張佳嬋，王昌濤，孫寶國(guó)，4，*，王成濤，楊帆

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.北京工商大學(xué)北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；3.北京工商大學(xué)植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；4.北京工商大學(xué)食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；5.云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650000）

紅曲霉是一種重要的藥食兩用微生物資源，在我國(guó)應(yīng)用紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲米，已經(jīng)有上千年的歷史，近現(xiàn)代發(fā)展也產(chǎn)生其他多種食品，紅曲黃酒、腐乳、醬菜、果酒等[1-2]。此外，紅曲霉還用于保健和醫(yī)藥領(lǐng)域，紅曲霉具有多種有益成分，如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽、γ-氨基丁酸、支鏈氨基酸、紅曲紅色素、紅曲黃色素等，其中又以Monacolin K 最為重要[3-5]。早在上世紀(jì)80年代，日本學(xué)者從紅色紅曲霉中分離出了一系列Monacolin 活性成分，被統(tǒng)稱為他汀同系物（Monacolins）。這些他汀類物質(zhì)具有顯著的降血脂功效，能夠顯著降低人體內(nèi)源性膽固醇的合成，抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的貯存；能夠顯著降低血液中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDLC）的含量，有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，具有高效、低度和安全的特點(diǎn)[6]。但是微生物產(chǎn)Monacolin K 的產(chǎn)率很低，需用稻米為發(fā)酵基質(zhì)，生產(chǎn)成本較高，限制了它的廣泛應(yīng)用。

為了能夠提高M(jìn)onacolin K 的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，廣大科研工作者逐漸嘗試并開展了發(fā)酵添加物或其他低成本基質(zhì)在生產(chǎn)Monacolin K 上的應(yīng)用。柴詩緣等探索了10 種添加物對(duì)紅曲霉Monacolin K 產(chǎn)量的促進(jìn)效果，發(fā)現(xiàn)添加谷氨酸可以顯著提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量[7]。碳氮比是微生物固體發(fā)酵中的重要考量因素，碳氮比的差異影響著微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累[8]。陳勉華等利用不同發(fā)酵基質(zhì)發(fā)酵紅曲霉，觀測(cè)其對(duì)不同次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，研究發(fā)現(xiàn)大米復(fù)配麥麩較單純使用大米為發(fā)酵基質(zhì)的紅曲產(chǎn)品，其Monacolin K 的含量增加了1 倍[9]。此外，也有部分學(xué)者力求通過基因改造、物理誘變等手段選育高產(chǎn)紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物的菌株，也取得了一定的效果，但誘變菌株活力易衰減、條件不可控，此類技術(shù)還不成熟[10]。也有研究者發(fā)現(xiàn)不同封口方式對(duì)紅曲霉產(chǎn)Monacolin K 的含量也有影響[11]。

利用農(nóng)林副產(chǎn)物作為發(fā)酵基質(zhì)用于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物或菌體的生產(chǎn)方式已有多年發(fā)展歷史。應(yīng)用于發(fā)酵的農(nóng)副廢料有畜禽羽毛[12]、稻草[13]、玉米芯[14]、藻類[15]、面包屑[16]、廚余殘?jiān)黐17-18]以及果皮[19-20]等。以紅曲霉為菌種的固體發(fā)酵農(nóng)副廢料的研究也迅速開展。Babitha 等利用波羅蜜種子進(jìn)行紅曲霉的固體發(fā)酵用于紅曲色素的生產(chǎn)并確定了發(fā)酵工藝[21]；Srianta 等將多種谷物基質(zhì)應(yīng)用在紫紅曲霉（Monascus purpureus）的發(fā)酵中，探討了多種基質(zhì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)、色素產(chǎn)量以及基質(zhì)活性成分變化的影響，發(fā)現(xiàn)去殼高粱粒更有助于菌絲的生長(zhǎng)和色素的積累[22]。Wang 等將赤紅曲霉（Monascus anka GIM 3.592）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae GIM 2.139）混合發(fā)酵番石榴葉以獲得多酚類提取物[23]。這些研究的目的多為獲得色素、酶類或改善基質(zhì)條件，較少以Monacolin K 為目的產(chǎn)物的副產(chǎn)物發(fā)酵研究。

沙棘籽粕（sea bucthorn seed residues，SBSR）是沙棘籽脫油后的副產(chǎn)物，常被作為飼料喂養(yǎng)畜牧或直接丟棄。通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)，沙棘籽粕富含豐富的纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，可以被微生物所利用，將其應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本課題將沙棘籽粕與紅曲霉相結(jié)合，通過輔料的添加來達(dá)到生產(chǎn)Monacolin K 的目的，并通過改變發(fā)酵條件，探索發(fā)酵基質(zhì)活性成分的變化趨勢(shì)。本課題的成功實(shí)施有望降低生產(chǎn)成本，擴(kuò)大紅曲霉的底物發(fā)酵范圍，為Monacolin K 的生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉菌株（Monascus Purpureus）M1：北京工商大學(xué)植物資源研究開發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；沙棘籽粕：青海康普生物科技股份有限公司；粳米、糯米：五常市彩橋米業(yè)有限公司；燕麥米：遼寧巨龍有機(jī)食品有限公司；薏仁米：朝陽泰然科技食品有限公司；蘆丁、原花青素、牛血清蛋白：中國(guó)藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、鄰二氮菲：分析純，北京化工廠；氯化鈉、硫酸銅、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Monacolin K（純度≥98%）；Sigma 公司。

BS2202S 型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DSHZ-300 恒溫水浴振蕩器：江蘇省太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；RJ-LD-50C 低速大容量多管離心機(jī)：無錫瑞江分析儀器有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SCB-920 潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司；20A 型高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 輔料的篩選

以沙棘籽粕為主要發(fā)酵基質(zhì)，以Monacolin K 含量和生長(zhǎng)速度為指標(biāo)，篩選出高產(chǎn)Monacolin K 的發(fā)酵輔料。

根據(jù)物料成分的特點(diǎn)，從粳米、糯米、薏仁米和燕麥米4 種常見稻米中篩選合適的輔料。配制發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液（磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%），為發(fā)酵基質(zhì)提供必要的礦物質(zhì)元素。固定輔料與沙棘籽粕為1∶1（g/g），提前混勻后，在粗平底試管中進(jìn)行生長(zhǎng)速度的測(cè)定。以每管25 g 輔料來計(jì)算，分裝在4 根大試管中，添加25 mL 營(yíng)養(yǎng)液使含水量為50%。透氣膜及報(bào)紙封口，121 ℃滅菌1 h。接種相同批次、相同大小的紅曲霉固體培養(yǎng)基，記號(hào)筆標(biāo)記發(fā)酵起點(diǎn)。一定時(shí)間后標(biāo)記菌絲延伸長(zhǎng)度，并記錄發(fā)酵天數(shù)。

1.2.2 生長(zhǎng)速度的測(cè)定

固定輔料與沙棘籽粕為1∶1（g/g），在粗平底試管中進(jìn)行生長(zhǎng)速度的測(cè)定。具體準(zhǔn)備方法見1.2.1。待菌絲延伸至中間位置，記錄生長(zhǎng)天數(shù)及生長(zhǎng)距離，計(jì)算生長(zhǎng)速度。

1.2.3 Monacolin K 的提取及測(cè)定

將發(fā)酵結(jié)束的固體菌質(zhì)于121 ℃滅菌1 h 后，取出置于45 ℃條件下烘干并粉碎。將1.00 g 干物質(zhì)置于15 mL75%的甲醇中，超聲 20 min，過 0.45 μm 濾膜，收集于液相小瓶中。

利用高效液相色譜進(jìn)行Monacolin K 含量的測(cè)定。色譜條件如下，色譜柱 C18（5 μm，150 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為甲醇：0.1%磷酸=3∶1（體積比），柱溫 30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。將標(biāo)準(zhǔn)品Monacolin K用無水甲醇配制成一系列濃度（5、20、50、80、100、150、200 μg/mL）溶液后進(jìn)行測(cè)定，繪制濃度—峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品以相同方法進(jìn)行測(cè)定，所得峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成含量。

1.2.4 不同輔料比例條件下水溶性和醇溶性活性成分的變化

固定含水量為60%，發(fā)酵時(shí)間為15 d，接種量為1 mL（孢子懸液濃度 3.2 × 104/mL），探討沙棘籽粕/輔料為 1∶0、2∶1（1∶0.5）、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、0∶1（g/g）時(shí)，對(duì)水溶性成分和醇溶性成分含量的影響，以未接種的發(fā)酵基質(zhì)為空白。

將發(fā)酵結(jié)束的固體菌質(zhì)于121 ℃滅菌1 h 后，取出置于45 ℃條件下烘干并粉碎。取1.00 g 干物質(zhì)以1∶8（g/mL）比例添加蒸餾水，90 ℃ 熱水浸提 5 h。離心取上清液測(cè)定水溶性活性成分（總糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、總酚和黃酮）的含量。

1.2.5 不同含水量條件下水溶性和醇溶性活性成分的變化

固定沙棘籽粕/輔料比例（1∶1 g/g），發(fā)酵時(shí)間為15 d，接種量為1 mL（孢子懸液濃度3.2×104/mL），探討不同含水量（40%、50%、60%、70%和80 %）對(duì)水溶性活性成分（總糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、總酚和黃酮）的影響，以未接種的發(fā)酵基質(zhì)為空白。發(fā)酵后的菌質(zhì)處理方式及上清液制備方法見1.2.4。

1.2.6 不同發(fā)酵時(shí)間水溶性和醇溶性活性成分的變化

固定含水量為60%，接種量為1 mL（孢子懸液濃度 3.2× 104/mL）和沙棘籽粕/輔料比例（1∶1 g/g），探討不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)水溶性活性成分（總糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、多酚和黃酮）的影響，以未接種的發(fā)酵基質(zhì)為空白。發(fā)酵后的菌質(zhì)處理方式及上清液制備方法見1.2.4。

1.2.7 活性成分的測(cè)定方法

水溶性活性成分總糖和多肽的測(cè)定方法參照參考文獻(xiàn)[24]和[25]；醇溶性活性成分原花青素、黃酮和多酚含量的測(cè)定分別參照參考文獻(xiàn)[26]、[24]、[27]。上述結(jié)果均以mg/g DW 表示。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素ANOVA 分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所得結(jié)果以±s 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔料的篩選

微生物生長(zhǎng)需要必須的碳源、氮源、礦物質(zhì)元素、生長(zhǎng)因子等。沙棘籽粕纖維素、多肽含量豐富，可以為微生物提供必要的營(yíng)養(yǎng)元素。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單純沙棘籽粕可以被紅曲霉所利用，但是并不利于次級(jí)代謝產(chǎn)物Monacolin K 的積累，然而通過添加一定量的輔料有利于Monacolin K 的生成。圖1為本試驗(yàn)所選4 種輔料的添加對(duì)Monacolin K 含量和菌絲生長(zhǎng)速度的影響。

圖1 添加不同輔料對(duì)生長(zhǎng)速度和Monacolin K含量的影響Fig.1 Effects of different ingredients on growth rate and the content of Monacolin K

由圖1可知，4 種輔料的添加均不影響菌絲的生長(zhǎng)，其中，粳米、燕麥米和薏仁米的添加顯著提高了菌絲生長(zhǎng)速度（P＜0.01），糯米的添加與“無”輔料組的生長(zhǎng)速度無顯著差異（P＞0.05）。Monacolin K 含量因添加輔料而顯著增加（P＜0.05），其中燕麥米的增加最為顯著（P＜0.01），達(dá)到（1 836.88±128.58）μg/g DW。鑒于生長(zhǎng)速度與特征性活性成分Monacolin K 的雙重考量，選擇燕麥米為后續(xù)試驗(yàn)輔料。

2.2 不同發(fā)酵條件對(duì)生長(zhǎng)速度及Monacolin K含量的影響

為了明確不同發(fā)酵條件對(duì)生長(zhǎng)速度和Monacolin K 的影響，本試驗(yàn)探討了輔料比例、基質(zhì)含水量和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)重要因素對(duì)生長(zhǎng)速度和Monacolin K 的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同發(fā)酵條件對(duì)生長(zhǎng)速度和Monacolin K含量的影響Fig.2 Effects of different conditions on growth rate and the content of Monacolin K

由圖2A 可知，沙棘籽粕/燕麥米的比例影響了生長(zhǎng)速度和Monacolin K 的含量，隨著燕麥米所占比例的增大，Monacolin K 的含量呈上升趨勢(shì)，由最初的（32.77±12.83）μg/g DW 升高至（2 972.18±15.66）μg/g DW，說明燕麥米有助于紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累；并且，隨著燕麥米所占比例的增大，菌絲生長(zhǎng)速度也存在著先升高后降低的趨勢(shì)，追究原因可能是由于適量的燕麥米為紅曲霉提供了豐富的單糖、雙糖等，有助于紅曲霉的直接利用，當(dāng)燕麥米占據(jù)發(fā)酵基質(zhì)的100%時(shí)，黏度的增加減少了基質(zhì)中的氧氣，不利于菌絲的分裂增長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度下降。

圖2B 探討了含水量對(duì)生長(zhǎng)速度和Monacolin K含量的影響。在所探討試驗(yàn)范圍內(nèi)，60%含水量能夠達(dá)到最大的生長(zhǎng)速度（0.42±0.04）cm/d，Monacolin K 的積累量也達(dá)到最高（1 836.88±17.73）μg/g DW。本試驗(yàn)中，80%含水量使發(fā)酵菌質(zhì)全部浸泡于發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液中，發(fā)酵基質(zhì)含氧量稀少，不利于紅曲霉菌絲的延伸和次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。

Monacolin K 在發(fā)酵過程中的積累結(jié)果見圖2C。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，Monacolin K 的含量逐漸升高，并于第5天開始迅速積累，含量達(dá)到（460.15±17.72）μg/g DW，Monacolin K 含量在第17天達(dá)到最高，（2 418.53±86.20）μg/g DW，17 d～21 d 的積累量變化不顯著。車鑫[28]在研究中藥對(duì)固體發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K 的影響研究中對(duì)照了普通發(fā)酵紅曲的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)紅曲固體發(fā)酵產(chǎn)Mona colin K 的含量在1.5 mg/g DW 左右，顯著低于本結(jié)果。

2.3 不同添加比例對(duì)活性成分含量的影響

設(shè)定沙棘籽粕/燕麥米的比例為 1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（g/g）和 0∶1 7（g/g）個(gè)梯度，以未接種的滅菌基質(zhì)為空白對(duì)照，觀察不同比例下發(fā)酵15 d 后的終產(chǎn)物醇溶性和水溶性活性成分的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同輔料比例對(duì)活性成分含量的影響Fig.3 Effects of ratios on the contents of active ingredients

隨著燕麥米所占比例的增加，發(fā)酵前后原花青素的含量均呈下降趨勢(shì)，且發(fā)酵后的樣品組與空白對(duì)照組相比無顯著性差異；總酚與黃酮的變化趨勢(shì)類似，燕麥米的比例較大時(shí)，發(fā)酵后的總酚和黃酮含量顯著高于發(fā)酵前；發(fā)酵前后總糖和多肽含量的變化趨勢(shì)均隨著燕麥米所占比例的增大而升高；同一輔料比例下，紅曲霉的作用更有助于糖分和多肽的溶出，兩者含量與發(fā)酵前相比總體呈升高趨勢(shì)，但是在輔料比例2∶1（g/g）時(shí)，總糖的含量低于發(fā)酵前，原因可能是較低含量的燕麥米所含糖分剛好被紅曲霉利用，且還沒有利用基質(zhì)中的纖維素類的原因。

2.4 不同含水量對(duì)活性成分含量的影響

不同含水量對(duì)活性成分含量的影響見圖4。

含水量是微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，適量的含水量有助于微生物的生長(zhǎng)繁殖和次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。固體基質(zhì)中過高的含水量降低了基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)，阻斷的氧氣的滲透；較低的含水量則不利于微生物的生長(zhǎng)，限制了能量的傳遞和代謝產(chǎn)物的溶出。因80%含水量條件下，固體基質(zhì)全部浸泡在發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液中，微生物不能生長(zhǎng)（圖2B 所示），故在探討微生物對(duì)基質(zhì)中活性成分的影響時(shí)舍棄此條件。

圖4 不同含水量對(duì)活性成分含量的影響Fig.4 Effects of different water contents on the contents of active ingredients

前期研究結(jié)果（圖2B）顯示，60%含水量下紅曲霉的生長(zhǎng)速度最大，低于60%含水量時(shí)，隨著含水量的增加，微生物逐漸快速生長(zhǎng)，體內(nèi)各種分解酶活力升高，使基質(zhì)中醇溶性物質(zhì)原花青素、總酚和黃酮均低于發(fā)酵前；高于60%含水量時(shí)，微生物不能正常生長(zhǎng)，使得部分活性物質(zhì)（原花青素、總酚、黃酮和多肽）得以保留；發(fā)酵后的總糖含量在40%含水量時(shí)高于發(fā)酵前含量，可能是紅曲霉分解了纖維素類屏障類物質(zhì)使糖分溶出的結(jié)果，而在50%～70%含水量范圍內(nèi)均低于發(fā)酵前，可能是因?yàn)槲⑸锏目焖偕L(zhǎng)導(dǎo)致溶出的糖分進(jìn)一步被利用。

2.5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)活性成分含量的影響

本試驗(yàn)探討了醇溶性和水溶性活性成分隨發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢(shì)，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，原花青素和總酚含量均在發(fā)酵初始時(shí)含量最高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)，說明在微生物的生長(zhǎng)過程中不利于兩者的保留；黃酮含量呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，并于第15天時(shí)達(dá)到最高，（1.00±0.07）mg/g DW，該趨勢(shì)的呈現(xiàn)可能是由于在發(fā)酵前期微生物逐漸分解纖維素等屏障性物質(zhì)，使黃酮更易溶出，隨著發(fā)酵的延長(zhǎng)，被微生物進(jìn)一步利用的緣故；總糖含量的變化趨勢(shì)與黃酮略有相反，發(fā)酵初期因微生物的生長(zhǎng)消耗糖分，使總糖含量逐漸降低，隨著發(fā)酵延長(zhǎng)，微生物逐漸分解纖維素類等屏障性物質(zhì)而產(chǎn)生供其利用的糖分，從而使總糖含量逐漸升高，當(dāng)微生物數(shù)量逐漸增多到一定程度，微生物的消耗與微生物菌種本身的糖類達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，而呈現(xiàn)最終趨于平緩的趨勢(shì)。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)活性成分含量的影響Fig.5 Effects of fermentation time on the contents of active ingredients

3 結(jié)論

紅曲霉可以直接利用沙棘籽粕進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，但是單純沙棘籽粕并不利于Monacolin K 的積累；以菌絲生長(zhǎng)速度和Monacolin K 含量為指標(biāo)進(jìn)行輔料的篩選，發(fā)現(xiàn)燕麥米是兩者兼顧的最優(yōu)輔料。當(dāng)沙棘籽粕/燕麥米為 1∶4（g/g）時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最大（0.69±0.02）cm/d，且Monacolin K 隨著燕麥米所占比例的增大而呈上升趨勢(shì)；60%含水量下，菌絲生長(zhǎng)速度和Monacolin K 含量達(dá)到峰值；在所考察發(fā)酵進(jìn)程中，Monacolin K 含量在 17 d 后達(dá)到最大值（2 418.53±86.20）μg/g DW。

在不同的發(fā)酵條件下，發(fā)酵菌質(zhì)中活性成分的含量與微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)緊密相關(guān)。極端環(huán)境下，微生物的生長(zhǎng)受到限制，使基質(zhì)中的活性成分得以保留，但同時(shí)也因微生物對(duì)基質(zhì)的分解作用微弱，使活性成分不易被提取和檢測(cè)到；適宜環(huán)境下，微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，基質(zhì)中的活性成分（如糖分）被分解消耗，但同時(shí)也因微生物本身數(shù)量的增加使最終發(fā)酵菌質(zhì)中的活性成分含量升高。在每個(gè)發(fā)酵階段，發(fā)酵菌質(zhì)的活性物質(zhì)含量此消彼長(zhǎng)，均可大致歸為上述原因。