許靜紅 呂嘉賢 童荔 胡曉光 朱艷平 姚紀(jì)友 黃發(fā) 蔡常潔

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院（廣州510080）；2國家衛(wèi)生健康委員會輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510080）

髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是一群具有免疫抑制功能的細(xì)胞群體，包括各個(gè)分化階段的粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞等［1-2］。膿毒癥時(shí)血中的MDSCs的數(shù)量是增加的，可能提示MDSCs是炎癥反應(yīng)的一部分，但是具體機(jī)制仍然不是很清楚。有學(xué)者認(rèn)為活化的MDSCs能夠增加先天性免疫反應(yīng)及抗微生物活性，從而對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用［3-5］。但也有學(xué)者認(rèn)為過量的MDSCs能夠抑制獲得性免疫反應(yīng)從而增加機(jī)體繼發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)，對機(jī)體發(fā)揮有害作用［6］。

本研究前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，MDSCs細(xì)胞懸液通過尾靜脈注入膿毒癥小鼠體內(nèi)，能明顯降低小鼠腹腔內(nèi)的炎癥因子水平，改善膿毒癥小鼠生存情況［7］。但目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道MDSCs在細(xì)胞膿毒癥模型中的作用。本實(shí)驗(yàn)通過將MDSCs與LPS預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，研究MDSCs是否對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma，美國），光學(xué)顯微鏡（Leica，德國），熒光顯微鏡（Leica DMI8，德國），450型自動(dòng)酶標(biāo)儀系統(tǒng)（SunriseTM，瑞士），流式細(xì)胞分選儀（BD influx，美國），流式細(xì)胞儀（CytoFLEX，美國）

1.1.2 主要試劑人外周血淋巴細(xì)胞分離液（TBD，中國），脂多糖（Sigma，美國），Hoechst染色液33258（碧云天，中國），Cell Counting Kit-8（4A Biotech，中國），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（4A Biotech，中國），CD33-FITC、HLA-DR-APC、CD11b-PE流式抗體（eBioscienceTM，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購于美國ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室。HUVECs細(xì)胞株培養(yǎng)液為ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5%胎牛血清+1%青鏈霉素+1%生長因子，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。種板時(shí)取對數(shù)生長期的HUVECs細(xì)胞，0.25%胰酶制成單個(gè)細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×105/mL，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求鋪于6孔板（每孔2 mL）或96孔板（每孔100 μL），培養(yǎng)24 h待其貼壁后饑餓處理再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 髓源性抑制細(xì)胞采用流式分選技術(shù)從膿毒癥患者血液中分離所得。采集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科膿毒癥患者血液10 mL。入組標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合2016年發(fā)布的第三版關(guān)于膿毒癥和膿毒癥休克定義的國際共識［8］；確診時(shí)間＞7 d。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：年齡＜18歲；惡性腫瘤；使用免疫抑制劑；不同意參與本研究。本研究已獲中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批同意，所有血標(biāo)本的獲取均經(jīng)本人或法定代理人同意，并簽署知情同意書。

分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：取新鮮抗凝血10 mL，與生理鹽水1∶1混勻后，小心加于20 mL人外周血淋巴細(xì)胞分離液的液面上；以600 g離心25 min，此時(shí)離心管中由上至下液體分4層。第一層：為血漿層；第二層：為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層；第三層：為透明分離液層；第四層：為紅細(xì)胞層。收集第二層細(xì)胞放入含PBS 4～5 mL的試管中，充分混勻后，400 g離心20 min。沉淀經(jīng)2次洗滌后即得外周血單個(gè)核細(xì)胞。

流式分選MDSCs：用100 μL流式著色緩沖液重懸PBMC，加入5 μL FITC-CD33、PE-CD11b、APCHLA-DR抗體，避光孵育30 min后加入2 mL流式著色緩沖液，350 g離心5 min后棄去上清夜；重復(fù)洗滌兩次后上機(jī)分選。

1.3 CCK-8（Cell Counting Kit-8）法摸索LPS作用于HUVECs的最佳濃度及時(shí)間共設(shè)置5個(gè)濃度，100、10、1、0.1 μg/mL，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)時(shí)間為0、6、12、24 h，之后每孔加入 CCK-8 10 μL，孵育1 h后在酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值，以O(shè)D值反應(yīng)細(xì)胞活力情況。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組細(xì)胞接種為6孔板或96孔板24 h經(jīng)饑餓處理后，分為實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白組。實(shí)驗(yàn)組：LPS刺激一定時(shí)間（經(jīng)1.3步驟摸索的最佳濃度和時(shí)間）后，換液加入MDSC懸液（HUVECs∶MDSCs=50∶1［9］）共培養(yǎng)；對照組：LPS刺激一定時(shí)間后，換液加入等量培養(yǎng)基；空白組：HUVECs不經(jīng)LPS處理，僅加入等量PBS作用。各組培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.5 Hoechst染色觀察各實(shí)驗(yàn)組HUVECs形態(tài)學(xué)變化吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液，固定10 min后去固定液，用PBS洗兩遍，每次3 min。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。去染色液，用PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體后立即在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 CCK-8檢測各實(shí)驗(yàn)組HUVECs的增殖活性96孔板中每孔加入CCK-8 10 μL，孵育1 h后在酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值，以O(shè)D值反應(yīng)細(xì)胞活力情況。

1.7 AnnexinV-FITC/PI雙染檢測各實(shí)驗(yàn)組HUVECs的凋亡率用0.25%不含EDTA的胰酶消化6孔板內(nèi)的HUVECs，于室溫1 000 r/min離心5 min，棄上清液；用預(yù)冷1×PBS（4 ℃）重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入100 μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min后加入10 μL的PI染色，加入400 μL PBS后上機(jī)檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，用兩個(gè)樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDSCs的分選結(jié)果10 mL血液標(biāo)本可分離出10×106個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞，髓源性抑制細(xì)胞約占外周單個(gè)核細(xì)胞的（5.87±1.32）%，可分選出約6×106個(gè)MDSCs細(xì)胞，流式分選結(jié)果見圖1。

圖1 髓源性抑制細(xì)胞流式分選圖Fig.1 Flow sorting graphy of MDSCs

2.2 LPS刺激HUVECs的最佳濃度及作用時(shí)間不同濃度的LPS刺激HUVECs 0.5～24 h細(xì)胞活性結(jié)果見圖2。LPS刺激0.5 h對HUVECs細(xì)胞活性未產(chǎn)生影響，各濃度組與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS處理6 h，1、10、100 μg/mL濃度組對HUVECs細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS處理12、24 h時(shí)，四個(gè)濃度均能對HUVECs細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。10、100 μg/mL的LPS刺激6 h，或1 μg/mL刺激24 h時(shí)，細(xì)胞損傷程度接近50%。為縮短實(shí)驗(yàn)周期，綜合考慮后本實(shí)驗(yàn)選用10 μg/mL的LPS刺激6 h來構(gòu)建細(xì)胞膿毒癥模型。

2.3 實(shí)驗(yàn)各組HUVECs形態(tài)學(xué)觀察通過Hoechst染色檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)：正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色稍發(fā)白。同一高倍F2實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于空白組，而低于對照組，見圖3。

圖2 不同濃度-時(shí)間梯度的LPS對HUVECs增殖活性的影響Fig.2 Effects of LPS with different concentration-time gradients on proliferation activity of HUVECs

圖3 不同分組HUVECs Hoechst染色后形態(tài)學(xué)變化Fig.3 Morphological changes after HUVECs Hoechst staining in different groups

2.4 實(shí)驗(yàn)各組HUVECs的增殖活性空白組培養(yǎng)24 h后的平均OD值為（1.214±0.090）；對照組在培養(yǎng)24 h后平均OD值為（0.852±0.031）；實(shí)驗(yàn)組測得平均OD值為（1.018±0.074）。實(shí)驗(yàn)組與空白組、對照組比較，對照組與空白組比較，細(xì)胞活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 不同分組HUVECs增殖活性檢測結(jié)果Fig.4 Proliferative activity of HUVECs in different groups

2.5 實(shí)驗(yàn)各組HUVECs的凋亡率空白組的平均凋亡率為（7.85±0.984）%，對照組的平均凋亡率為（18.65±1.347）%，實(shí)驗(yàn)組的平均凋亡率為（12.90±1.132）%。實(shí)驗(yàn)組與空白組、對照組比較，對照組與空白組比較，HUVECs的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），流式結(jié)果見圖5。

3 討論

圖5 不同分組HUVECs的凋亡檢測流式結(jié)果圖Fig.5 Flow cytometry results of apoptosis detection in different groups of HUVECs

人類MDSCs的表面標(biāo)志物尚無定論，目前較為公認(rèn)的譜系標(biāo)志有 CD3、CD11b、CD14、CD19、CD56陽性及HLA-DR陰性。本研究中選擇CD33+CD11b+HLA-DR-來分選MDSCs，與大多數(shù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致。膿毒癥患者血液中分離出的MDSCs約占PBMCs的（5.87±1.32）%，這一結(jié)果與文獻(xiàn)記載相一致，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人水平（0.61±0.1）%［10］。膿毒癥中MDSCs的大量聚集，提示MDSCs可能參與炎癥的一部分［11-12］。越來越多的證據(jù)表明，在創(chuàng)傷［13-14］、自身免疫性疾?。?5］、病毒或寄生蟲感染［16-17］等急慢性炎癥中也會有大量的MDSCs聚集，并且不同疾病狀態(tài)下，MDSCs所表現(xiàn)的作用機(jī)制并不完全相同。在腫瘤研究中，由于MDSCs的免疫抑制作用，MDSCs可能參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［18-19］。而在炎癥過程中，MDSCs并不只是表現(xiàn)為免疫抑制作用，而是作為炎癥反應(yīng)的一部分，具體功能與所處的環(huán)境密切相關(guān)。DERIVE等［4］證明膿毒癥發(fā)生7～10 d后分離得到的MDSCs通過尾靜脈注射入膿毒癥小鼠體內(nèi)，能降低炎癥反應(yīng)，改善小鼠的生存率。但3 d內(nèi)的MDSCs并不能降低病死率，且產(chǎn)生的活性氧（ROS）水平也明顯低于膿毒癥后7～10 d分離的MDSCs。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著膿毒癥的進(jìn)展，MDSCs的主要表型會發(fā)生變化［20］。膿毒癥早期，MDSCs主要為單核細(xì)胞型，可通過表達(dá)ROS來調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的功能，在膿毒癥中并未表現(xiàn)出保護(hù)作用。晚期主要為粒細(xì)胞型，細(xì)胞活化主要發(fā)生在這一階段，可通過表達(dá)精氨酸合酶-1（Arg-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、抗炎因子IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）來調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬能力來改善膿毒癥的預(yù)后。

本研究選擇10 μg/mL LPS作用6 h誘導(dǎo)HUVECs凋亡來構(gòu)建膿毒癥細(xì)胞模型。VEC受損已被視為創(chuàng)傷、休克、感染、心血管疾病、腫瘤和急性肺損傷等多種疾病和綜合征發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)。在膿毒癥的病情進(jìn)展過程中，炎癥介質(zhì)與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，從而促進(jìn)炎癥發(fā)展和內(nèi)皮損傷，并導(dǎo)致血管滲漏增加和組織水腫，引起組織休克（組織灌注不足）和器官功能障礙。在機(jī)體遭受致病菌打擊時(shí)，如果內(nèi)皮細(xì)胞能繼續(xù)保持功能結(jié)構(gòu)的完整性，便能維持凝血及循環(huán)系統(tǒng)的相對穩(wěn)定，并有效阻止病菌及其產(chǎn)物逃脫局部防御進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，延緩病情的發(fā)展改善預(yù)后。已有研究［21］證明，使用藥物減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡能夠有效降低膿毒癥小鼠的死亡率。符暉等［22］認(rèn)為辛伐他汀治療膿毒癥的機(jī)制之一是通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax表達(dá)，抑制膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)對于LPS預(yù)處理的HUVECs，MDSCs能夠減少其凋亡，促進(jìn)其增殖。有學(xué)者也通過將MDSCs與HUVECs共培養(yǎng)證實(shí)MDSCs能夠增強(qiáng)HUVECs增殖與遷移能力，但MDSCs作用的具體機(jī)制還不清楚，目前推測這一現(xiàn)象可能與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）有關(guān)，VEGF是MDSCs作用的重要介質(zhì)。在腫瘤領(lǐng)域的研究中發(fā)現(xiàn)，MDSCs的免疫抑制作用與Arg-1，iNOS關(guān)系密切。MDSCs可以表達(dá)高水平的Arg-1、iNOS，催化左旋精氨酸形成NO，不但可以調(diào)節(jié)腫瘤血流形成，還可誘導(dǎo)VEGF促內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成［23］。在腫瘤患者體內(nèi)，VEGF 濃度與 MDSCs水平呈正相關(guān)［24］。VEGF也是目前公認(rèn)的作用最強(qiáng)的血管生長因子，VEGF與HUVECs表面受體結(jié)合，能激活抗凋亡通路磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）-絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKt）-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移與融合，并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)保護(hù)其凋亡。MDSCs作用的確切機(jī)制及其對膿毒癥病情的進(jìn)展和預(yù)后的影響仍待于進(jìn)一步的研究。

MDSCs在膿毒癥中的作用有可能為膿毒癥治療提供新的方向，細(xì)胞過繼治療也有望成為膿毒癥治療研究的新熱點(diǎn)。