宋國琦，李 瑋，張淑娟，陳明麗，高 潔，李玉蓮，張榮志，韓小東，李根英

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實驗室/小麥玉米國家工程實驗室,山東濟(jì)南 250100)

干旱是小麥產(chǎn)量的主要限制因子之一。挖掘和利用優(yōu)異抗旱基因資源是提高小麥抗旱性的重要手段。研究表明，ABA是植物響應(yīng)水分脅迫的重要信號分子，在抗旱性方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。干旱脅迫下，ABA不僅能夠促進(jìn)氣孔的關(guān)閉以降低水分的蒸騰，而且能夠調(diào)控一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)基因的表達(dá)，從而提高植物對非生物脅迫的適應(yīng)性[3-4]。在ABA的生物合成途徑中，9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是關(guān)鍵的限速酶，能夠調(diào)控ABA的合成速度[5-9]。

目前，已在菜豆、擬南芥、鱷梨等植物中獲得NCED基因，并對其功能進(jìn)行了分析[10-12]。研究結(jié)果表明，干旱脅迫處理不僅可誘導(dǎo)NCED基因的表達(dá)，同時也提高了內(nèi)源ABA的活性[13-14]。但是其在不同脅迫或不同物種間的表達(dá)模式是不同的[15-17]。在對模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，NCED為一個多基因家族，共有5個NCED基因，分別為AtNCED2、AtNCED3、AtNCED5、AtNCED6和AtNCED9，其中AtNCED3是應(yīng)答水分脅迫的主要基因[15-16]。在對鱷梨的研究中發(fā)現(xiàn)，PaNCED1和PaNCED3能誘導(dǎo)果實成熟，并且PaNCED1受水分脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但是在脫水的葉片中未檢測到PaNCED3的表達(dá)[17]。在對小麥的研究中發(fā)現(xiàn)，NCED基因在普通小麥及其近緣種中在正常條件下表達(dá)量很低或幾乎不表達(dá)，但在逆境條件下的表達(dá)量明顯增強(qiáng)；脫水脅迫和鹽脅迫都能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)NCED基因的表達(dá)，并且在非生物脅迫條件下普通小麥及其近緣種之間NCED基因的表達(dá)量具有明顯差異[18]。在轉(zhuǎn)基因植物中NCED基因的過量表達(dá)能引起ABA積累和耐旱性增加[7,19]。上述研究表明，NCED基因在抵御干旱脅迫中起著重要的調(diào)控作用。

2012年本課題組成功克隆了小麥NCED1基因的全長，并將其命名為TaNCED1，GenBank登錄號為JQ772528.1，該基因為單拷貝，長度為1 848 bp，無內(nèi)含子。研究表明，在小麥中TaNCED1基因?qū)γ撍?、鹽、冷和ABA脅迫均產(chǎn)生不同程度的響應(yīng)；過表達(dá)TaNCED1的轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性顯著提高[19]。但是目前在逆境脅迫下小麥中TaNCED1表達(dá)和ABA積累關(guān)系的研究尚未見報道。本研究擬通過研究不同小麥品種在干旱脅迫和恢復(fù)水分條件下TaNCED1的表達(dá)水平和ABA含量動態(tài)變化，尋找不同小麥品種中TaNCED1表達(dá)與ABA含量變化之間的關(guān)系，探討TaNCED1對水分脅迫的響應(yīng)機(jī)理及其在小麥抗旱中的作用，以期為小麥耐旱理論研究及耐旱新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為濟(jì)麥22、魯麥21、和尚頭、臨旱2號、石4185、濰麥8號、青麥6號和鄭麥366。其中，濟(jì)麥22、石4185、濰麥8號和鄭麥366為中高肥水地塊種植的品種，魯麥21、和尚頭和青麥6號為抗旱品種，臨旱2號為耐旱品種。將小麥種子浸水至萌發(fā)后，置于4 ℃冰箱春化30 d，將芽苗修剪后移栽至直徑20 cm的花盆中，花盆基質(zhì)為草炭土，每盆種植6棵，每個材料種植24盆。在人工氣候室的可控環(huán)境下生長，設(shè)置晝/夜溫度為22/16 ℃，光/暗周期為16/8 h，光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%～70%。

1.2 方 法

1.2.1 水分處理

小麥幼苗移栽到花盆后，所有小麥水分管理一致，并保證小麥正常生長的水分需求。移栽15 d 以后(此時小麥處于5葉期)，將所有材料澆水至飽和狀態(tài)，隨后分為干旱處理和對照兩個組。其中，干旱脅迫處理18盆，期間不再補(bǔ)充水分，并觀察植株的生長表現(xiàn)，同時利用水分測定儀測定花盆內(nèi)土壤含水量的變化；6盆對照的土壤含水量始終保持在70%～80%范圍內(nèi)。干旱脅迫處理的第5 d，濰麥8號和鄭麥366的展開葉片開始出現(xiàn)萎蔫，此時各干旱處理小麥土壤水分含量平均都在50%左右。在最早出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象時開始計時，依次分別在第6、12、24、48、72和96 h時對干旱處理和對照小麥進(jìn)行取樣。取樣時，選擇干旱脅迫處理中表現(xiàn)相近的6盆材料，每次每盆分別取1株材料，并將6株材料不同部位的葉片混合，置于-70 ℃下保存?zhèn)溆?；干旱計時96 h后，開始對剩余干旱脅迫處理材料進(jìn)行復(fù)水，分別在復(fù)水后的第6、12、24、48、72和96 h時再次對各處理小麥進(jìn)行取樣，取樣方法同上，將6株材料不同部位的葉片混合后置于-70 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小麥總RNA的提取和cDNA的合成

分別取0.1 g樣品于液氮研磨后，利用UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒(生工，上海)進(jìn)行RNA的提取，利用Nanodrop 2000/2000 C分光光度計(Thermo，美國)進(jìn)行RNA濃度的測定與樣品的定量，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后取10×稀釋液為模板進(jìn)行qRT-PCR。

1.2.3TaNCED1基因的實時熒光定量PCR分析

TaNCED1定量PCR引物為NCED1-P2F/R，以小麥Actin為內(nèi)參，引物序列如下： NCED1-P2F/R，TCATCGCCGTCCACCAGG/GGGCCG CTCCAGGACATT；TaActin-F/R，GCCACAC TGTTCCAATCTATGA/TGATGGAATTGTA TGTCGCTTC(AB181991)。按照Light Cycler 480 SYBR Green I(Roche，德國)說明書，在Light Cycler?480實時定量PCR儀(羅氏，德國)上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線。每個反應(yīng)3個技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法分析試驗結(jié)果。

1.2.4 ABA含量的測定

ABA含量參照張 煒等[20]的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)處理及作圖，采用DPS 15.10進(jìn)行顯著性檢驗(Duncan多重比較，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaNCED1基因表達(dá)水平分析

從表1可以看出，在土壤含水量降至50%之后，TaNCED1基因的表達(dá)量隨干旱脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，但各材料間的變化趨勢不同，其中，濟(jì)麥22、青麥6號、石4185、濰麥8號和鄭麥366呈現(xiàn)明顯的單峰曲線，魯麥21、和尚頭和臨旱2號呈現(xiàn)明顯的雙峰曲線；材料間TaNCED1表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時間也存在明顯的差異，其中，臨旱2號和石4185在干旱脅迫6 h后即達(dá)到最高值，濟(jì)麥22、青麥6號、和尚頭、濰麥8號和鄭麥366在干旱脅迫12 h時達(dá)到最高值，而魯麥21則在脅迫96 h達(dá)到峰值。

在復(fù)水過程中，除臨旱2號外，其余7個小麥材料的TaNCED1表達(dá)均表現(xiàn)為先快速下降，之后緩慢上升的“V”字形變化趨勢，且這7個材料TaNCED1的表達(dá)量均在復(fù)水24～48 h內(nèi)下降至最低值，之后緩慢上升；臨旱2號TaNCED1的表達(dá)水平則表現(xiàn)出降-升-降的變化趨勢，在復(fù)水48 h時達(dá)到峰值，之后快速下降。分析水分處理與對照TaNCED1表達(dá)水平之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，石4185在整個復(fù)水過程中始終顯著高于對照；臨旱2號在復(fù)水6～72 h內(nèi)顯著高于對照，在復(fù)水96 h時降至對照的水平；濟(jì)麥22、青麥6號、魯麥21及和尚頭在大部分復(fù)水時間段與對照的差異都不顯著；濰麥8號和鄭麥366在整個復(fù)水過程中始終低于對照，在復(fù)水12 h后與對照的差異達(dá)到顯著水平，在復(fù)水96 h時的表達(dá)量僅為對照的50%左右。

從整個水分脅迫和復(fù)水過程來看，水分脅迫導(dǎo)致小麥TaNCED1的表達(dá)水平顯著升高，復(fù)水后其表達(dá)水平相應(yīng)下降。表明小麥TaNCED1具有水分快速響應(yīng)的特點(diǎn)，即水分脅迫能夠誘導(dǎo)小麥TaNCED1的表達(dá)。不同材料間，TaNCED1對水分變化的響應(yīng)快慢程度及其表達(dá)水平存在顯著差異。

2.2 ABA含量變化分析

從表2可知，在土壤含水量降至50%左右之后，隨干旱脅迫時間延長，所有品種葉片中的ABA含量均呈現(xiàn)增加趨勢，但達(dá)到峰值以后，有的品種緩慢下降，有的品種快速下降然后再升高。不同品種ABA積累量到達(dá)峰值的時間也不相同：石4185出現(xiàn)在干旱脅迫計時后第6 h，魯麥21、和尚頭、臨旱2號和濰麥8號出現(xiàn)在第12 h，濟(jì)麥22和青麥6號出現(xiàn)在第24 h，鄭麥366出現(xiàn)在第96 h。

在復(fù)水過程中，小麥葉片中ABA含量的變化趨勢與TaNCED1的表達(dá)基本一致。除臨旱2號外，其余7個品種葉片中ABA的積累量均是先下降，然后再緩慢上升，但ABA總體變化幅度較小。濟(jì)麥22和魯麥21在整個復(fù)水過程中ABA的積累量始終與對照的水平相當(dāng)；青麥6號及和尚頭在復(fù)水96 h后恢復(fù)到對照的水平；其他品種則在多數(shù)復(fù)水階段都顯著低于對照。

表1 TaNCED1基因在干旱脅迫和復(fù)水條件下的表達(dá)水平Table 1 Expression level of TaNCED1 gene under drought stress and rehydration

數(shù)據(jù)用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，同一列數(shù)據(jù)后的不同字母表示處理間差異顯著(Duncan's多重比較，P<0.05)。下表同。

The data are expressed as “mean value ±standard deviation”, and the different letters within same column indicate significant differences among the different treatments(P<0.05). The same in table 2.

表2 ABA在干旱脅迫和復(fù)水條件下的積累情況Table 2 Accumulation of ABA under drought stress and rehydration ng·g-1 dry weight

2.3 TaNCED1表達(dá)和ABA積累的相關(guān)性

由于小麥中ABA的絕對含量很低，其含量的變化在各處理中表現(xiàn)不夠明顯。鑒于此，在分析中，分別對不同小麥品種各個處理的ABA含量進(jìn)行了歸一化處理，即將各處理的ABA含量數(shù)值分別除以其各自對照的ABA含量值。用相同方法，將各材料不同處理TaNCED1的表達(dá)水平也進(jìn)行了歸一化處理。對歸一化后的TaNCED1表達(dá)量與ABA含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除臨旱2號外，不同小麥品種葉片TaNCED1的相對表達(dá)量與ABA相對含量之間均符合y=aln(x)+b的對數(shù)相關(guān)關(guān)系(圖1)，系數(shù)a表示ABA的相對值隨TaNCED1的相對值變化的變幅大小。相關(guān)分析表明，不同小麥品種之間TaNCED1對ABA影響程度的大小有較明顯的差異。

3 討 論

本研究通過分析不同類型抗旱小麥品種在干旱脅迫和復(fù)水條件下葉片中TaNCED1表達(dá)量和ABA積累量的變化規(guī)律及其兩者之間的對應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)水分脅迫能夠誘導(dǎo)小麥TaNCED1的表達(dá)和ABA的積累，與水稻[21]、枸杞[22]和煙草[23]中的研究結(jié)果一致。但是在水稻和枸杞中發(fā)現(xiàn)NCED的表達(dá)和ABA的積累是一致的，而在煙草模擬干旱試驗中，NCED3的表達(dá)水平在脅迫處理12 h時達(dá)到最高值，而ABA的積累量在脅迫72h范圍內(nèi)隨著脅迫時間的延長持續(xù)升高[23]。

圖1 不同小麥品種在干旱脅迫和復(fù)水條件下 TaNCED1相對表達(dá)量和ABA相對含量的相關(guān)關(guān)系

表明不同作物之間NCED的表達(dá)和ABA的積累對于干旱脅迫的響應(yīng)并不是完全對應(yīng)的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，除臨旱2號外，其他7個小麥品種ABA的積累量與TaNCED1的表達(dá)量均呈對數(shù)相關(guān)關(guān)系。臨旱2號在受到水分脅迫后與其他7個品種的主要差異在于，在水分脅迫48 h時，TaNCED1還在高水平表達(dá)，而ABA的積累量卻下降到最低值；在復(fù)水過程中，臨旱2號在復(fù)水24 h以后TaNCED1表達(dá)呈下降的趨勢，而ABA的積累則呈上升的趨勢，這也與其余7個小麥品種不同。臨旱2號為什么和其他材料存在差異？是臨旱2號與其他品種的抗旱機(jī)制不同，還是其他因素造成的，本課題組正在從基因序列差異上進(jìn)行研究。

通過分析干旱脅迫和復(fù)水過程中不同小麥品種間TaNCED1表達(dá)和ABA積累的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同品種間TaNCED1對水分變化的響應(yīng)快慢程度及其表達(dá)水平存在顯著差異。NCED基因作為ABA合成間接途徑的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)水平調(diào)控著植物體內(nèi)的ABA含量[13-14, 24]，而ABA在逆境響應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用，因此，不同品種間TaNCED1對水分變化的響應(yīng)快慢程度及其表達(dá)水平的差異，是否是導(dǎo)致不同品種抗旱性不同的原因，有待進(jìn)一步研究。