李文秀 高迎春 李蕊秀 劉靜 吳家棟 邊艷超 肖瑞

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（呼和浩特010059）；2內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院病理科（內(nèi)蒙古赤峰024000）

浦肯野細(xì)胞變性（Purkinje cell degeneration，pcd）小鼠是一類常染色體隱性突變種［1］，成年早期小腦浦肯野細(xì)胞衰退而出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)［2］，并伴隨著視網(wǎng)膜的光感受體細(xì)胞、嗅球的僧帽細(xì)胞以及一些丘腦神經(jīng)元的緩慢退化［1-3］。此外，成年pcd 小鼠是不育的，因?yàn)橛挟惓Ｐ螤詈途訑?shù)量的減少［4］。前期研究發(fā)現(xiàn)Nna1 功能的喪失是pcd 表型的基礎(chǔ)［5］。Nna1 蛋白的表達(dá)局限在晚期的初級精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中，在精子發(fā)生和存活過程中起重要作用。usp9y 跨越170 kb的DNA，由至少46 個(gè)外顯子組成，占據(jù)AZFa 間隔的一小部分［6］，是編碼2 555 個(gè)氨基酸的大多肽，其大小約為300 kDa［7］，在pcd 小鼠的睪丸中高表達(dá)。

本研究構(gòu)建了usp9y 真核表達(dá)載體，利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究了usp9y 蛋白與Nna1 蛋白的相互作用。同時(shí)通過對pcd 小鼠睪丸基因表達(dá)的研究，了解usp9y 基因在小鼠精子發(fā)生異常中的作用和可能參與的信號通路。

1 材料與方法

1.1 試 劑 HEK293T 細(xì) 胞、DH5α 感 受 態(tài) 細(xì) 胞（Biotech 公司）、pcd3J 雜合型小鼠由韓國建國大學(xué)的ChankyuPark 教授饋贈(zèng)、PEGFP 質(zhì)粒載體（BD 公司）、usp9y 質(zhì)粒載體（Origene 公司）、膠回收試劑盒（QIAGEN 公司）、質(zhì)粒大提試劑盒（QIAGEN）、質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN）、免疫共沉淀試劑盒（SIGMA 公司）、usp9y 克隆全長質(zhì)粒（Origene 公司）、胎牛血清（HyClone 公司）、DMEM 高糖培養(yǎng)液（Gibco 公司）、PEGFP 質(zhì)粒載體（BD 公司）、usp9y克隆全長質(zhì)粒（Origene 公司）

1.2 磁性轉(zhuǎn)染 90 mm 培養(yǎng)皿中接種HEK293T 細(xì)胞2×106個(gè)，24 h 后利用磁珠將usp9y 質(zhì)粒DNA 及pcmv-myc-Nna1-C/pcmv-myc-Nna1-N 質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，48 h 后提取細(xì)胞RNA，通過熒光定量PCR 檢測表達(dá)量，提取蛋白進(jìn)行Western Blot 實(shí)驗(yàn)。

1.3 重組載體構(gòu)建 以usp9y 質(zhì)粒為模板，上游引物：5′-CGCTCGAGACATAGGCACACCAGTAACT-3′；下游引物：5′-GAATTCCATTCTTGCTGTGACGGAGG-3′，擴(kuò)增條件94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min；循環(huán)35 次后，72 ℃延伸10 min，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證產(chǎn)物。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切純化后與相同酶切處理的載體pEGFP-C1 連接，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到到E.coliDH5α 中，涂板。

1.4 質(zhì)粒提取 選單菌落5 個(gè)，搖菌。按照天跟小提試劑盒說明提取質(zhì)粒并測質(zhì)粒濃度。后通過PCR 反應(yīng)、雙酶切反應(yīng)和基因測序反應(yīng)驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.5 免疫共沉淀 收集轉(zhuǎn)染后的HEK293T 細(xì)胞，加入lysis buffer 后勻漿機(jī)短暫勻漿兩次，將細(xì)胞懸液4 ℃搖動(dòng)1～2 h，后12 000 r/min 離心30 min，收集上清即為細(xì)胞總蛋白，加入5 μL myc-tag 抗體旋轉(zhuǎn)搖床4 ℃孵育過夜，再加入瓊脂糖珠4 ℃緩慢搖動(dòng)2 h，進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)后將瓊脂糖珠離心至管底，用1×IP Buffer清洗4次，后加入適量蛋白上樣緩沖液，95 ℃金屬浴中熱變性5 min，離心后收集蛋白。

1.6 pcd 小鼠基因型檢測 取小鼠尾巴2 mm，提取DNA，PCR 擴(kuò)增目的基因，后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析［8］。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃3 min；95 ℃30 s，59 ℃15 s，72 ℃15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。引物見表1。熒光定量PCR 結(jié)果采用2-△△CT法，其中△△CT=（CT目標(biāo)基因-CT內(nèi)參基因）樣本-（CT目標(biāo)基因-CT內(nèi)參基因）對照。

1.7 小鼠睪丸組織表達(dá)譜分析 取野生型小鼠睪丸組織按手工法提取100 ng RNA，在nCounter Prep Station 機(jī)器上操作，后用nCounter?Digital Analyzer進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用nsolver2.5 軟件（http：//www.nanostring.com/）分析小鼠睪丸組織基因表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以x ± s表示, 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組樣本均數(shù)比較行t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 基因引物信息Tab.1 Gene primer information

2 結(jié)果

2.1 pCMV6-Myc-DDK-usp9y 質(zhì)粒的表達(dá)情況熒光定量PCR 檢測顯示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的usp9y 基因的表達(dá)量顯著升高，是正常對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞）的1 460 倍（P＜0.05，圖1）。結(jié)果說明pCMV6-Myc-DDK-usp9y 質(zhì)粒在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。

圖1 熒光定量PCR 檢測pCMV6-Myc-DDK-usp9y 質(zhì)粒的表達(dá)情況Fig.1 Fluorescence quantitative PCR detection of pCMV6-Myc-DDK-usp9y plasmid expression

2.2 蛋白水平上pCMV6-Myc-DDK-usp9y 質(zhì)粒的表達(dá)檢測 使用Western Blot 檢測usp9y 蛋白的表達(dá)，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒在翻譯水平上不表達(dá)（圖2）。通過分析該質(zhì)粒的基因序列圖發(fā)現(xiàn)序列正確，在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)，但在翻譯水平上并不表達(dá)，可能與載體有關(guān)，或蛋白序列過長。

2.3 pEGFP-usp9y-（nt1558-1955）表達(dá)載體的構(gòu)建 由于pCMV6-Myc-DDK-usp9y 質(zhì)粒在蛋白水平上不表達(dá)，設(shè)計(jì)位于usp9y uch 功能結(jié)構(gòu)域UCH（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase）（圖3A）編碼區(qū)的上下游引物（包含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)），以pCMV6-Myc-DDK-usp9y質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得攜帶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的usp9y-（nt1558-1955）編碼序列（1 600 bp）（圖3B）。

圖2 蛋白印跡檢測pCMV6-Myc-DDK-usp9y 表達(dá)Fig.2 Western blot analysis of pCMV6-Myc-DDK-usp9y expression

圖3 PCR 擴(kuò)增pCMV6-Myc-DDK-usp9y 的結(jié)果Fig.3 Results of PCR amplification of pCMV6-Myc-DDKusp9y

2.4 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證 分別通過PCR（圖4），雙酶（EcoRⅠ和XhoⅠ）切（圖5）和測序（圖6）的方法鑒定克隆質(zhì)粒，結(jié)果均證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-usp9y-（nt1558-1955）。

2.5 Western Blot 檢測重組質(zhì)粒表達(dá) 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEGFP-usp9y-（nt1558-1955）轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞，48 h 后提取細(xì)胞全蛋白，用GFP 標(biāo)簽抗體，通過western blot 檢測到重組質(zhì)粒在蛋白水平上成功表達(dá)（用在線軟件預(yù)測蛋白分子量約為100 kDa）。

圖4 PCR 檢測重組質(zhì)粒的結(jié)果Fig.4 Results of PCR detection of recombinant plasmid

圖5 重組質(zhì)粒雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.5 Results of agarose gel electrophoresis after double digestion of recombinant plasmid

圖6 重組質(zhì)粒的測序結(jié)果Fig.6 Sequencing results of recombinant plasmid

圖7 蛋白印跡檢測重組質(zhì)粒的表達(dá)Fig.7 Western Blot detection of recombinant plasmid expression

2.6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測usp9y 與Nna1 蛋白的相互作用 將pEGFP-usp9y-（nt1558-1955）重組質(zhì)粒同有myc 標(biāo)簽的pCMV-myc-Nna1-C 和pCMVmyc-Nna1-N 分別共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于HEK293T 細(xì)胞，48 h后提取蛋白，分別用GFP標(biāo)簽抗體沉淀pEGFPusp9y-（nt1558-1955）及與其相互作用的蛋白復(fù)合物，后用myc 標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western Blot 檢測，結(jié)果顯示（圖8A、8B），pEGFP-usp9y-（nt1558-1955）可與pCMV-myc-Nna1-C 端蛋白形成免疫復(fù)合物共沉淀下來，反向驗(yàn)證（用Myc 抗體沉淀復(fù)合物，用GFP抗體檢測蛋白表達(dá)）證明二者之間存在相互作用，但發(fā)現(xiàn)usp9y 可與Nna1 的C 端發(fā)生相互作用，而與Nna1-N 端沒有相互作用。Nna1 蛋白的C 端片段包含其主要的羧肽酶功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)果提示usp9y 與Nna1 相互作用，在pcd 小鼠精子發(fā)生中具有重要作用。

2.7 單分子基因表達(dá)譜分析結(jié)果 分析出生后19、31 和36 d 的小鼠睪丸中基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nna1 基因表達(dá)下調(diào)，這與pcd 小鼠中該基因突變的基因型一致；usp9y 在出生后19 d表達(dá)下調(diào)，而在31 和36 d 表達(dá)上調(diào)，且呈增長趨勢；細(xì)胞周期蛋白B3在pcd小鼠睪丸中表達(dá)下調(diào)；Nna1羧肽酶的底物alpha tubulin 在19 和31 d 的pcd 小鼠睪丸中的表達(dá)與正常對照相比變化不明顯，但在出生后36 d 的pcd小鼠睪丸中表達(dá)下調(diào)，這與Nna1的表達(dá)一致，提示該蛋白在小鼠睪丸發(fā)育或精子發(fā)生中可能也具有重要的功能。另外檢測MAPK和NF-κB信號通路中的關(guān)鍵因子Traf6、Grb2、PI3K 、Map2k1、Mapk1、Raf1、Kras、Ikbkb、Ikbkg 的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K、Map2k1、Raf1、Ikbkb、Ikbkg的表達(dá)上調(diào)，其中Ikbkg和PI3K的表達(dá)上調(diào)較顯著（表2）。

圖8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測usp9y 與Nna1 蛋白的相互作用Fig.8 Immunoprecipitation assay to detect the interaction between usp9y and Nna1 protein

表2 相關(guān)基因表達(dá)倍數(shù)差異Tab.2 Differences in expression folds of related genes

3 討論

Nna1 基因編碼蛋白屬于M14 金屬羧肽酶家族的一個(gè)亞族［9］。目前發(fā)現(xiàn)其作用底物包括微管相關(guān)蛋白和參與轉(zhuǎn)錄及染色體重建的相關(guān)蛋白，通過催化作用縮短聚谷氨酸側(cè)鏈及微管蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶等基因編碼的C 末端蛋白。研究發(fā)現(xiàn)Nna1 蛋白對谷氨酸和天冬氨酸酸性蛋白末端進(jìn)行加工，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用［9］。有研究［10］表明Nna1 基因突變所引起的聚谷氨酸的異常增高是造成pcd 小鼠神經(jīng)退化表型的原因，目前研究發(fā)現(xiàn)數(shù)百種胞漿和線粒體蛋白在pcd 小鼠大腦內(nèi)大量升高，并功能正常，高度提示Nna1 在蛋白降解的過程中發(fā)揮重要作用，浦肯野細(xì)胞的死亡很可能是由于大量肽不能降解成氨基酸［11］。該研究提示Nna1 突變的小鼠生殖異常可能和Nna1 缺失導(dǎo)致某種底物蛋白的異常表達(dá)相關(guān)。

usp9y 基因是AZFa 區(qū)最早被發(fā)現(xiàn)的與男性不育有關(guān)的候選基因，是泛素特異性蛋白酶，它從蛋白質(zhì)數(shù)量、活性上進(jìn)行微調(diào)節(jié)［12］，在蛋白質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用。在Nna1 突變的小鼠睪丸組織中，usp9y 的表達(dá)相對升高，提示usp9y 很可能是Nna1 的底物。據(jù)報(bào)道在人類精子發(fā)生過程中，usp9y 更有可能是提高效率的微調(diào)器，而不是基本功能的提供者［13］。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Nna1 N 末端表達(dá)質(zhì)粒的檢測結(jié)果是陰性，Nna1 C 末端陽性的，Nna1 的C 端的結(jié)構(gòu)域與鋅羧肽酶具有很大的序列同源性［14］。由此推斷Nna1 很可能是通過此結(jié)構(gòu)域和usp9y 蛋白進(jìn)行相互作用，但二者之間的作用是直接還是間接的仍然需要深入研究。

單分子基因表達(dá)譜系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)cds1，ccnb3 的表達(dá)下調(diào)，二者分別在視神經(jīng)和睪丸的發(fā)育中具有重要作用，這些因子表達(dá)的變化與pcd 小鼠的表型緊密聯(lián)系，提示他們可能在pcd 小鼠精子發(fā)生障礙中扮演重要的角色。

有研究發(fā)現(xiàn)促凋亡因子如NF-κB 及Fas 在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用，最終導(dǎo)致雄性不育，主要表現(xiàn)為支持細(xì)胞綜合征和少精子癥［15］。信號通路的關(guān)鍵因子分析發(fā)現(xiàn)Ikbkg 基因升高最顯著。IKK 是NF-κB 活化的關(guān)鍵因子，而Ikbkb 和Ikbkg 都是IKK 的重要組成成分，Ikbkb 是IKK 復(fù)合物的催化亞基，Ikbkg 為IKK 的調(diào)節(jié)亞基［16］，參與NF-κB 細(xì)胞信號通路的Ikbkb 和Ikbkg 基因在雄性不育pcd 小鼠睪丸組織中表達(dá)上調(diào)，提示NF-κB 細(xì)胞信號通路很可能在精子發(fā)生障礙過程中發(fā)揮某種作用。