何建清，張格杰，趙偉進，王孝先

(西藏農(nóng)牧學院，西藏林芝 860000)

小麥紋枯病(Rhizotoniacerealisvan der Hoeven apud.Boerema & Verhoeven)又稱立枯病、尖眼斑病，是由禾谷絲核菌(Rhizotoniacerealis) 引起的一種土傳真菌病害[1-2]，其分布范圍甚廣，早在 1934 年即有報道。小麥紋枯病對小麥產(chǎn)量影響較大，發(fā)病時一般減產(chǎn)10%～20%，嚴重時減產(chǎn)50%左右，甚至造成枯孕穗、枯白穗，造成顆粒無收[3-4]。近年來，由于氣候變暖、耕作、栽培制度變化等原因，小麥紋枯病的發(fā)生和為害日益嚴重，已成為我國小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙之一[5-6]。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)高抗紋枯病的小麥品種，控制該病害仍主要依靠苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇處理種子并于春季結(jié)合井岡霉素進行化學防治[7]。由于長期單一用藥，已使小麥紋枯病菌對常用殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，防治效果明顯降低[1]。因此，探索可替代化學防治的防治方法迫在眉睫。目前，以植物微生態(tài)學為基礎(chǔ)控制有害生物的防治技術(shù)已成為小麥紋枯病防治研究的熱點[8-9]。

植物內(nèi)生菌與植物在長期協(xié)同進化過程中形成了互惠互利、相互依存的關(guān)系。植物內(nèi)生菌已成為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[10]。對根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，根瘤中同時定殖著許多與根瘤菌不同的內(nèi)生菌，其中一些非共生細菌不引起植物病害，為根瘤內(nèi)生細菌[11]。研究表明，根瘤內(nèi)生菌具有生物固氮、促進植物生長、增強宿主抗逆、抗病能力等功能[12]。近年來，已有利用豆科植物根瘤內(nèi)生菌防治植物病害、促進植物生長的研究[13-16]。

砂生槐[Sophoramoorcroftiana(Benth.) Baker]又名西藏狼牙刺、刺柴、金雀花等，藏語名“吉瓦”，為豆科槐屬多年生矮灌木，是青藏高原特有種[17]。砂生槐主要分布在雅江流域中段的寬谷、兩側(cè)低山及拉薩河、年楚河等主要支流的寬谷內(nèi)，具有良好的防風固沙、涵養(yǎng)水源等重要生態(tài)作用[18]。目前對砂生槐的研究主要集中在種群和群落結(jié)構(gòu)、繁殖特性、固沙特性和物種多樣性等方面[19-21]，尚未見從砂生槐根瘤中篩選植物病原菌拮抗內(nèi)生細菌的研究。本研究擬從砂生槐根瘤中分離、篩選對小麥紋枯病菌的拮抗細菌，并對其進行生物學和抑菌性研究，為根瘤內(nèi)生菌的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物病原菌：小麥紋枯病菌(R.cerealis)由西藏農(nóng)牧學院生物技術(shù)中心真菌室提供。供試培養(yǎng)基參考李振高等[22]的方法配制。供試根瘤內(nèi)生細菌：從米林縣采集健康砂生槐的根瘤，分離獲得編號R1～R45共45株根瘤內(nèi)生細菌用于本研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥紋枯病菌拮抗內(nèi)生細菌初篩

采用兩點對峙法[23]。用滅菌打孔器制備直徑為0.6 cm病原菌菌餅，使用無菌接種針挑起菌餅(有菌面朝下)放于 PDA培養(yǎng)基中央，把2種不同編號內(nèi)生細菌均勻接種于距平板邊緣約2.5 cm 處，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 5 d，以不接種內(nèi)生細菌的病原菌菌落為對照(CK)；觀察并測量培養(yǎng)基中小麥紋枯病菌菌落直徑。按以下公式計算抑菌率。

抑菌率=(對照菌落直徑-對峙培養(yǎng)病原菌菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.2.2 小麥紋枯病菌拮抗內(nèi)生細菌復(fù)篩

采用菌絲生長速率法[24]。把1.2.1中抑菌率較高的內(nèi)生菌菌株接種到 NA 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、130 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng) 7 d 后，12 000 r·min-1離心 10 min收集上清液，過 0.45 μm 濾膜，在無菌條件下，將除菌發(fā)酵濾液與冷卻至55 ℃的 PDA 培養(yǎng)基按1∶9(v/v)混合均勻制成平板，以添加等量無菌水為對照，在平板中央接種生長旺盛的小麥紋枯病菌菌餅(直徑為 0.6 cm)，28 ℃恒溫培養(yǎng) 3～5 d，測量菌落直徑，計算抑菌率。每個處理 3 次重復(fù)。

1.2.3 所篩選內(nèi)生細菌除菌發(fā)酵濾液對小麥紋枯病菌的影響

選取大小一致的小麥紋枯病菌的菌核，在75%(v/v)乙醇溶液中處理5 min，無菌水沖洗5～6次，用無菌濾紙吸干水分備用。取1.2.2中抑菌率較高菌株的除菌發(fā)酵濾液與PDA培養(yǎng)基按1∶9(v/v)混合均勻制成平板，每個平板接種25個菌核，重復(fù)3次，以添加等量無菌水為對照；培養(yǎng)3～7 d，觀察菌核萌發(fā)情況。菌核萌發(fā)后繼續(xù)培養(yǎng)15 d，觀察菌核萌發(fā)后形成次生菌核的數(shù)量。

在顯微鏡(10×40)下觀察所篩選菌的抑菌圈邊緣小麥紋枯病菌菌絲生長情況，以正常生長的病原菌邊緣菌絲為對照。拍照并記錄結(jié)果。

1.2.4 所篩選內(nèi)生細菌的拮抗譜測定

采用1.2.1方法測定1.2.2中篩選出的強拮抗菌株對番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、馬鈴薯干腐病菌(Fusariumsulphureum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、梨黑星病菌(Venturiapiritna)和小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)的抑菌效果。

1.2.5 菌株的固氮、溶磷及產(chǎn)IAA能力測定

固氮能力測定參考胡春錦等[25]的方法，溶磷及產(chǎn)IAA 能力測定參考姚玉玲等[26]的方法。

1.2.6 所選菌株的活體篩選

盆栽試驗參照文才藝等[9]的方法進行。按下式計算病情指數(shù)和防治效果。

發(fā)病率= 發(fā)病株數(shù)/總株數(shù) ×100%，

病情指數(shù)=[∑(各級病株數(shù)×各級嚴重度) /(調(diào)查總株數(shù)×最高級別嚴重度)]×100

防治效果=[(對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)]×100%

1.2.7 所選菌株的生物學鑒定

形態(tài)、生理生化特征測定參考文獻[22] 和[27]的方法。

拮抗菌株對碳源、氮源的利用參考李振高等[22]的方法進行。碳源利用：將不同碳源于112 ℃滅菌20 min后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；用接種針蘸取菌懸液接入培養(yǎng)液中，置于30 ℃培養(yǎng)，觀察記錄生長情況。以葡萄糖為陽性對照，無碳培養(yǎng)基為陰性對照。氮源利用：將不同氮源于112 ℃滅菌20 min后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；用接種針蘸取菌懸液接入培養(yǎng)液中，置于30 ℃培養(yǎng)，觀察記錄生長情況。以蛋白胨為陽性對照，無氮培養(yǎng)基為陰性對照。供試碳、氮源各15 種(見表4)，每個處理 3 次重復(fù)。

16S rDNA 基因擴增、序列測定與系統(tǒng)分析參考孫建光等[28]的方法進行，利用 EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)和 NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行基因序列比對，系統(tǒng)進化分析采用軟件Mega(ver.5.1)進行。

2 結(jié)果和分析

2.1 內(nèi)生拮抗菌株初篩

采用平板對峙培養(yǎng)法對45 株砂生槐根瘤內(nèi)生細菌進行拮抗試驗，初步篩選出了對小麥紋枯病有拮抗作用的內(nèi)生細菌共4 株(表 1)，占分離菌株數(shù)量的8.89%。不同內(nèi)生細菌對小麥紋枯病菌的抑菌率不同。4株菌的抑菌圈直徑、菌落直徑和抑菌率差異均顯著；菌株R4的抑菌效果最好，抑菌率為57.11%，其次為菌株R11，抑菌率為45.44%，菌株R24和R25抑菌分別為32.33%和29.03%。

表1 對小麥紋枯病菌拮抗的砂生槐根瘤內(nèi)生細菌Table 1 Antagonistic endophytic bacteria from Sandliving sophora nodules against Rhizotonia cerealis

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Lower-case letters in same column indicate significant difference at 0.05 level. The same in tables 2-4.

2.2 砂生槐根瘤內(nèi)生拮抗細菌復(fù)篩

由表 2 可知，4株砂生槐根瘤內(nèi)生細菌除菌發(fā)酵濾液對小麥紋枯病菌抑菌率均達到62%以上，其中，抑制率最高為菌株R4，培養(yǎng)5 d時的抑菌率為98.2%；R25的抑菌率較低，其培養(yǎng)5 d時的抑菌率僅為62.9%。綜合初篩和復(fù)篩結(jié)果，選擇菌株R4開展后續(xù)研究。

2.3 菌株R4對小麥紋枯病菌菌核萌發(fā)的作用

菌株R4除菌發(fā)酵濾液對小麥紋枯病菌菌核萌發(fā)的試驗結(jié)果(圖1)顯示，菌株R4除菌發(fā)酵濾液對小麥紋枯病菌菌核萌發(fā)有明顯的抑制作用。7 d后菌株R4除菌發(fā)酵濾液處理的小麥紋枯病菌菌核形成菌絲的萌發(fā)率為8.0%，而CK的萌發(fā)率達到100%；但15 d后，菌株R4除菌發(fā)酵濾液處理的菌核全部萌發(fā)，說明菌株R4的除菌發(fā)酵濾液只是延遲小麥紋枯病菌菌核的萌發(fā)而不能殺滅菌核。可能是由于菌核的抗逆性很強的緣故，這一結(jié)論還需進一步進行驗證。經(jīng)觀察，15 d后經(jīng)菌株R4除菌發(fā)酵濾液處理的小麥紋枯病菌菌核萌發(fā)后形成次生菌核的數(shù)量較對照減少了93.8%。

2.4 菌株R4對小麥紋枯病菌菌絲的作用

觀察可知，對照小麥紋枯病菌菌絲粗細均勻，顏色一致(圖2A) 。菌株R4除菌發(fā)酵濾液處理后，小麥紋枯病菌菌絲變粗、節(jié)間縮短、小分枝增多，局部原生質(zhì)濃縮，形成瘤狀結(jié)。

表2 拮抗內(nèi)生細菌代謝液對小麥紋枯病菌的抑菌率Table 2 Inhibitory ratio of endogenous bacterial metabolites on Rhizotonia cerealis %

A:對照；B:菌株R4發(fā)酵濾液處理。 A:CK; B:Treated with fermentation filtrate liquid of strain R4.

2.5 菌株R4的抗菌譜

平板對峙試驗結(jié)果表明，菌株R4具有較廣的抑菌譜。對供試的番茄灰霉病菌、小麥根腐病菌、玉米大斑病菌、馬鈴薯干腐病菌、油菜菌核病菌、梨黑星病菌和小麥赤霉病菌7種病原真菌均有不同程度的抑制作用。菌株R4對以上7種病原真菌的抑菌圈半徑分別為9、8、11、10、8、6和 9 mm。表明菌株R4對所測試的植物根部病原菌和葉斑病菌均具有良好的抑制作用。

2.6 菌株R4的固氮、溶磷及產(chǎn)IAA性

利用半微量凱氏定氮法測定菌株R4的固定氮量，采用溶磷圈和鉬銻抗比色法測定其有效磷增量，采用 Salkowski 比色法測定菌株分泌植物生長激素(IAA)的功能。結(jié)果(表3)表明，菌株R4培養(yǎng) 10 d的固定氮量達到 44.0 mg·L-1，比 CK 增加了 14.06倍；有機磷有效含量為92.70mg·L-1,比CK增加了3.62倍；無機磷有效含量為15.47 mg·L-1，比 CK 增加了1.17倍；分泌 IAA 量為38.25 μg·L-1，比 CK 增加了14.48倍，差異均顯著。

A:對照；B:菌株R4發(fā)酵濾液處理。 A:CK; B:Treated with fermentation filtrate liquid of strain R4.

A：小麥赤霉病菌， 菌株R4 處理；B：小麥赤霉病菌，CK； C:馬鈴薯干腐菌，菌株R4 處理；D：馬鈴薯干腐菌，CK。

2.7 菌株R4發(fā)酵液對小麥紋枯病的防治效果

盆栽試驗表明，菌株R4發(fā)酵液和R4除菌發(fā)酵濾液處理小麥紋枯病植株的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著降低。發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對小麥紋枯病的防治效果分別為73.82%和54.39%；發(fā)酵液防治效果顯著優(yōu)于除菌發(fā)酵濾液的，二者的發(fā)生率和病情指數(shù)顯著優(yōu)于對照。因此，菌株R4可作為小麥紋枯病的生防菌資源。

表3 培養(yǎng)基及菌株R4發(fā)酵液中的氮、磷、IAA含量Table 3 Content of N,P and IAA in culture medium and strain R4 fermentation liquid mg·L-1

表4 拮抗菌R4發(fā)酵液對小麥紋枯病的防治效果Table 4 Control effect of fermentation liquid of antagonistic endophytic bacterium strain R4 from Sandliving sophora nodule against Rhizotonia cerealis

2.8 菌株R4形態(tài)、生理特征和種類鑒定

菌株R4菌體呈短桿狀，大小為1.0～1.2 μm ×3.0～4.0 μm，革蘭氏陽性菌，能形成芽胞；形成芽胞時，菌體近端膨大，胞囊明顯膨脹；芽胞橢圓形，位于胞囊一端(圖 4A)。

在LB培養(yǎng)平板上，培養(yǎng) 5～7 d 形成直徑為 1～10 mm 左右的菌落，不規(guī)則，單菌落平坦，乳白色，不透明，有光澤(圖 4B)。

菌株R4對接觸酶反應(yīng)呈陽性，對氧化酶反應(yīng)呈陰性，對吲哚反應(yīng)呈陰性，甲基紅試驗(M-R試驗)呈陰性，乙酰甲基甲醇試驗(V-P試驗)呈陽性，硝酸鹽還原呈陽性。能水解淀粉，利用葡萄糖和蔗糖時產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，可利用乳糖，能使明膠液化，使牛奶胨化，不產(chǎn)硫化氫，可利用檸檬酸鹽。在0～2% NaCl 溶液中生長，最適生長溫度為 30～32 ℃，4 ℃下生長緩慢，生長最適 pH 7～9。

菌株R4可以作為唯一碳源利用的有D-纖維二糖、D-海藻糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-半乳糖、松三糖、棉子糖、D-甘露糖、D-甘露醇；不能作為唯一碳源利用的有七葉苷、山梨糖、菊糖、L-阿拉伯糖、羧甲基纖維素鈉。

菌株R4利用氮源的種類較多，對提供的15種氮源均能利用(表4)。

將 16S rDNA 序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行 BLAST 比對，結(jié)果表明，菌株 R4 與類芽胞桿菌屬(Paenibacillussp.)的同源性較高，將其與類芽胞桿菌屬全部 11個種的菌株的序列進行遺傳距離計算，用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖 5)。從圖 5 可知，菌株R4與類芽胞桿菌屬(Paenibacillussp.)的菌株都劃分在同一簇內(nèi)，且與土地類芽胞桿菌PaenibacillusterraeAM141 菌株(登錄號為AF391124)親緣關(guān)系最為接近，相似性為99.2%。根據(jù)菌株R4的形態(tài)特征、生理生化特性及 16S rDNA 基因序列比對結(jié)果，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[27]，菌株R4被鑒定為土地類芽孢桿菌Paenibacillusterrae。

A:菌株R4的菌體顯微形態(tài); B:菌株R4 在LB培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)。

表4 菌株R4對部分碳源、氮源的利用Table 4 Utilization of partly carbon sources and nitrogen sources by strain R4

圖5 菌株R4的16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

3 討 論

利用植物內(nèi)生細菌抑制植物病原微生物的生物防治國內(nèi)外已開展許多研究，但從豆科植物特殊組織—根瘤中篩選病原菌拮抗菌株的研究較為少見[13]。根瘤內(nèi)生細菌不僅將植物作為其棲息場所，而且對宿主植物有促生、防病、內(nèi)生聯(lián)合固氮等廣泛的生物學作用。根瘤內(nèi)生細菌相對于其他組織部位的內(nèi)生細菌而言，對土壤的適應(yīng)性更強，用于土傳性病害的生物防治更具優(yōu)勢[11]。本研究從砂生槐根瘤內(nèi)分離到45 株內(nèi)生細菌，經(jīng)初篩和復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)菌株R4對小麥紋枯病菌具較強拮抗作用；平板試驗中除菌發(fā)酵液的抑菌率為98.2%；盆栽試驗中，菌株R4帶菌發(fā)酵液和除菌發(fā)酵液對小麥紋枯病的防效分別為73.82%和54.39%，說明菌株R4活性代謝物質(zhì)在其生防過程中發(fā)揮重要作用。帶菌發(fā)酵液對小麥紋枯病的防治效果顯著高于除菌發(fā)酵液，則說明菌株R4活性代謝物質(zhì)在發(fā)揮生防作用的同時，菌體在小麥體內(nèi)的定殖與其在盆栽土壤中持續(xù)發(fā)揮防治作用具有密切關(guān)系，本研究結(jié)果與文才藝等[9]試驗結(jié)果類似。

土地類芽胞桿菌(P.terrae)是2003年在印度發(fā)現(xiàn)的新種，目前有土地類芽胞桿菌7個菌株被作為功能菌株進行報道[29]。主要為水藻收獲絮凝劑菌株AM141、木聚糖酶產(chǎn)生菌HPL-003、產(chǎn)生N2O 的菌株 MH72、代謝木質(zhì)素衍生的芳香族化合物的菌株以及于文清等[29]從大豆根周土壤分離到的具有固氮、溶磷、解鉀、活化硅、抑制尖孢鐮刀菌的菌株NK3-4。本研究篩選到的土地類芽胞桿菌R4具有固氮、溶磷、分泌IAA、抗菌譜廣，對小麥紋枯病菌具有較好的防治效果等功能，在國內(nèi)外未見報道，可為新生物制劑的研發(fā)提供新的微生物資源，為化肥、農(nóng)藥減量化施用的可行性研究提供理論支持。