羅延青，王云月, 趙德勝, 趙凱琴, 周丕才, 符明聯(lián), 董云松, 李勁峰,王敬喬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，云南 昆明 650205；3.楚雄州農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，云南 楚雄 675000)

【研究意義】根腫病是發(fā)生在十字花科作物上的一種植物病害，在全球范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，對具有重要經(jīng)濟價值的蕓薹屬作物如白菜、甘藍和油菜等危害嚴(yán)重[1]。根腫病由蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)引起的，感病植株根部會形成大小不一的根瘤，阻礙植物所需水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運輸，導(dǎo)致植株地上部分出現(xiàn)葉片變黃、植株矮小及萎蔫等癥狀，嚴(yán)重感病時可導(dǎo)致植株死亡[2]。灌溉、農(nóng)事操作中農(nóng)機具混雜使用和附著在種子表面的休眠孢子是根腫病害傳播和擴散的主要渠道[3]。近年來，根腫病害在四川、重慶、湖南、浙江、廣西等省(市)發(fā)生危害日益嚴(yán)重，對十字花科作物造成了重大損失，根腫病防控已成為十字花科作物種植中亟待解決的問題[4-6]。嚴(yán)位中等2004年對云南省根腫病發(fā)病情況系統(tǒng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全省10個地州(市)均有根腫病的發(fā)生[7]。目前，根腫病害已蔓延到全省各油菜主產(chǎn)區(qū)，并對油菜生產(chǎn)造成不同程度的損失，嚴(yán)重影響油菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8]。如何有效地控制根腫病的危害和蔓延，是云南省油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟需解決的難題。【前人研究進展】目前，根腫病主要通過與非十字花科作物輪作或間作、土壤酸堿度的調(diào)節(jié)、以及使用化學(xué)殺菌劑等方法來進行防控[9-10]。根腫病菌的休眠孢子在土壤中能存活多年，適宜條件下就能萌發(fā)侵染寄主，導(dǎo)致輪作或間作收效甚微[11]；生產(chǎn)上多采用百菌清、氟啶胺等化學(xué)藥劑，對根腫病能起到一定的防控效果，但存在生產(chǎn)成本較高以及環(huán)境污染等問題[12]。因此，選育根腫病抗病品種是最為經(jīng)濟有效的防控措施[3]。國內(nèi)外通過研究已獲得許多對根腫病表現(xiàn)抗性的種質(zhì)材料。歐洲飼料蕪菁中許多品種如Siloga，Milan White等對根腫病具有抗性，并已應(yīng)用選育出大白菜抗病品種[13]；此外，Williams鑒別系統(tǒng)和歐洲根腫病鑒別系統(tǒng)中的鑒別寄主對根腫病菌存在抗、感性反應(yīng)差異，具有生理小種專化抗性，這些材料也可用于根腫病抗性育種[14]。根腫病菌具有生理小種的分化，且存在致病性變異，不同地區(qū)的根腫病菌生理小種不同。季海雯等對甘藍型油菜根腫病病菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)有2，4和13號，其中4號小種分布范圍最廣[6]。沈向群等對遼寧、山東、云南、四川和吉林等5省15個發(fā)病區(qū)域的根腫病病原菌進行生理小種鑒定，共分別發(fā)現(xiàn)2，4，7，10和11號生理小種，云南的為4號生理小種[15]。劉峰等對云南和西藏的根腫病樣品進行鑒定，共鑒定出10個生理小種，其中4號生理小種為優(yōu)勢種[16]。丁云花等對云南、湖北、重慶、四川等8個省(市)采集的18份病樣進行鑒定，共鑒定到2，4和7號生理小種，在云南鑒定到2號和4號，主要以4號生理小種為主[17]?！颈狙芯壳腥朦c】根腫病抗性育種中已選育出一批抗性白菜、油菜品種，但由于所用的抗性親本材料不同，以及各地區(qū)生理小種間的差異，抗性株系僅在一定區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出抗病性；由于云南自身的氣候特點，通過引種來進行根腫病防控具有一定的局限性。因此，抗病育種必須針對當(dāng)?shù)靥囟ǖ牟≡硇》N選擇合適的親本[18]。對云南特定的根腫病生理小種，韓國選育的大白菜品種 “康根51”(俗稱白菜王)在云南各種植區(qū)或?qū)υ颇喜杉牟【憩F(xiàn)出較強的抗病性，可作為云南根腫病抗病育種的抗源材料[7,19]。因此，本研究中擬以“康根51”作為抗性親本，以種間雜交的方式將“康根51”的抗性引入到甘藍型油菜中，以期創(chuàng)制獲得抗(耐)根腫病甘藍型油菜新種質(zhì)。【擬解決的關(guān)鍵問題】創(chuàng)制獲得對云南特定根腫病生理小種表現(xiàn)抗性的甘藍型油菜新種質(zhì)，為油菜根腫病抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

“康根51”為韓國選育的大白菜根腫病抗病品種，10P002、10P005、10159等為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所創(chuàng)制獲得的甘藍型油菜種質(zhì)，為根腫病感病材料。

1.2 方法

1.2.1 種質(zhì)創(chuàng)制過程 以“康根51”為父本，甘藍型油菜為母本通過人工去雄授粉的方式進行雜交獲得F1代種子。室內(nèi)根腫病抗性初篩后，將未發(fā)病植株移栽并套袋或與原甘藍型油菜親本進行回交獲得雜交后代材料，依此進行后種植于大田，單株自交套袋收種，選擇結(jié)實率較好的用于抗性鑒定試驗，共計663份。

1.2.2 染色體數(shù)目觀察 以抗性親本大白菜 “康根51”、甘藍型油菜10159以及雜交獲得的不同世代種子萌發(fā)后的根尖為材料進行染色體數(shù)目的觀察與計數(shù)。采用壓片法制備染色體標(biāo)本[20]。選取籽粒飽滿的種子，鋪放在帶有2層濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，加入少量滅菌ddH2O潤濕濾紙，并于培養(yǎng)箱中25 ℃暗培養(yǎng)60 h。切下約1 cm 左右的根尖部分，放入0.002 M 8-羥基喹啉中，15 ℃ 40 r/min搖床處理3 h。用清水清洗根尖2～3次，并加入卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸/3∶1)，4 ℃過夜。取根尖放入1 M HCl中，60 ℃水浴中水解10 min。清水洗凈后，取白色根尖部分在載玻片上，壓平根尖，并加入卡寶品紅工作液進行染色，10 min后在顯微鏡下觀察、計數(shù)及拍照。染色體數(shù)目的確認以觀察30個細胞以上，85 %以上的細胞具有一致的染色體數(shù)目，即可認為是最終染色體數(shù)目。

1.2.3 分子驗證 采用經(jīng)篩選獲得的在親本材料間存在差異的2對SSR引物，對構(gòu)建的抗性種質(zhì)進行PCR分析，引物為Ra2-A11(5’-GACCTATTTTAATATGCTGTTTTACG-3’和5’-ACCTCACCG-GAGA GAAATCC-3’)和Na10-D09(5’-AACGTCAAGATCCTCTGC-3’和5’-ACCACCACGGTAGTAGAGCG-3’)。PCR反應(yīng)體系為15 μl，分別為1×PCR緩沖液，2.5 m mol/L MgCl2，正反向引物各20 ng，0.2 m mol/L dNTPs，1UTaq酶，20 ng DNA模板。反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共計35個循環(huán)。2.5 %的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.4 大田抗性篩選 選擇昆明茨壩和小哨2個多年種植白菜且根腫病嚴(yán)重發(fā)病的田塊進行抗性評價。每份材料設(shè)3個重復(fù)，并以“康根51”和甘藍型油菜“花油8號”(記為H8)(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所選育的品種)為抗、感病對照，每20份材料設(shè)1組對照，在苗期進行病害調(diào)查與統(tǒng)計。

1.2.5 室內(nèi)抗性鑒定 對大田抗性初篩后獲得的抗性種質(zhì)進行室內(nèi)接種驗證。以楚雄州東瓜鎮(zhèn)油菜發(fā)病根瘤上分離的休眠孢子為病源。休眠孢子按照常規(guī)方法稍作修改后進行提取[21]。采用菌土接種法進行接種，具體操作如下：土壤121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻拌勻后重復(fù)滅菌1次。土壤稱重后進行拌土，使其休眠孢子的密度為5×107～ 1×108個/g土，pH值調(diào)節(jié)在5.4 ～ 6.5。帶菌土壤裝入穴盤中，每盤中播種10粒種子，于人工氣候箱中進行培養(yǎng)，溫度設(shè)定為26 ℃。每個材料設(shè)3個重復(fù)，并以“康根51”和“H8”為抗、感病對照。出苗40 d后，澆足水將植株完整拔出，清洗根部后進行發(fā)病統(tǒng)計調(diào)查。

1.2.6 病害等級劃分標(biāo)準(zhǔn) 病情等級劃分標(biāo)準(zhǔn)參考Siemens等[22]的方法進行。分為5個級別，0級：根部無癥狀；1 級：側(cè)根有腫塊，主根無腫塊；2級：主根有腫塊，側(cè)根無腫塊；3級：主、側(cè)根均有腫塊；4級：主、側(cè)根有大量嚴(yán)重腫塊。

1.2.7 病情指數(shù)計算和抗性評估標(biāo)準(zhǔn) 病情指數(shù)(disease index，DI)計算公式如下：

抗性評估標(biāo)準(zhǔn)：050，高感(high susceptibility,HS)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS對發(fā)病率和病情指數(shù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目分析

以“康根51”為父本，甘藍型油菜純系材料為母本進行雜交創(chuàng)制獲得了種間雜交后代材料。為鑒定創(chuàng)制獲得的植株是否為真實雜種，以親本材料“康根51”、10159及其構(gòu)建的不同世代雜交后代暗培養(yǎng)后的根尖為材料進行染色體數(shù)目分析。分析結(jié)果顯示“康根51”染色體數(shù)目為20條(圖1A)，10159染色體數(shù)目為38條 (圖1B)，與理論值相符。甘、白雜交F1代的染色體數(shù)目為29條(圖1C)，具有與預(yù)期相符的染色體數(shù)目。進一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3的染色體數(shù)目為32條(圖1D)，BC2的染色體數(shù)目為35條(圖1E)。隨著世代的增加，染色體數(shù)目逐漸趨于正常，在BC4和F4中均發(fā)現(xiàn)含有38條染色體及自交結(jié)實正常的甘藍型油菜單株。以上結(jié)果表明獲得的種質(zhì)確為以“康根51”為親本創(chuàng)制的。

2.2 雜交后代分子檢驗

為進一步驗證創(chuàng)制獲得的新種質(zhì)為甘、白雜交的后代材料，采用經(jīng)篩選獲得的在“康根51”和10159中存在差異的SSR標(biāo)記對創(chuàng)制的種質(zhì)進行PCR擴增。引物Na10-D09擴增結(jié)果顯示雙親存在差異，它在“康根51”中擴增到一條大小在250 bp左右的清晰條帶，而甘藍型油菜10159除擴增到該條帶外，還具有其它兩條清晰條帶，F(xiàn)2單株的擴增結(jié)果除具有與“康根51”相同的條帶外，與親本10159完全相同，不能由此判定它們是“康根51”和10159的雜交后代；引物Ra2-A11在親本間存在差異，且F2單株具有雙親共同帶型，這表明所創(chuàng)制的種質(zhì)確為甘、白種間雜交后代(圖2)。

2.3 大田抗性篩選

分別在昆明茨壩和小哨2個根腫病發(fā)病嚴(yán)重的田塊對663份材料在苗期進行病害調(diào)查統(tǒng)計。在自然發(fā)病條件下，“康根51”基本不發(fā)病，H8發(fā)病率平均為30.61 %，最高可達56.3 %，供試的663份材料發(fā)病率在0～85.5 %(數(shù)據(jù)未顯示)。綜合2個點的病害調(diào)查結(jié)果，2點6個重復(fù)中均未發(fā)病或發(fā)病率較低的材料共有29份(表1)。其中R072等10份種質(zhì)為F3代材料，R179等17份種質(zhì)為F4代材料，R384等2份材料為BC1F2代材料。

圖1 親本及不同雜交世代染色體數(shù)目分析Fig.1 Numbers of chromosome of parents and different generations

2.4 室內(nèi)抗性鑒定

采用菌土接種法對大田初篩獲得的29份種質(zhì)進行根腫病抗性鑒定。在人工接種條件下，對照H8發(fā)病率為86.7 %，病情指數(shù)為64.17，為高感品種?？剐杂H本“康根51”發(fā)病率為6.7 %，病情指數(shù)為5.00，表現(xiàn)為高抗。10P002、10159等甘藍型油菜純系親本材料的發(fā)病率在26.7 %～83.3 %，平均發(fā)病率為50.43 %，病情指數(shù)分別為26.67～70.00，除10P005對篩選所用的根腫病生理小種表現(xiàn)為抗病外，其余皆表現(xiàn)為感病或高感(表1)。

經(jīng)室內(nèi)接種驗證，29份雜交后代材料中2份材料R150和R322，分別為F3和F4代種質(zhì)，對楚雄東瓜分離的根腫病生理小種表現(xiàn)為高抗，發(fā)病率分別為6.7 %和13.3 %，病情指數(shù)分別為5.83和7.50；R072 、R087等19份F3、F4和BC1F2世代材料表現(xiàn)為抗病，發(fā)病率在13.3 %～36.7 %，病情指數(shù)在10.83～25.80；R085等4份F3和F4代種質(zhì)材料表現(xiàn)為感病，發(fā)病率在30.0 %～66.7 %，病情指數(shù)在30.00～45.80；R225等4份F3和F4代種質(zhì)材料表現(xiàn)為高感，發(fā)病率在70.0 %～83.3 %，病情指數(shù)在50.83～79.70。

2.5 發(fā)病率與病情指數(shù)相關(guān)性分析

采用SPSS軟件對“康根51”與甘藍型油菜純系親本以及其雜交后代材料的根腫病病情指數(shù)與發(fā)病率進行相關(guān)性分析，發(fā)病率與病情指數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01，表2)。在圖3中，病情指數(shù)隨發(fā)病率的增加而增加，相關(guān)公式為y=0.805x+0.556，決定系數(shù)R2=0.916。虛線矩形內(nèi)的為高抗品種(種質(zhì))，虛線橢圓形內(nèi)的為高感品種(種質(zhì))。

M：DL2000；1：“康根51”，2：10159，3～7：F2單株M：DL2000；1：‘CR51’，2：10159，3-7：F2plant圖2 SSR引物在親本和F2單株P(guān)CR擴增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification results of SSR primers in parent and F2generation

表1 油菜種間雜交后代根腫病抗性表現(xiàn)

表2 病情指數(shù)與發(fā)病率相關(guān)性分析

2.6 抗(耐)根腫病甘藍型油菜新種質(zhì)的創(chuàng)制

以“康根51”為父本，甘藍型油菜純系材料為母本進行雜交獲得的F1代植株自交結(jié)實率較低，經(jīng)回交或多代自交后獲得的種質(zhì)材料結(jié)實趨于正常，田間表型性狀與甘藍型油菜基本一致。通過染色體數(shù)目和分子驗證，確實為甘、白雜交后代材料。田間抗性鑒定和室內(nèi)抗性接種驗證，共創(chuàng)制獲得2份根腫病高抗種質(zhì)，19份表現(xiàn)為抗病。

3 討 論

在根腫病抗性研究中，對現(xiàn)有種質(zhì)資源以及收集的抗病品種和資源進行抗性評價對根腫病抗病育種具有重要作用。為此，國內(nèi)開展了大量的根腫病抗性鑒定研究工作。四川主栽油菜品種和引進的德國甘藍型油菜對成都根腫病發(fā)病嚴(yán)重區(qū)的抗性鑒定中發(fā)現(xiàn)，低感品種僅占15.22 %，無抗病品種[4]。陳靜等采用室內(nèi)外抗性鑒定相結(jié)合對79份甘藍新組合進行抗性鑒定，篩選到對重慶市涪陵區(qū)根腫病病菌表現(xiàn)高抗的GZ78，有助于培育具有地區(qū)特征性的抗性品種[23]。黃曉莉等通過田間自然誘發(fā)鑒定、溫室和組織培養(yǎng)室內(nèi)人工接種鑒定等 3 種方法對50個白菜品種進行抗性評價，3種方法的鑒定結(jié)果存在差異，其中7個品種經(jīng)3種鑒定方式均表現(xiàn)為高抗，可以在病區(qū)種植[24]。

通過“康根51”與甘藍型油菜進行雜交，創(chuàng)制了663份甘、白雜交后代材料。經(jīng)茨壩和小哨2個點的田間抗性初篩獲得29份抗性較好的種質(zhì)，進一步進行室內(nèi)接種鑒定，共21份表現(xiàn)為抗病，其中R150和R322表現(xiàn)為高抗。田間抗性鑒定的結(jié)果與室內(nèi)抗性結(jié)果有差異，造成這種差異的原因可能如下：①田間鑒定受氣候、土壤環(huán)境和其它病原微生物的影響，且存在根腫病菌分布和數(shù)量不均等因素，在不同田塊和年度間抗性鑒定結(jié)果可重復(fù)性稍差；室內(nèi)抗性鑒定的土壤酸堿度、光照、溫度等因素可調(diào)控，植株的出苗整齊并且可重復(fù)性高，但植物的生長發(fā)育與自然條件下存在差異。因此2種方法的鑒定結(jié)果會存在不同。②根腫病菌生理小種存在致病性分化，田間的生理小種可能是以復(fù)合形式存在的，較室內(nèi)采用單個根瘤擴繁并分離休眠孢子進行接種而言，田間的鑒定環(huán)境更為復(fù)雜。田間鑒定更接近于自然條件下根腫病的發(fā)生、致病過程，具有生產(chǎn)上的應(yīng)用價值，單一的任何一種抗性鑒定方法都不能完全真實的反應(yīng)種質(zhì)抗病性。因此，對種質(zhì)材料的抗性鑒定評價宜采取田間抗性鑒定和室內(nèi)抗性鑒定相結(jié)合的方法，才能較為準(zhǔn)確的進行抗病性評價。

圖3 親本及雜交后代病情指數(shù)與發(fā)病率關(guān)系Fig.3 Relationship between disease index and disease incidence of parents and hybrid offspring

對染色體數(shù)目的分析表明，在白菜和甘藍型油菜雜交過程中染色體發(fā)生了置換，白菜的染色體或染色體的大片段置換到了甘藍型油菜中。在研究過程中雜交后代結(jié)實率較差，究其原因可能一是“康根51”存在自交不親和現(xiàn)象，二是染色體數(shù)目異常。此外，采用在親本間存在差異的引物進行檢測，發(fā)現(xiàn)雜交后代具有雙親的互補帶型，為“康根51”和甘藍型油菜親本雜交創(chuàng)制獲得的種質(zhì)。

根腫病菌生理小種是以鑒別寄主接種病菌后的抗、感病性進行劃分的[6,14]，對云南不同地區(qū)采集的根腫病樣生理小種鑒定表明，云南省存在多種生理小種，其中4號小種為優(yōu)勢種。 “康根51”在云南省的根腫病發(fā)病區(qū)域具有較好的根腫病抗性，但在室內(nèi)抗性鑒定中發(fā)現(xiàn)，少數(shù)植株的根部有微小根瘤，可能為雜合體單株抗性相對較弱。由于田間的病原體是以復(fù)合形式存在的，因此要獲得在生產(chǎn)上真正具有應(yīng)用價值的品種，應(yīng)采用基因聚合的方式將多個外源抗性基因?qū)氲酵环N質(zhì)中，可篩選獲得具有多個生理小種抗性的新種質(zhì)。

4 結(jié) 論

以“康根51”和甘藍型油菜為親本進行雜交，創(chuàng)制獲得663份不同世代的自交單株。經(jīng)染色體數(shù)目分析和分子驗證，確定為甘、白種間雜交后代材料。采用田間和室內(nèi)抗性鑒定相結(jié)合的方法，共篩選獲得21份根腫病抗性新種質(zhì)，其中R150和R322表現(xiàn)為高抗。相關(guān)性分析表明，根腫病發(fā)病率與病情指數(shù)呈極顯著正相關(guān)。