楊玉潔，張德健，張冬林

（1.長江大學(xué)，湖北 荊州 434025；2.喬治亞大學(xué)，美國 喬治亞 雅典 30602）

直立冬青Ilex crenata‘Sky Pencil’為冬青科冬青屬齒葉冬青的選育品種之一，為常綠灌木，外形別具一格，枝葉繁茂，分枝多且直立向上，無需修剪便可自然成柱形。在園林綠化中，是省工省地、耐寒耐旱且適種范圍廣的優(yōu)良庭院觀賞和綠化節(jié)約型樹種[1]。但冬青屬植物種子發(fā)芽十分困難，由于堅硬的種皮和未成熟合子胚的雙重休眠，致使種子具有隔年發(fā)芽的特性，且常規(guī)播種繁殖生長緩慢，后代形狀分離，不能保持母本的優(yōu)良性狀[2]。因此，為了克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，獲得遠(yuǎn)緣雜交品種，打破種子休眠，縮短其育種周期，采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行直立冬青種苗的快速繁殖，對直立冬青的推廣利用具有一定的實踐意義。

利用組織培養(yǎng)等技術(shù)可以在短時期內(nèi)獲得大量的優(yōu)良無性系植株，有關(guān)冬青屬植物的組織培養(yǎng)已取得了一定的成果。盡管冬青屬其他種植物的組織培養(yǎng)已有報道，如Ilex khasiana[3]、光滑冬青Ilex glabra[4]、Ilex dumosa[5]、巴拉圭冬青Ilex paraguariensis[6-8]、歐洲冬青Ilex aquifolium[9]、紅果冬青Ilex purpurea[10]、大葉冬青Ilex latifolia[11]、金葉日本冬青Ilex crenata[12]、 北美冬青Ilex verticillata[13-14]、鐵冬青Ilex rotunda[15]等，但是以直立冬青幼胚為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽，獲得完整植株的方法未見報道。本研究通過對直立冬青未成熟合子胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)愈傷組織和分化不定芽的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑的配比和最佳采種時間，以期為直立冬青的快速繁殖提供參考，更為進(jìn)一步建立遺傳再生體系和工廠化育苗提供堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗植物材料

采集直立冬青果實作為試驗材料，將直立冬青的果實用流水沖洗20 min，去除表面污垢。轉(zhuǎn)移至超凈工作臺上，放入無菌燒杯中，用無菌水潤洗1 次。種子的表面消毒先用75%的酒精浸泡5 min，再用8%次氯酸鈉浸泡15 min，最后用無菌水沖洗5 ～6 次，放入無菌水中待用。通過對果實表面進(jìn)行消毒處理后，對果實進(jìn)行解剖，獲得幼胚，即試驗的外植體。

1.2 試驗方法與設(shè)計

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇

從美國喬治亞大學(xué)園藝農(nóng)場采集8年生直立冬青苗木的成熟果實，置于透明封口袋中，帶回實驗室。對外植體成熟果實進(jìn)行表面消毒滅菌。將消毒滅菌好的種子置于立體顯微鏡下進(jìn)行解剖，取出幼胚。將幼胚置于不同基本培養(yǎng)基（1/4 MS、1/2 MS、MS 和WPM）上，封好封口膜后置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基均添加0.1 mg/L 6-BA、1.5 mg/L 2,4-D、30 g/L 蔗糖和6.5 g/L 瓊脂；在加入瓊脂前，用氫氧化鈉或鹽酸將pH 值調(diào)至5.8±0.05。將配制好的培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋滅菌40 min。每個處理3 個6 cm 的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿放4 個幼胚，重復(fù)3 次，共144個幼胚。4個星期后，統(tǒng)計愈傷組織啟動率及褐化率。

1.2.2 不同生長素及質(zhì)量濃度對幼胚的影響

在篩選出來的最適基本培養(yǎng)基上，添加2,4-D、NAA 和IBA 3 種生長激素，探討不同生長激素的種類和質(zhì)量濃度對幼胚的影響。2,4-D、NAA 和IBA 3 種生長激素均設(shè)置4 個水平，分別為0.1、0.5、1.0 和2.0 mg/L，以不添加任何生長激素作為對照（CK），共13 個處理。每處理3 個培養(yǎng)皿，每皿4 個幼胚，重復(fù)3 次。30 d 后統(tǒng)計幼胚生長情況。

1.2.3 不同細(xì)胞分裂素及質(zhì)量濃度對幼胚的影響

在篩選出來的最適基本培養(yǎng)基上，添加6-BA、KT、ZT、TDZ 和2-ip 5 種細(xì)胞分裂素，探討不同細(xì)胞分裂素的種類和質(zhì)量濃度對幼胚的影響。6-BA、KT、ZT、TDZ 和2-ip 5 種細(xì)胞分裂素均設(shè)置4 個水平，分別為0.1、0.5、1.0 和2.0 mg/L，以不添加任何細(xì)胞分裂素作為對照（CK），共21個處理。每處理3 個培養(yǎng)皿，每皿4 個幼胚，重復(fù)3 次。30 d 后統(tǒng)計幼胚生長情況。

1.2.4 果實的不同成熟階段對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

該試驗采集不同時間段的直立冬青果實作為試驗材料，消毒滅菌后，在立體顯微鏡下解剖果實種子，取出幼胚接種于篩選出的最適愈傷基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。采種時間分別是2014年7月15日、8月15日、9月15日、10月15日。共4 個處理，每處理9 個幼胚，重復(fù)3 次。試驗結(jié)果均在接種6周后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率和污染率。

1.2.5 不同生長素及質(zhì)量濃度對幼胚愈傷組織分化的影響

將經(jīng)過初代誘導(dǎo)出的愈傷組織切成約1.0 cm× 1.0 cm 的小塊，接種到含2,4-D、NAA、IBA 3 種生長素的分化培養(yǎng)基上分化不定芽。分化基本培養(yǎng)基為：1/4 MS+3% 蔗糖+0.65% 瓊脂。試驗設(shè)計均設(shè)置4 個質(zhì)量濃度水平，分別為0.1、0.5、1.0和2.0 mg/L，以不添加任何生長激素作為對照（CK）共13個處理。每處理9瓶，每瓶接種3塊，重復(fù)3次。40 d 后統(tǒng)計分化情況。

1.2.6 不同細(xì)胞分裂素及質(zhì)量濃度對幼胚愈傷組織分化的影響

在基本分化培養(yǎng)基1/4 MS + 3%蔗糖 + 0.65% 瓊脂上，添加6-BA、KT、ZT、TDZ 和2-ip 5 種細(xì)胞分裂素，探討不同細(xì)胞分裂素的種類和質(zhì)量濃度對幼胚愈傷組織分化的影響。6-BA、KT、ZT、TDZ 和2-ip 5 種細(xì)胞分裂素均設(shè)置4 個水平，分別為0.1、0.5、1.0 和2.0 mg/L，以不添加任何細(xì)胞分裂素作為對照（CK），共21 個處理。每處理3 個培養(yǎng)皿，每皿4 個幼胚，重復(fù)3 次。40 d后統(tǒng)計愈傷組織分化情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計。采用Microsoft Excel 和SAS 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析。

相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計方法如下：

污染率=(污染的株數(shù)/接種總數(shù))×100%；

褐化率=(褐化的株數(shù)/接種總數(shù))×100%；

存活率=(存活的株數(shù)/接種的株數(shù))×100%；

發(fā)芽率＝(發(fā)芽的株數(shù)/存活的總株數(shù))×100%；

愈傷組織誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出愈傷組織數(shù)/接種 的株數(shù)）×100%；

分化率=(分化的株數(shù)/存活的總株數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響

直立冬青幼胚接種于不同誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 周后，對愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見圖1所示。

圖1 基本培養(yǎng)基對直立冬青幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響Fig.1 Effect of basic medium on Ilex crenata callus induction in immature embryos

由圖1可知，4 種培養(yǎng)基均可以誘導(dǎo)直立冬青幼胚長出愈傷組織，1/4MS、1/2MS、MS 以及WPM 培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為69.44%、66.67%、51.39%、72.22%；這4 種培養(yǎng)基之間的愈傷組織誘導(dǎo)率并不存在顯著差異，且誘導(dǎo)出的愈傷組織均呈透明色，質(zhì)地松軟。由此可見，直立冬青幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的成功率極高，有利于快速繁殖技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用。

2.2 不同植物生長激素及質(zhì)量濃度對幼胚的影響

以未成熟幼胚作為外植體，接種于附加2,4-D、NAA、IBA 3 種植物生長激素不同質(zhì)量濃度的1/4MS 培養(yǎng)基上，研究不同生長激素對幼胚生長的影響。30 d后，統(tǒng)計發(fā)芽率、愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見表1。

表1 植物生長激素對直立冬青子代幼胚的影響?Table1 Effect of auxins on embryo of I.crenata seedlings

從表1可以看出，2,4-D、NAA、IBA 3 種生長素對幼胚的發(fā)育具有一定的影響，對幼胚的發(fā)育方向起著不同的引導(dǎo)作用。從發(fā)芽率來看，發(fā)芽率最高的處理是對照和0.1 mg/L 2,4-D，為100%；其次為0.1 mg/L IBA，為88.89%；第三為0.1 mg/L NAA，為78.89%。因此，低質(zhì)量濃度的生長素有利于未成熟合子胚的發(fā)芽。以3 種生長素來看，2,4-D 和NAA 的發(fā)芽率趨勢是隨著生長素質(zhì)量濃度的增加，其發(fā)芽率逐漸降低；而IBA的發(fā)芽率與質(zhì)量濃度之間的關(guān)系并沒有明顯的規(guī)律可循，發(fā)芽率均在60%以上，促進(jìn)幼胚發(fā)芽的效果比較穩(wěn)定。由此可見，幼胚的發(fā)芽不需要外源生長素的調(diào)節(jié)。從愈傷組織誘導(dǎo)率來看，未添加生長素（對照）的處理，未成熟合子胚愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為0，與2,4-D 0.1 mg/L、NAA 0.1 mg/L 和IBA0.1 ～1.0 mg/L 處理的愈傷組織誘導(dǎo)率不存在差異顯著性，與其它的處理都存在差異顯著性。隨著2,4-D 質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率也隨著升高。2,4-D 質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 時，未成熟合子胚的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為96.3%。隨著NAA 質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。說明低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度的NAA 對幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)都有抑制作用，但是NAA 質(zhì)量濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L 時，愈傷組織的誘導(dǎo)率都高達(dá)90%以上，分別為100%和96.3%，兩者之間不存在顯著性差異。IBA 質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 時，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，為30.49%。與其余2 種生長素相比，IBA 對未成熟合子胚的愈傷組織的誘導(dǎo)作用并不明顯。因此，當(dāng)基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加2,4-D 0.5 ～2.0 mg/L 或者NAA 1.0 mg/L 和2.0 mg/L 時，最 有利于幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.3 不同細(xì)胞分裂素及質(zhì)量濃度對幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以未成熟合子胚作為外植體，接種于添加6-BA，KT，ZT，TDZ 和2-ip 5 種細(xì)胞分裂素的1/4MS 培養(yǎng)基上，研究探討不同細(xì)胞分裂素的種類和質(zhì)量濃度對幼胚生長的影響。30 d 后，統(tǒng)計發(fā)芽率、愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果見表2。

表2 細(xì)胞分裂素對直立冬青子代幼胚的影響Table2 Effect of cytokinins on embryo of I.crenata

從表2可知，從6-BA、KT、ZT、TDZ 和2-ip 5 種細(xì)胞分裂素4 個質(zhì)量濃度水平的愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果來看，只有KT0.5 mg/L、ZT 2.0 mg/L 以及2-ip2.0 mg/L 誘導(dǎo)出了愈傷組織，雖然愈傷組織的誘導(dǎo)率并不高，但是與其他處理具有顯著性差異。從發(fā)芽率來看，未添加任何細(xì)胞分裂素的對照，發(fā)芽率最高，為100%。6-BA 以及KT 質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 時，發(fā)芽率分別為62.96%和77.78%，其他質(zhì)量濃度均未出現(xiàn)萌發(fā)現(xiàn)象。由此可知，6-BA和KT 對幼胚的萌發(fā)具有抑制作用。隨著ZT 質(zhì)量濃度的增加，發(fā)芽率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。當(dāng)ZT 質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時，發(fā)芽率達(dá)到最高，為85.19%，與質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 時差異顯著。隨著TDZ 質(zhì)量濃度的增加，發(fā)芽率逐漸降低，但4 個質(zhì)量濃度水平之間差異并不顯著。發(fā)芽率隨著2-ip 質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，較低質(zhì)量濃度的2-ip 對發(fā)芽率的抑制作用較小。質(zhì)量濃度越高，抑制作用越大。由此可見，細(xì)胞分裂素對幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)以及發(fā)芽率均沒有積極的促進(jìn)作用。一般情況下，細(xì)胞分裂素通常與生長激素搭配使用，才能發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞分裂和控制形態(tài)發(fā)生的作用。

2.4 果實的不同成熟階段對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將不同采種時間的幼胚外植體置于1/4MS 培養(yǎng)基上，添加0.1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2,4-D，6 個星期后，統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)率和污染率，所得的結(jié)果見表3。隨著采種時間的推移，果實顏色逐漸加深，果實逐漸成熟，污染率也逐漸升高，愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。9月與10月份采集的果實，污染率與7月和8月的果實存在顯著差異。愈傷組織誘導(dǎo)率的最高值出現(xiàn)在8月，高達(dá)100%，與7月和10月的愈傷誘導(dǎo)率之間的差異顯著。

表3 果實的不同成熟階段對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table3 Effect of harvest time on callus induction of I.crenata

2.5 不同生長素及質(zhì)量濃度對幼胚愈傷組織分化的影響

誘導(dǎo)出的愈傷組織培養(yǎng)30 d 后，培養(yǎng)基的養(yǎng)分和水分都不充分，需要將愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代時剔除死去和生長狀況不好的組織，將細(xì)胞生長旺盛的組織切成約1.0 cm2的小塊接種在與原來培養(yǎng)基成分相同的新的培養(yǎng)基中，直至愈傷組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)趨于穩(wěn)定，再轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。挑取結(jié)構(gòu)疏松、未褐化、生長狀況良好的愈傷組織，分別將其轉(zhuǎn)入添加2,4-D、NAA、IBA 3 種生長素的培養(yǎng)基上，試驗結(jié)果見表4。

由表4可知，愈傷組織在添加不同生長素的分化培養(yǎng)基上能分化出不定芽，其中分化率最高的是添加生長素2,4-D 0.5 mg/L 處理，達(dá)到了70.37%，與其他處理具有顯著性差異；其次是在NAA 質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時，分化率為48.15%。當(dāng)在分化培養(yǎng)基上添加2,4-D 時，在較低（0.1 mg/L）和較高質(zhì)量濃度（2.0 mg/L）的情況下，未見有愈傷組織的分化。在NAA 質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 時，出現(xiàn)分化，但分化率不高，僅為3.5%；隨著NAA 質(zhì)量濃度的增加，分化率呈現(xiàn)先升后降的趨勢；在質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 時，達(dá)到最高，為48.15%。在添加IBA 的分化培養(yǎng)基上，均出現(xiàn)分化芽，但是分化率不高。

2.6 不同細(xì)胞分裂素及質(zhì)量濃度對幼胚愈傷組織分化的影響

將經(jīng)過繼代培養(yǎng)過的生長狀況良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至添加6-BA、KT、ZT、TDZ 和2-ip 的分化培養(yǎng)基上，經(jīng)過30 d 的培養(yǎng)，結(jié)果如表5所示。

由表5可知，愈傷組織在添加不同細(xì)胞分裂素的分化培養(yǎng)基上能夠分化出不定芽，最高分化率出現(xiàn)在ZT 質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 時，為58.15%，與其他處理之間存在顯著性差異；其次為6-BA 質(zhì)量濃度0.1 mg/L，分化率為37.04%。分化率隨著6-BA 質(zhì)量濃度的增高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而TDZ 反之，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。KT 只有在質(zhì)量濃度為0.1mg/L 時出現(xiàn)了分化，其他處理的愈傷組織均未出現(xiàn)分化。

表5 不同細(xì)胞分裂素及濃度對幼胚愈傷組織分化的影響Table5 Effects of cytokinins source and concentration on callus differentiation

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，基本培養(yǎng)基的選擇對其誘導(dǎo)分化以及器官再生都至關(guān)重要。因此，在本試驗中采用4 種基本培養(yǎng)基對直立冬青未成熟合子胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，而試驗結(jié)果表明基本培養(yǎng)基并不影響對直立冬青未成熟合子胚的愈傷組織誘導(dǎo)。這一結(jié)果與輪生冬青[14]、鐵冬青[15]的基本培養(yǎng)基的選擇結(jié)果不同，與直立冬青[16]萌發(fā)結(jié)果一致，可能是由于輪生冬青與鐵冬青組培所用外植體為莖段，而本試驗所用外植體為未成熟合子胚。

在本試驗中，果實的采種時間以及植物生長調(diào)節(jié)劑對直立冬青未成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)起著重要作用。7、8月份取材的外植體的污染率比9、10月份的高，愈傷組織誘導(dǎo)率在10月份時低于其他處理。由此可見，當(dāng)果實達(dá)到成熟時，果皮、果肉疏松，空氣增多，細(xì)菌和病菌極其容易進(jìn)入，導(dǎo)致表面消毒滅菌困難，污染率高。冬青幼胚存在生理后熟現(xiàn)象，當(dāng)果實成熟，幼胚仍然處于心形胚階段，隨著果實的成熟，胚乳失水逐漸緊致，未成熟合子胚進(jìn)入休眠階段。因此，促使未成熟合子胚啟動會愈加困難，愈傷組織誘導(dǎo)率稍低于其他處理。

植物生長調(diào)節(jié)劑被廣泛地應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中，通常是營養(yǎng)基質(zhì)的組成部分。在細(xì)胞水平上，生長素控制著基礎(chǔ)生長，例如細(xì)胞的分裂和細(xì)胞的伸長生長。培養(yǎng)基中加入生長調(diào)節(jié)劑可以改變和影響外植體的內(nèi)源激素水平，從而導(dǎo)致外植體在添加不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中產(chǎn)生誘導(dǎo)分化能力上的差異[17]。在本試驗中，當(dāng)基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加生長素2,4-D 質(zhì)量濃度為0.5 ～2.0 mg/L 或者NAA 質(zhì)量濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L 時，最有利于未成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)。而細(xì)胞分裂素單獨使用時，對未成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)不能起到積極作用。直立冬青未成熟合子胚愈傷組織的分化培養(yǎng)試驗表明，在培養(yǎng)基1/4MS＋0.5 mg/L 2,4-D上的分化率最高，達(dá)70.37%。在添加細(xì)胞分裂素2.0 mg/LZT 的培養(yǎng)基上，分化率最高，達(dá)到了58.15%。

本研究中，雖然單種植物生長調(diào)節(jié)劑對直立冬青的愈傷組織誘導(dǎo)和分化都獲得了較好的效果，但是植物的生長發(fā)育通常都是多種激素共同作用的結(jié)果，因此，優(yōu)化培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的配比將是進(jìn)一步深入研究的重點。