尚麗娜 陳新龍 米勝南 委 剛 王 玲 張雅怡 雷 霆 林永鑫 黃蘭杰 朱美丹 王 楠

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水稻溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體的表型鑒定與基因定位

尚麗娜**陳新龍**米勝南 委 剛 王 玲 張雅怡 雷 霆 林永鑫 黃蘭杰 朱美丹 王 楠*

西南大學(xué)水稻研究所/ 西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715

水稻溫敏型葉色突變體是研究植物光合作用、葉綠體結(jié)構(gòu)和功能以及溫度影響葉綠體發(fā)育的理想材料。利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變秈型水稻(L.)三系保持系西農(nóng)1B, 從其后代中篩選到一個(gè)突變性狀穩(wěn)定遺傳的溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體()。與野生型相比,突變表型受溫度影響, 22°C條件下萌發(fā)的野生型幼苗表型正常, 而幼苗完全白化, 且約40%白化苗死亡, 存活白化苗的光合色素含量、光合速率均顯著降低, 成熟期主要農(nóng)藝性狀均顯著變劣; 在28°C下萌發(fā)的幼苗葉片呈淺綠色并伴有白條紋, 其光合色素含量顯著降低, 光合速率及主要農(nóng)藝性狀差異較小; 32°C下萌發(fā)的幼苗葉片無明顯差異。透射電鏡觀察顯示, 與野生型相比,在22°C下葉肉細(xì)胞中無葉綠體或存在異常發(fā)育葉綠體(尚未分化出基粒和基層), 在28°C下部分葉肉細(xì)胞含少量發(fā)育完整的葉綠體, 在32°C下葉肉細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)均正常。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析表明, 與野生型相比,突變體中部分光合色素代謝途徑基因、葉綠體發(fā)育相關(guān)基因及光合作用相關(guān)基因的表達(dá)水平呈不同程度變化。遺傳分析表明,突變表型受一對(duì)隱性核基因控制,被定位于第5染色體SSR標(biāo)記S5-57和S5-119之間, 物理距離為718 kb。本研究為水稻遺傳改良及研究溫度影響葉綠體發(fā)育機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

水稻(L.); 溫敏; 白化轉(zhuǎn)綠; 葉綠體超微結(jié)構(gòu); 基因定位

葉色突變常表現(xiàn)為黃化、黃綠、淺綠、白化、條紋、白翠、斑馬葉等多種類型[1]。葉色突變體是研究高等植物光合作用機(jī)制、葉綠體發(fā)育、葉綠體結(jié)構(gòu)與功能以及光合色素生物合成與降解等方面的理想材料[2]。溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體白化表型受溫度誘導(dǎo), 在特定溫度下可逐漸恢復(fù)綠色, 常被用作雜交育種中的標(biāo)記性狀。因此, 對(duì)水稻溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體的鑒定及基因定位有助于水稻的遺傳改良, 也為研究葉綠體的發(fā)育機(jī)制提供線索。

近年來, 水稻中已克隆了一些白化轉(zhuǎn)綠基因, 如()、()、-()、、、、和等[3-10], 其功能主要涉及光合色素代謝途徑及葉綠體發(fā)育調(diào)控?；?)編碼一個(gè)三角狀五肽重復(fù)區(qū)(PPR)蛋白, 其突變體幼苗在低溫下失綠, 隨溫度升高逐漸恢復(fù)綠色[3]; 基因()編碼一個(gè)葉綠體蛋白合成延伸因子Tu, 是葉綠體發(fā)育相關(guān)基因, 突變體在三葉期為白化葉, 從四葉期逐漸轉(zhuǎn)為淡綠葉[4]; 基因-()編碼一個(gè)IMMUTANTS(IM)蛋白, 參與葉綠體電子傳遞鏈和光合色素的生物合成等途徑, 突變體在三葉期之前完全白化, 隨后轉(zhuǎn)綠, 白化轉(zhuǎn)綠表型受生長發(fā)育和溫度調(diào)控[5]; 基因編碼一個(gè)RNA特異性結(jié)合蛋白NUS1, 參與葉綠體RNA的代謝調(diào)控過程, 控制關(guān)鍵質(zhì)體基因的表達(dá)時(shí)間, 功能缺失突變體在低溫下葉綠體的翻譯和轉(zhuǎn)錄能力受到嚴(yán)重抑制[6]; 基因編碼一個(gè)新型鳥苷酸激酶(GK), 定位于質(zhì)體及線粒體上, 參與葉綠體發(fā)育時(shí)期與細(xì)胞核之間的信號(hào)傳輸途徑, 功能缺失突變體葉綠體不能正常分化[7]; 基因和分別編碼核糖核酸還原酶(RNR)的大亞基RNRL1和小亞基RNRS1, RNR調(diào)節(jié)DNA合成和修復(fù)過程中脫氧核糖核苷酸的產(chǎn)生速率, RNR活性是葉綠體生物合成所必需[8]; 基因編碼一個(gè)定位于葉綠體上的PPR蛋白,在三葉期之前為白化表型, 隨后逐漸恢復(fù)正常葉色[9]; 基因編碼一個(gè)定位在葉綠體上的磷酸核糖胺-甘氨酸連接酶, 參與嘌呤核苷酸的生物合成,突變體的白化葉片從苗期至成熟期逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色[10]。

盡管如此, 目前關(guān)于水稻溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠的分子機(jī)理尚不明確。本研究利用EMS誘變秈型三系保持系西農(nóng)1B, 獲得一個(gè)新的溫敏型白化轉(zhuǎn)綠突變體, 暫命名為, 并對(duì)該突變體進(jìn)行不同溫度下的表型分析、葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察以及相關(guān)基因表達(dá)分析等研究, 將定位于第5染色體短臂SSR分子標(biāo)記S5-57和S5-119之間, 物理距離為718 kb, 為該基因的克隆及功能分析奠定基礎(chǔ), 為探索溫度影響葉綠體發(fā)育機(jī)制提供良好的研究材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

西農(nóng)1B是西南大學(xué)水稻研究所選育的優(yōu)良秈型三系保持系, 經(jīng)化學(xué)誘變劑EMS處理, 獲得水稻溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體, 連續(xù)多代自交表明, 白化轉(zhuǎn)綠性狀已穩(wěn)定遺傳。2015年, 以表型正常的秈型兩系不育系西大1S為母本,為父本, 配制西大1S/雜交組合, 收獲F1代種子, 同年在海南種植F1代, F1自交構(gòu)建F2群體。2016年3月下旬, 在西南大學(xué)水稻研究所分別種植親本和F2群體, 按常規(guī)管理田間材料。利用F1群體和F2分離群體進(jìn)行遺傳分析, 于水稻苗期用F2中的隱性單株進(jìn)行基因 定位。

1.2 表型及農(nóng)藝性狀分析

分別在不同溫度(22°C、28°C和32°C)的光照培養(yǎng)箱(8 h黑暗/16 h光照)中培養(yǎng)野生型和突變體, 觀察幼苗表型。分別于2016年3月下旬(田間日均氣溫約22°C)和2016年5月中旬(田間日均氣溫約28°C)在田間播種野生型西農(nóng)1B及突變體, 并于苗期移栽至大田種植, 株行距20 cm × 30 cm, 從苗期至成熟期對(duì)其進(jìn)行葉齡標(biāo)記及表型分析, 并于成熟期從種植小區(qū)中部隨機(jī)各取10株, 考察株高、穗長、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀, 進(jìn)行測(cè)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 光合特性的測(cè)定

于孕穗期, 選取長勢(shì)良好且一致的野生型及突變體單株各5株, 在晴天上午9:00—11:00利用LI- 6400型便攜式光合測(cè)定儀測(cè)定其凈光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度等光合特性參數(shù), 每個(gè)單株重復(fù)測(cè)定5次, 取平均值, 進(jìn)行測(cè)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 不同溫度下光合色素含量的測(cè)定

在光照培養(yǎng)箱(8 h黑暗/16 h光照)中培養(yǎng)不同溫度(22°C、28°C和32°C)條件下萌發(fā)后22 d的野生型西農(nóng)1B和突變體幼苗, 對(duì)不同溫度下的野生型倒一葉混合取樣, 不同溫度下的突變體分別取樣, 各取6株, 測(cè)定其光合色素含量。混合稱取0.1 g葉片并剪碎裝入50 mL離心管, 加25 mL 95%酒精, 封口避光放置24~48 h, 期間搖動(dòng)數(shù)次充分提取光合色素, 每個(gè)樣品重復(fù)3次。用BECKMAN COULTER- DU720型分光光度計(jì)測(cè)定提取液在663 nm、645 nm和470 nm波長下的吸光值, 參考Lichtenthaler的方法[11], 根據(jù)公式計(jì)算各光合色素含量, 取平均值作圖, 進(jìn)行測(cè)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

葉綠素含量(Chl)＝(12.21 ×D663?2.81 × D645) ×V/(1000 FW)

葉綠素含量(Chl)＝(20.13 × D645?5.03 × D663) ×V/(1000 FW)

總?cè)~綠素含量(Total Chl)＝(17.32 × D645+7.18 × D663)×V/(1000 FW)

類胡蘿卜素含量(Car)＝(1000×D470?3.27×Chl?104×Chl)/229×V/(1000 FW)

公式中OD663、OD645和OD470分別為萃取液在663 nm、645 nm和470 nm波長下的吸光值; V為萃取液體積(mL); FW為鮮重(g); 單位為mg g–1FW。

1.5 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

分別選取不同溫度(22°C、28°C和32°C)條件下萌發(fā)后22 d的野生型西農(nóng)1B和突變體倒一葉相同部位, 觀察葉肉細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)。同時(shí)將22°C和28°C下萌發(fā)后22 d不同白化程度的幼苗分別移至不同溫度(22°C、28°C和32°C)下繼續(xù)培養(yǎng)10 d, 觀察并分析植株移栽前后葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化。剪取大小約5 mm×10 mm的葉片置含有2.5%戊二醛的磷酸緩沖液(PBS)中, 抽真空后于4°C固定4 h;以PBS緩沖液沖洗3次, 每次10 min, 1%鋨酸固定2 h (4°C); 再用PBS緩沖液沖洗3次, 每次10 min; 分別用30%、50%、70%、90%、100%和100%的乙醇逐級(jí)脫水, 每級(jí)10 min; 用Epon8 12環(huán)氧樹脂進(jìn)行樣品包埋; 置37°C、45°C、65°C恒溫箱中固化, 每級(jí)溫度24 h; 用UltracutE超薄切片機(jī)切片, 經(jīng)醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色后, 在JEOL公司生產(chǎn)的JEM- 1200EX型透射電鏡下觀察葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.6 基因組DNA的提取與PCR擴(kuò)增

選取水稻苗期新鮮葉片按改良的CTAB法[12]提取親本、基因池及F2群體的基因組DNA用于基因定位。PCR總體系11.9 μL, 包括1.0 μL 100 ng μL–1模板DNA、1.0 μL 10 μmol L–1引物、0.5 μL 2.5 mmol L–1dNTPs、1.25 μL 10×PCR buffer、0.75 μL 25 mmol L–1MgCl2、7.3 μL ddH2O和0.1 μL 5 U μL–1rDNA聚合酶。PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3 min; 94°C變性30 s, 55~60°C退火30 s, 72°C延伸30 s, 35~40個(gè)循環(huán); 72°C終延伸10 min。

1.7 總RNA的提取與qRT-PCR

選取相同生育期野生型和突變體葉片相同部位提取植物總RNA, 總RNA提取純化試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit由Takara生物公司生產(chǎn)。在Applied Biosystems公司7500 Real-time PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR, 以基因?yàn)閮?nèi)參基因, 按2–ΔΔCt方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量, 每個(gè)樣品重復(fù)3次。qRT-PCR相關(guān)引物均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.8 分子標(biāo)記的開發(fā)與基因定位

采用BSA法[13]定位目標(biāo)基因, 從西大1S/的F2群體中選取10株正常單株和10株葉片白化單株, 剪取等量葉片, 構(gòu)建正?；虺睾屯蛔兓虺?。參照已開發(fā)的400余對(duì)均勻分布于水稻各染色體的SSR分子標(biāo)記, 利用http://www.gramene.org/microsat數(shù)據(jù)庫和Vector NTI Advance 10軟件開發(fā)新的SSR分子標(biāo)記, 并送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成引物。通過PCR擴(kuò)增和10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性分析及連鎖分析, 篩選出兩個(gè)親本(西大1S和)的多態(tài)性分子標(biāo)記, 再利用該標(biāo)記分析正常基因池與突變基因池之間的多態(tài)性, 對(duì)可能與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行34株F2隱性單株驗(yàn)證, 在確定該分子標(biāo)記連鎖后, 再在連鎖標(biāo)記附近尋找多態(tài)性分子標(biāo)記用于基因初步定位, 待連鎖區(qū)間確定后, 進(jìn)一步開發(fā)新的多態(tài)性分子標(biāo)記, 用于基因精細(xì)定位。

1.9 遺傳圖譜構(gòu)建

在用于基因定位的西大1S/的F2群體中, 將顯示西大1S帶型的單株標(biāo)記為, 顯示帶型的單株標(biāo)記為, 顯示雜合帶型的單株標(biāo)記為。根據(jù)公式[(2)2]×100計(jì)算遺傳距離并構(gòu)建連鎖圖譜, 其中表示定位群體中出現(xiàn)雜合體帶型單株的數(shù)量,表示出現(xiàn)正常株帶型的單株數(shù),表示用于定位的隱性群體總株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型與農(nóng)藝性狀分析和光合特性測(cè)定

田間種植野生型和突變體時(shí)發(fā)現(xiàn), 在不同田間溫度下分批播種的突變體表型、光合參數(shù)及主要農(nóng)藝性狀均存在較大差異。在田間日均氣溫22°C時(shí)(3月下旬)播種的野生型植株在整個(gè)生育期正常發(fā)育, 而突變體在苗期表現(xiàn)為葉片完全白化, 并有40%逐漸死亡, 存活下來的也生長緩慢, 長勢(shì)較弱(圖1-A, G); 隨著葉齡增加, 突變體先抽出的葉片從葉尖向葉基部逐漸恢復(fù)綠色, 在分蘗期,其倒四葉為淺綠色, 倒三葉和倒二葉是帶有白色條紋的淺綠色, 倒一葉仍表現(xiàn)完全白化(圖1-B, H); 剛進(jìn)入成熟期時(shí), 突變體的倒四葉、倒三葉及倒二葉均為淺綠色, 倒一葉也逐漸恢復(fù)淺綠色(圖1-C, I)。在田間日均氣溫28°C時(shí)(5月中旬)播種的野生型植株各葉片一直處于正常表型, 而突變體葉片在苗期表現(xiàn)為帶有白色條紋的淺綠色葉片(圖1-D, J); 在分蘗期, 突變體主分蘗略顯白化, 其余分蘗各葉片均接近野生型葉色(圖1-E, K); 在成熟期, 突變體的倒一葉至倒四葉葉色與野生型無明顯差異(圖1-F, L)。葉片光合參數(shù)測(cè)定表明, 與野生型相比, 22°C下播種的突變體葉片的凈光合速率極顯著降低, 是野生型的58.02% (圖2-A), 氣孔導(dǎo)度和細(xì)胞間CO2濃度極顯著升高, 分別是野生型的236.67%和134.96% (圖2-B, C), 蒸騰速率略微升高, 但未達(dá)到顯著水平(圖2-D), 而28°C下播種的突變體葉片各光合參數(shù)均接近野生型(圖2)。農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果顯示, 與野生型相比, 22°C下播種的突變體的株高、分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率均極顯著降低, 分別為野生型的66.50%、45.00%、39.47%、56.52%、30.48%和53.92% (圖3-A, C~F, H), 其穗長和千粒重略低于野生型, 分別為野生型的85.17%和87.57% (圖3-B, G);而28°C下播種的突變體的株高、穗長、千粒重和結(jié)實(shí)率均接近野生型(圖3-A, B, G, H), 僅分蘗數(shù)、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和每穗實(shí)粒數(shù)與野生型存在顯著差異, 分別為野生型的77.78%、75.00%、86.67%和78.15% (圖3-C~F)。

圖1 野生型(WT)和突變體tsa2的表型特征

A, B, C: 田間日均氣溫22°C時(shí)播種的野生型(WT)和突變體的苗期(A)、分蘗期(B)和成熟期(C)植株; D, E, F: 田間日均氣溫28°C時(shí)播種的野生型(WT)和突變體的苗期(D)、分蘗期(E)和成熟期(F)植株; G, H, I, J, K, L: 分別對(duì)應(yīng)A, B, C, D, E, F中的葉片。圖H, I, K和L中的1、2、3和4分別表示倒一葉、倒二葉、倒三葉和倒四葉。圖A和D中, Bar = 2 cm; 圖B和E中, Bar = 6 cm; 圖C和F中, Bar = 13 cm; 圖G~L中, Bar = 0.7 cm。

A, B, C: seedling stage (A), tillering stage (B), and mature stage (C) of the wild type (WT) andmutant seedled at a daily average temperature of 22°C; D, E, F: seedling stage (D), tillering stage (E), and mature stage (F) of the wild type (WT) andmutantseedled at a daily average temperature of 28°C; G, H, I, J, K, L: corresponding to the leaves in A, B, C, D, E, F, respectively. 1, 2, 3, and 4 in the figures H, I, K, and L represent the first, second, third, and fourth fully expanded leaves from topmost leaf, respectively. A and D, Bar = 2 cm; B and E, Bar = 6 cm; C and F, Bar = 13 cm; G–L, Bar = 0.7 cm.

進(jìn)一步在光照培養(yǎng)箱種植野生型和突變體時(shí)發(fā)現(xiàn), 在不同溫度下(22°C、28°C和32°C)萌發(fā)的22 d齡突變體幼苗之間存在葉色差異(圖4-A~C): 22°C時(shí), 突變體葉片完全白化(圖4-A); 28°C時(shí), 突變體表現(xiàn)帶有白色條紋的淺綠色葉片(圖4-B); 32°C時(shí), 突變體葉色與野生型相近(圖4-C)。進(jìn)一步測(cè)定光合色素發(fā)現(xiàn), 與野生型相比, 在22°C下, 突變體葉片的葉綠素、葉綠素、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素含量降低幅度最大, 且均達(dá)到極顯著水平, 分別降低為野生型的16.50%、17.02%、16.57%和13.87% (圖4-D); 在28°C下, 突變體葉片的葉綠素、葉綠素、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素含量均極顯著降低, 但降低幅度較小, 分別降低為野生型的50.89%、53.69%、51.28%和69.73% (圖4-D); 在32°C下, 與野生型相比, 突變體葉片的葉綠素、葉綠素、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素含量均與野生型相近, 分別為野生型的95.99%、97.81%、96.22%和86.27% (圖4-D)。

上述表明, 突變體是一個(gè)溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體, 低溫(22°C)可誘導(dǎo)白化表型, 隨田間溫度逐漸升高, 白化程度較低的葉片可恢復(fù)至野生型葉色, 而完全白化葉片僅能恢復(fù)至淺綠色, 并影響其農(nóng)藝性狀。

2.2 不同溫度下葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析

透射電鏡下可見, 野生型在不同溫度下(22°C、28°C和32°C), 葉肉細(xì)胞中葉綠體含量豐富, 葉綠體形態(tài)飽滿, 其內(nèi)部類囊體基粒片層結(jié)構(gòu)清晰, 且數(shù)量豐富, 排列緊密(圖5-A, E); 而突變體在22°C下, 白化葉片的葉肉細(xì)胞中沒有葉綠體或者葉綠體發(fā)育極不正常, 含有部分囊泡狀結(jié)構(gòu)(圖5-B, F); 突變體在28°C下, 白化轉(zhuǎn)綠葉片的部分葉肉細(xì)胞中無葉綠體或葉綠體發(fā)育極不正常, 部分葉肉細(xì)胞中葉綠體發(fā)育完整, 但數(shù)量較少(圖5-C, G); 突變體在32°C下的葉綠體數(shù)目及超微結(jié)構(gòu)與野生型基本相似(圖5-A, E, D, H)。表明低溫(22°C)導(dǎo)致突變體葉綠體發(fā)育異常, 進(jìn)而產(chǎn)生白化表型; 突變體白化(圖4-A)、白化轉(zhuǎn)綠(圖4-B)和綠色(圖4-C) 3種葉色是由于不同溫度下萌發(fā)的突變體2葉肉細(xì)胞中葉綠體數(shù)量及發(fā)育程度不同所致。

為更直接地分析突變體葉綠體發(fā)育與溫度的關(guān)系, 進(jìn)一步將22°C下萌發(fā)的白化幼苗和28°C下萌發(fā)的白化轉(zhuǎn)綠幼苗分別移至不同溫度下(22°C、28°C和32°C)繼續(xù)培養(yǎng)10 d發(fā)現(xiàn), 22°C下萌發(fā)的白化幼苗在28°C下培養(yǎng), 葉片出現(xiàn)綠色斑點(diǎn), 少數(shù)葉肉細(xì)胞中含有少量完整的葉綠體, 大部分葉肉細(xì)胞中的葉綠體仍停留在幼齡階段, 尚未分化出基粒和基粒片層(圖5-I, M); 22°C下萌發(fā)的白化幼苗在32°C下培養(yǎng), 葉片恢復(fù)至帶有白色條紋的淺綠色, 部分葉肉細(xì)胞中的葉綠體數(shù)目明顯增多, 葉綠體內(nèi)含有豐富的基粒片層結(jié)構(gòu), 也含有一些嗜鋨顆粒(圖5-B, F, J, N), 但與野生型葉肉細(xì)胞仍存在明顯差異(圖5-A, E, J, N); 28°C下萌發(fā)的白化轉(zhuǎn)綠幼苗在22°C下培養(yǎng), 葉片仍為帶有白色條紋的淺綠色, 葉肉細(xì)胞中葉綠體發(fā)育滯緩, 與28°C下萌發(fā)的突變體葉肉細(xì)胞相比, 葉綠體數(shù)目及形態(tài)基本相似(圖5-C, G, K, O); 28°C下萌發(fā)的白化轉(zhuǎn)綠幼苗在32°C下培養(yǎng), 葉色與野生型接近, 葉肉細(xì)胞中葉綠體發(fā)育情況也與野生型基本相似(圖5-A, E, L, P)。上述表明, 低溫抑制突變體2葉肉細(xì)胞的葉綠體發(fā)育, 隨溫度升高, 葉綠體發(fā)育逐漸恢復(fù)正常, 從而使白化葉片逐漸恢復(fù)綠色。白化葉片葉肉細(xì)胞中沒有葉綠體或葉綠體嚴(yán)重畸形, 而白化轉(zhuǎn)綠葉片部分葉肉細(xì)胞中含有少量完整的葉綠體, 所以在相同較高溫度下, 白化葉片僅能恢復(fù)至淺綠色, 而白化轉(zhuǎn)綠葉片卻可恢復(fù)至野生型葉色。

圖2 不同田間溫度下播種的野生型(WT)和突變體tsa2的光合特性

A: 凈光合速率(n); B: 氣孔導(dǎo)度(s); C: 胞間CO2濃度(i); D: 蒸騰速率(r); **: 在0.01水平上差異顯著。

A: net photosynthetic rate (n); B: stomatal conductance (s); C: intercellular CO2concentration (i); D: transpiration rate (r); **: significant difference at< 0.01 by-test.

圖3 不同田間溫度下播種的野生型(WT)和突變體tsa2的農(nóng)藝性狀

A: 株高(cm); B: 穗長(cm); C: 分蘗數(shù); D: 有效穗數(shù); E: 每穗粒數(shù); F: 每穗實(shí)粒數(shù); G: 千粒重(g); H: 結(jié)實(shí)率(%); *: 在0.05水平上差異顯著; **: 在0.01水平上差異顯著。

A: plant height (cm); B: panicle length (cm); C: tiller number; D: effective panicle number; E: grain number per panicle; F: filled grain number per panicle; G: 1000-grain weight (g); H: seed setting rate (%); *: significant difference at<0.05 by-test; **: significant difference at<0.01 by-test.

圖4 不同溫度下野生型(WT)和突變體tsa2幼苗表型及光合色素含量

A, B, C: 分別為22°C(A)、28°C(B)和32°C(C)下萌發(fā)的22 d野生型(WT)和突變體幼苗; D: 不同溫度下萌發(fā)的野生型(WT)和突變體幼苗光合色素含量; **: 在0.01水平上差異顯著。圖A、B和C中, Bar = 2.5 cm。

A, B, C: twenty-two days old seedings of the wild type (WT) andmutant seeded under 22°C (A), 28°C (B), and 32°C (C), respectively; D: photosynthetic pigment contents of the wild type (WT) andmutant seedlings seeded under different temperature conditions; **: significant difference at< 0.01 by-test. A, B, and C, Bar = 2.5 cm.

2.3 光合色素代謝以及葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了解在低溫脅迫下, 突變體葉片中葉綠體發(fā)育在分子水平上受到的影響, 選取在22°C下萌發(fā)22 d的野生型和突變體幼苗葉片, 對(duì)其光合色素代謝以及葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR分析[14]。結(jié)果表明, 與野生型相比, 突變體葉片的葉綠素合成途徑相關(guān)基因、、、和的轉(zhuǎn)錄水平不同程度下調(diào), 且均達(dá)到極顯著水平(圖6-A),和的轉(zhuǎn)錄水平略微變化, 但未達(dá)到顯著水平(圖6-A); 突變體葉片中類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)酶基因、和表達(dá)量大幅度下調(diào)(圖6-A)。與野生型相比, 突變體葉片中PSI亞基編碼基因、、、、、、和的表達(dá)量不同程度降低, 均達(dá)到極顯著水平(圖6-A); PSII亞基編碼基因、、、、、和的轉(zhuǎn)錄水平也均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)(圖6-A, B); 細(xì)胞色素復(fù)合物(cytochromecomplex)編碼基因、、和的表達(dá)量均下降(圖6-B); 鐵氧還蛋白-NADP+還原酶(ferredoxin- NADP+reductase)編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)(圖6-B)。與野生型相比, 突變體葉片中的ATP合成酶(ATP synthase)編碼基因、和的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)(圖6-B); NADH脫氫酶(NADH dehydrogenase)編碼基因和的轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)(圖6-B); Rubisco亞基編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平大幅度降低, 且達(dá)到極顯著水平(圖6-B)。此外, 與野生型相比, 在突變體葉片中, 水稻中可能的基因表達(dá)水平發(fā)生改變, 基因、、、、、、和5的表達(dá)水平呈極顯著下調(diào)(圖6-B),的表達(dá)水平略微下調(diào), 但未達(dá)到顯著水平(圖6-B), 引物序列見表1。上述表明,基因突變阻礙了低溫下突變體幼葉中葉綠體發(fā)育進(jìn)程, 并影響了部分光合色素代謝以及葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

2.4 遺傳分析

將突變體與秈型低溫敏兩系不育系西大1S雜交, F1表型與野生型相同, 未發(fā)生性狀分離。F2代群體中出現(xiàn)正常和葉片白化轉(zhuǎn)綠兩種株型, 在4784個(gè)F2植株中, 正常單株數(shù)為3634株, 葉片白化轉(zhuǎn)綠單株數(shù)為1150株, 經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn), 其分離比符合3∶1 (χ2=2.31<χ20.05,1=3.84), 表明突變表型受一對(duì)隱性核基因控制。

2.5 基因定位及候選基因分析

經(jīng)分子標(biāo)記多態(tài)性分析, 共篩選出80對(duì)在2個(gè)親本(西大1S和)間表現(xiàn)出多態(tài)性的分子標(biāo)記, 經(jīng)基因池連鎖分析, 發(fā)現(xiàn)目的基因與位于第5染色體短臂上的標(biāo)記RM405可能存在連鎖關(guān)系, 進(jìn)一步利用F2群體中34株隱性單株進(jìn)行驗(yàn)證, 結(jié)果表明該標(biāo)記與突變位點(diǎn)連鎖。通過在RM405附近開發(fā)新的SSR標(biāo)記, 將目的基因初步定位在ZTQ43和RM18053之間, 遺傳距離分別為5.79 cM和4.56 cM。在初步定位的區(qū)間內(nèi), 進(jìn)一步開發(fā)SSR分子標(biāo)記用于精細(xì)定位, 最終得到3對(duì)在親本間呈現(xiàn)多態(tài)性的分子標(biāo)記, 分別是S5-20、S5-57和S5-119 (表2), 在1150個(gè)隱性單株中, 這3對(duì)SSR標(biāo)記處發(fā)生交換的單株數(shù)分別為3、1和19個(gè)。其中, ZTQ43處的92個(gè)交換株與RM18053處的80個(gè)交換株均不同, 并且兩端標(biāo)記ZTQ43和RM18053處的交換株之間不存在交叉。因此, 最終將定位在SSR標(biāo)記S5-57和S5-119之間, 物理距離約718 kb (圖7)。

圖5 不同溫度下野生型(WT)及突變體tsa2葉肉細(xì)胞中葉綠體超微結(jié)構(gòu)

A~D: 不同溫度下萌發(fā)的22 d野生型(WT)(A)和突變體(B, C, D)葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu); E, F, G, H: 分別為A、B、C、D中虛線區(qū)域的放大視野; I, J: 將22°C萌發(fā)的22 d突變體分別移至28°C (I)和32°C (J)下培養(yǎng)10 d的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu); K, L: 將28°C萌發(fā)的22 d突變體分別移至22°C (K)和32°C (L)下培養(yǎng)10 d的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu); M, N, O, P: 分別為I, J, K, L中虛線區(qū)域的放大視野。圖A~D和I~L中, Bar=2 μm; 圖E~H和M~P中, Bar=500 nm。

A–D: mesophyll cells structure of the twenty-two days old wild type (WT) (A) andmutant (B, C, D) seeded under different temperature conditions; E, F, G, H: magnified map of dashed area in A, B, C, D, respectively; I, J: mesophyll cells structure of twenty-two days oldmutant seeded under 22°C and transferred to 28°C (I) and 32°C (J) for 10 days, respectively; K, L: mesophyll cells structure ofmutant seeded under 28°C and transferred to 22°C (K) and 32°C (L) for 10 days, respectively; M, N, O, P: magnified map of dashed area in I, J, K, L, respectively. A–D and I–L, Bar=2 μm; E–H and M–P, Bar=500 nm.

圖6 野生型(WT)及突變體tsa2葉片中光合色素代謝以及葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因的表達(dá)分析

**: 在0.01水平上差異顯著。**: significant difference at< 0.01 by-test.

表1 光合色素代謝以及葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因的定量引物

表2 第5染色體上的部分多態(tài)性分子標(biāo)記

在基因定位區(qū)間內(nèi), 包含103個(gè)注釋基因, 經(jīng)https://www.genscript.com/預(yù)測(cè), 其中的28個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物可能位于葉綠體(表3)。根據(jù)http:// www.ricedata.cn/gene/和http://www.gramene.org/提供的信息, 對(duì)基因定位區(qū)間內(nèi)其余75個(gè)注釋基因分析發(fā)現(xiàn), 有4個(gè)編碼酸性磷酸酶家族蛋白、1個(gè)編碼膠原蛋白、1個(gè)編碼GA11916-PA、1個(gè)編碼富含甘氨酸的蛋白質(zhì)、1個(gè)編碼HAD超家族磷酸酶、1個(gè)編碼含組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、1個(gè)編碼同源框結(jié)構(gòu)域含蛋白、1個(gè)編碼SCC3、1個(gè)編碼泛醌生物合成蛋白CoQ4、1個(gè)編碼胞質(zhì)己糖激酶、1個(gè)編碼鈣調(diào)素結(jié)合蛋白和1個(gè)編碼蘋果酸酶(表4), 其余60個(gè)基因分別編碼反轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)座子、假設(shè)蛋白和表達(dá)蛋白。

圖7 TSA2基因在第5染色體上的分子定位

= 285: 初步定位群體數(shù)目;= 1150: 精細(xì)定位群體數(shù)目。

= 285: number of plant in primary mapping;= 1150: number of plant in fine mapping.

(續(xù)表3)

基因登錄號(hào) Accession number蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Protein subcellular localization prediction(https://www.genscript.com/)基因登錄號(hào) Accession number蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Protein subcellular localization prediction(https://www.genscript.com/) LOC_Os05g09400chlo: 12, mito: 2LOC_Os05g10210chlo: 4, cyto: 2.5, vacu: 2, cyto_nucl: 2, mito: 1 LOC_Os05g09430chlo: 9, mito: 3, extr: 1LOC_Os05g10290chlo: 9, cyto: 2, mito: 1, extr: 1 LOC_Os05g09450chlo: 7, extr: 3, nucl: 2, cyto: 1LOC_Os05g10300chlo: 3, nucl: 3, E.R.: 3, vacu: 2, mito: 1, plas: 1 LOC_Os05g09480chlo: 10, mito: 2, nucl: 1LOC_Os05g10330chlo: 6, cyto: 2, vacu: 2, E.R.: 2, nucl: 1 LOC_Os05g09490chlo: 9, cyto: 5LOC_Os05g10350chlo: 8, cyto: 3, nucl: 1.5, nucl_plas: 1.5 LOC_Os05g09510chlo: 12, nucl: 1LOC_Os05g10380chlo: 12, mito: 2 LOC_Os05g09540chlo: 9, mito: 4LOC_Os05g10420cyto: 7, chlo: 6 LOC_Os05g09550chlo: 11, nucl: 1, plas: 1LOC_Os05g10430chlo: 6, nucl: 5, extr: 1, E.R.: 1 LOC_Os05g09590chlo: 5, mito: 5, nucl: 4LOC_Os05g10550chlo: 6, nucl: 5, cyto: 3

表4 TSA2基因定位區(qū)間內(nèi)部分注釋基因

3 討論

水稻溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體分為高溫敏型和低溫敏型兩種[15], 后者的白化性狀受低溫誘導(dǎo), 在較高溫度下可逐漸恢復(fù)至野生型葉色, 這在水稻遺傳育種和探索溫度影響葉綠體發(fā)育分子機(jī)制等方面具有研究價(jià)值。

本研究所用的低溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體, 在22°C和28°C條件下萌發(fā)的幼苗表現(xiàn)出不同程度的白化, 溫度升高至32°C時(shí), 完全白化幼苗葉色僅可部分恢復(fù), 而白化程度低的幼苗才可恢復(fù)野生型葉色。受一對(duì)隱性核基因控制, 被定位于第5染色體SSR標(biāo)記S5-57和S5-119之間。這與目前已完成分子定位的白784、、、、()、等[16-21]低溫敏型白化轉(zhuǎn)綠突變體的突變表型及定位區(qū)間均不相同。白784被定位于第6染色體, 在20~24°C低溫處理下, 其葉片光合色素合成不同程度受阻, 葉片白化[16];被定位于第8染色體, 在溫度低于24°C時(shí)三葉期之前葉片白化, 隨后逐漸變綠[17];被定位于第9染色體, 16~20°C時(shí)幼苗白化, 葉肉細(xì)胞中沒有葉綠體或葉綠體發(fā)育極不正常, 只有一些小的囊泡狀結(jié)構(gòu), 在溫度高于23°C時(shí)復(fù)綠[18];被定位于第11染色體, 低于20°C時(shí)葉片白化, 高于24°C時(shí)復(fù)綠, 白化葉片中葉綠體發(fā)育有缺陷, 含有較少的基粒片層結(jié)構(gòu)[19]。()和都被定位于第5染色體, 但定位區(qū)間與相差較遠(yuǎn), 表型亦存在差異,()和均被定位在第5染色體長臂上, 而均被定位在第5染色體短臂[20-21];()在低于26°C時(shí)的幼苗前3葉白化, 葉尖和葉鞘帶有些許綠色, 白化苗在苗期逐漸死亡, 無法恢復(fù)葉色[20], 而有60%左右的白化苗可以存活至成熟期, 最終植株以淺綠色為主;在20~24°C時(shí)葉片白化, 在28~32°C時(shí)葉色與野生型無差異[21], 而在28°C時(shí)幼苗有帶白色條紋的淺綠色葉片。、、和等低溫敏型白化轉(zhuǎn)綠突變體尚未完成分子定位, 但表型與明顯不同,在15~20°C低溫條件下白化, 30°C時(shí)恢復(fù)正常葉色[22];在低溫下葉片白化, 在30°C和35°C時(shí)葉色分別轉(zhuǎn)為淺綠色和淡綠色[23];在25°C及以上溫度下出苗后表現(xiàn)白化隨后逐漸恢復(fù)綠色, 在20°C及以下溫度下萌發(fā)的白化苗因無法恢復(fù)綠色, 在三葉期便夭亡[24];在低于26.1°C時(shí)葉片趨向從黃綠到黃白再到白色, 在高于26°C時(shí)葉片趨于正常綠色[25]。上述表明,是一個(gè)新的溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體。

葉色突變體主要是由光合色素代謝異常及葉綠體發(fā)育缺陷所致。葉綠體是植物光合作用的主要場所, 光照、溫度等環(huán)境因素及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)可直接或間接影響葉綠體發(fā)育及光合色素代謝, 葉綠素等光合色素的穩(wěn)定性被破壞, 葉綠素代謝異常將直接導(dǎo)致葉色的變化[26]。與野生型相比, 在22°C時(shí), 突變體白化葉片中的葉綠素、葉綠素、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素含量均極顯著降低, 但仍可檢測(cè)到光合色素的存在, 光合色素含量隨溫度升高(28°C和32°C)與野生型植株之間的差距逐漸縮小直至無明顯差異。說明基因突變影響了低溫下光合色素的合成代謝, 導(dǎo)致葉綠素等光合色素的含量大幅下降, 葉片白化。為進(jìn)一步了解突變體葉色、葉綠體發(fā)育與溫度之間的關(guān)系, 對(duì)不同溫度下(22°C、28°C和32°C)的突變體葉肉細(xì)胞透射電鏡分析發(fā)現(xiàn), 其白化葉片(22°C萌發(fā))中沒有葉綠體或者葉綠體發(fā)育極不正常, 僅含有部分囊泡狀結(jié)構(gòu); 帶有白色條紋的淺綠色葉片(28°C萌發(fā))中有部分葉肉細(xì)胞含發(fā)育完整的葉綠體, 但葉綠體數(shù)量仍較少; 而野生型葉片(32°C萌發(fā))中的葉綠體數(shù)目及葉綠體超微結(jié)構(gòu)與野生型基本相似。說明低溫可導(dǎo)致突變體葉綠體發(fā)育異常, 使光合色素合成受阻, 導(dǎo)致22°C和28°C下萌發(fā)的突變體出現(xiàn)不同程度的白化表型。為探索突變體白化轉(zhuǎn)綠的原因, 分別將22°C和28°C下萌發(fā)的白化和白色紋幼苗移至不同溫度下(22°C、28°C和32°C)培養(yǎng)觀察并進(jìn)行透射電鏡分析, 發(fā)現(xiàn)隨溫度升高, 白化葉片緩慢恢復(fù)至淺綠色, 白化葉片中部分葉肉細(xì)胞開始出現(xiàn)少量的葉綠體, 葉綠體數(shù)目逐漸增多, 但仍不及野生型, 說明隨溫度升高突變體葉綠體發(fā)育在一定程度上得到恢復(fù), 使葉片逐漸恢復(fù)淺綠色。白色條紋葉片在低溫下(22°C)的葉色無明顯變化, 其葉肉細(xì)胞葉綠體發(fā)育情況也與28°C時(shí)相似, 而在較高溫度(32°C)時(shí)趨向野生型葉色, 其葉肉細(xì)胞的葉綠體數(shù)量及發(fā)育程度與野生型相近, 說明突變體白化表型主要受萌發(fā)階段的溫度影響, 低溫處理難使已復(fù)綠的幼苗復(fù)白, 高溫處理可使白色條紋葉片葉綠體發(fā)育恢復(fù)正常, 葉片完全復(fù)綠; 之所以在較高溫度下(32°C), 白化葉片僅能恢復(fù)至淺綠色, 而白色條紋葉片卻可恢復(fù)至野生型葉色, 可能是由于完全白化葉片葉肉細(xì)胞中沒有葉綠體或葉綠體嚴(yán)重畸形, 而白色條紋葉片部分葉肉細(xì)胞中含有完整的葉綠體, 葉綠素合成相對(duì)較多。與野生型相比, 突變體葉片的葉綠素合成途徑相關(guān)酶基因、、、和的轉(zhuǎn)錄水平大幅下調(diào), 說明低溫下突變體白化葉片中葉綠素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)紊亂, 葉綠素不能正常合成; 類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)酶基因、和表達(dá)量大幅下調(diào), 說明低溫下突變體白化葉片中類胡蘿卜素合成代謝受阻; 部分PSI亞基編碼基因、PSII亞基編碼基因以及光合相關(guān)基因的表達(dá)水平大幅下調(diào), 水稻中可能的基因表達(dá)水平也發(fā)生改變, 說明低溫下突變體白化葉片中葉綠體發(fā)育及光合相關(guān)基因表達(dá)受到影響。與野生型相比, 在田間日均氣溫約22°C時(shí)播種的突變體孕穗期光合速率明顯降低, 成熟期株高、每穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率等均極顯著降低, 而在田間日均氣溫約28°C時(shí)播種的突變體的孕穗期光合速率無明顯變化, 成熟期株高和結(jié)實(shí)率接近野生型, 每穗粒數(shù)與野生型存在較小差異, 是野生型的86.67%。綜上所述, 推測(cè)基因突變致使突變體葉片中光合色素代謝及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因在低溫下異常表達(dá), 導(dǎo)致葉綠體發(fā)生異常, 光合色素合成受阻, 葉片白化, 完全白化幼苗隨溫度升高僅能恢復(fù)至淺綠色, 光合作用低下, 最終影響突變體的株高、分蘗數(shù)及有效穗數(shù)等主要農(nóng)藝性狀, 尤其是產(chǎn)量性狀受到明顯抑制。

基因被定位在第5染色體分子標(biāo)記S5-57和S5-119之間, 物理范圍718 kb。在該染色體上已克隆了4個(gè)葉色相關(guān)基因, 但其突變表型均與不同,基因突變后, 導(dǎo)致葉綠素缺失, 突變體表現(xiàn)為黃綠葉[27];基因突變后, 突變體葉片呈現(xiàn)亮綠色[28]; 對(duì)和基因進(jìn)行RNAi干擾, 突變體表現(xiàn)出葉片缺綠, 但未見白化現(xiàn)象[29]。目前, 在該定位區(qū)間內(nèi)尚無白化轉(zhuǎn)綠基因被克隆, 所以可能是一個(gè)新的白化轉(zhuǎn)綠基因。葉綠體自身基因和表達(dá)產(chǎn)物定位于葉綠體以外的基因發(fā)生變異均有可能導(dǎo)致葉綠體發(fā)育異常[30-31]?；蚨ㄎ粎^(qū)間包含103個(gè)基因, 其中有28個(gè)的表達(dá)產(chǎn)物可能位于葉綠體, 影響葉綠體的正常發(fā)育; 其余75個(gè)注釋基因中, LOC_Os05g09650編碼泛醌生物合成蛋白CoQ4, 類似于質(zhì)體醌, 可能參與電子傳遞鏈中高能電子的傳遞; LOC_Os05g09410編碼含組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 可能在植物抵御高鹽、低溫和干旱等非生物脅迫中起作用。目前, 尚不能確定, 還有待于進(jìn)一步的基因定位及對(duì)相關(guān)候選基因的遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

是一個(gè)新的溫敏型葉片白化轉(zhuǎn)綠突變體,白化表型受低溫誘導(dǎo), 在22°C和28°C下萌發(fā)的幼苗出現(xiàn)不同程度的白化, 葉肉細(xì)胞中葉綠體發(fā)育缺陷; 當(dāng)溫度升高至32°C時(shí), 白化程度較低(28°C萌發(fā))的植株葉片恢復(fù)正常, 而白化程度較高(22°C萌發(fā))的植株僅能恢復(fù)至淺綠色; 并且在低溫下播種的植株光合作用受到明顯抑制, 最終影響農(nóng)藝性狀?；蛲蛔冇绊懥巳~片中部分光合色素代謝以及葉綠體發(fā)育和光合相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。突變表型受一對(duì)隱性核基因控制,被定位于第5染色體SSR標(biāo)記S5-57和S5-119之間物理范圍718 kb的區(qū)間內(nèi)。

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Phenotypic identification and gene mapping of temperature-sensitive green- revertible albino mutantin rice (L.)

SHANG Li-Na**, CHEN Xin-Long**, MI Sheng-Nan, WEI Gang, WANG Ling, ZHANG Ya-Yi, LEI Ting, LIN Yong-Xin, HUANG Lan-Jie, ZHU Mei-Dan, and WANG Nan*

Rice Research Institute, Southwest University / Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

Temperature-sensitive leaf colormutants of rice are ideal materials in studies on photosynthesis, chloroplast structure and function, and chloroplast development. A temperature-sensitive green-revertible albinomutant () with genetically stable mutational traits was screened out from the progeny of ethyl methane sulfonate (EMS) treatedthree-line maintainer line Xinong 1B. The wild type seedlings had normal phenotype at 22°C, while the mutanthad completely albino leaves and about 40% of albino seedlings died at the seedling stage; the photosynthetic pigment contents and photosynthetic rate of surviving albino seedlings decreased significantly, and the main agronomic traits were significantly lower than those of the wild type at maturity stage.When germinated at 28°C,showed light-green leaves with white streaks and significantly lower photosynthetic pigment contents than the wild type, while a small difference of photosynthetic rate and main agronomic traits between theand the wild type. No significant difference in leaves was observed betweenand the wild type when seedlings germinated at 32°C. Transmission electron microscope observation revealed that the albino leaves ofdemonstrated abnormal chloroplast development (without differentiated grana and granum lamella) or without chloroplast at 22°C and completely developed chloroplasts in partial mesophyll cells at 28°C, and normal number and morphology of mesophyll cells compared with wild type at 32°C. The analysis of qRT-PCR indicated that genes related to partial photosynthetic pigment metabolism pathways, chloroplast deve-lopment and photosynthesis expressed into a varying degrees compared with these of the wild type. Genetic analysis suggested that mutational phenotype ofwas controlled by a single recessive nuclear gene,which was finally mapped between SSR markers S5-57 and S5-119 on chromosome 5, with a physical distance of 718 kb. These results lay a foundation for the research on genetic improvement and the mechanism explanation of chloroplast development affected by temperature in rice (L.).

rice (L.); temperature-sensitive; green-revertible albino; chloroplast ultrastructure; gene mapping

2018-10-10;

2019-01-12;

2019-02-12.

10.3724/SP.J.1006.2019.82049

王楠, E-mail: wangnan_xndx@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

尚麗娜, E-mail: 1872230691@qq.com; 陳新龍, E-mail: 1347647864@qq.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31771750), 重慶市基礎(chǔ)研究與前沿探索項(xiàng)目(cstc2018jcyjAX0424)和重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CYS18084)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31771750), the Basic Research and Frontier Exploration Project in Chongqing (cstc2018jcyjAX0424), and the Graduate Research and Innovation Project in Chongqing (CYS18084).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20190206.1427.002.html