)目資助。

This study was supported by the National Key R&D Program for Crop Breeding (2017YFD0102000) and Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production Project (No.10).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190218.0903.002.html