封 琦，張笑意，吳 植，郭長(zhǎng)明，朱善元*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300； 2.江蘇南農(nóng)高科動(dòng)物藥業(yè)有限公司，江蘇泰州 225529)

替米考星(Tilmicosin)是一類從泰樂菌素衍生得到的廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；Backstrom等[1]發(fā)現(xiàn)替米考星在體外對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、支原體以及某些革蘭氏陰性菌都有極好的抗菌效果。Du等[2]還發(fā)現(xiàn)替米考星可通過(guò)改變胞內(nèi)pH從而對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)產(chǎn)生較強(qiáng)的抗病毒作用。Shen等[3]研究了替米考星在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)替米考星在動(dòng)物體內(nèi)具有吸收快，消除緩慢的特點(diǎn)。替米考星在養(yǎng)豬生產(chǎn)中主要用于預(yù)防和治療呼吸道疾病[4-5]。但替米考星本身味道苦，不耐酸，在胃液作用下降低藥效并傷胃。為了解決傳統(tǒng)劑型的不足，發(fā)展了包被工藝的替米考星顆粒，該技術(shù)不僅解決了苦味問題，還實(shí)現(xiàn)了藥物的腸道溶解，避免了藥物對(duì)胃的刺激和胃酸對(duì)藥物的損害，提高了使用效果[6]。本試驗(yàn)研究樹脂包被工藝的替米考星顆粒在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性，并將其作為受試制劑與國(guó)際國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的主流產(chǎn)品進(jìn)行了生物等效性分析，為新藥研發(fā)和臨床用藥提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6頭健康的閹割過(guò)的小公豬，體重(20.7±2.6)kg，購(gòu)自江蘇蘇姜種豬有限公司。試驗(yàn)前于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房隔離器內(nèi)飼養(yǎng)1 w，期間正常投喂不含任何抗生素的全價(jià)料。

1.2 藥品和試劑 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品(CAS:108050-54-0，規(guī)格100 mg，含量93.9%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；受試制劑替米考星腸溶顆粒(20%樹脂包被，T)，由江蘇南農(nóng)高科動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供；國(guó)外參比制劑泰勇(批號(hào)C742086，20%替米考星顆粒，R1)，國(guó)內(nèi)參比制劑菲嚴(yán)康(批號(hào)DUH161204，20%替米考星粉劑，R2)分別由禮來(lái)(上海)動(dòng)物保健有限公司和河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司和提供；磷酸、乙酸銨、二丁胺均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、四氫呋喃等色譜純?cè)噭門EDIA公司產(chǎn)品。磷酸二丁胺配制采用700 mL純凈水+168 mL二丁胺+70 mL磷酸的順序依次添加，注意傾倒緩慢并充分?jǐn)嚢瑁?待冷卻至室溫時(shí)，用磷酸少量多次添加調(diào)節(jié)pH至2.5～2.6,加水補(bǔ)齊體積到1000 mL，過(guò)濾后備用。

1.3 儀器設(shè)備 Agilent-1260高效液相色譜儀, 含四元泵和紫外檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；Eppendorf 5424高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；HSE-24D固相萃取裝置(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；UGC-24M氮?dú)獯蹈蓛x(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)。

1.4 給藥方案及采樣設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用隨機(jī)三制劑、三周期自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，插胃導(dǎo)管進(jìn)行口灌給藥，根據(jù)體重及有效含量換算,每頭豬單劑量口服10 mg/kg體重。每次服藥間隔清洗期為14 d。服藥后分別于5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h前腔靜脈采血，每次采血5 mL，置于肝素鈉浸潤(rùn)過(guò)的塑料離心管中，3500 r/min離心10 min,吸取上層血漿，冰箱-20 ℃凍存。

1.5 血藥濃度檢測(cè) 將SPE柱(BondElute C18，100 mg 5 mL)置于固相萃取裝置上，先用10 mL甲醇活化、10 mL超純水進(jìn)行平衡；然后精確量取1 mL豬血漿樣品，添加0.75 mL 10%高氯酸，12000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)SPE柱；再用10 mL 5%氨水、5 mL 35%乙腈淋洗；強(qiáng)力抽干10 min后，5 mL洗脫液洗脫于試管中，將其置于30 ℃金屬浴條件下用氮?dú)獯抵粮稍?；最后用流?dòng)相將其溶解，精確定容至2 mL。渦旋60 s，靜置10 min，0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，供HPLC分析。洗脫液配方及色譜檢測(cè)條件具體參考農(nóng)業(yè)部國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[7]：選擇Agilent TC -C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；以水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃(805∶115∶25∶55)為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；進(jìn)樣量為40 μL。

1.6 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)所測(cè)得血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件Kinetica5.0經(jīng)典房室模型進(jìn)行曲線擬合，分析藥代動(dòng)力學(xué)特性；采用非房室模型主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行相對(duì)生物利用度評(píng)估；采用方差分析、90%置信區(qū)間及雙單側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行生物等效性分析[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 圖1為空白血漿色譜圖，由圖2可知目標(biāo)化合物的兩個(gè)峰與雜質(zhì)完全分離，無(wú)相互干擾；反式異構(gòu)體與順式異構(gòu)體保留時(shí)間分別為6.657 min和7.733 min，均控制在8 min左右，提高了分析效率；在藥物濃度0.05～20 μg/mL范圍內(nèi)，替米考星峰面積(順式和反式異構(gòu)體的峰面積之和)與濃度呈線性相關(guān)，其回歸方程為Y=674366X-37579，r=0.9996；血漿中檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)采用逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，根據(jù)峰面積計(jì)算三倍信噪比和十倍信噪比，得到的結(jié)果為1.32 μg/L和4.41 μg/L；加標(biāo)回收率(在0.05～5 μg/mL)為86%～113%；采用1 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品每天測(cè)5次，連測(cè)5 d，根據(jù)每天和不同天數(shù)間峰面積的RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差)計(jì)算得到:日內(nèi)精密度為2.38%～3.02%，日間精密度3.87～5.33%，能滿足后續(xù)藥代動(dòng)力學(xué)分析要求。

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)分析 三種制劑的平均藥時(shí)曲線見圖3，20%樹脂包被替米考星、泰勇、菲嚴(yán)康的血藥峰濃度Cmax分別為0.2830、0.2815、0.4087 μg/mL，藥物達(dá)峰時(shí)間Tmax分別為4、0.75、1 h，表明20%樹脂包被替米考星藥物峰濃度與國(guó)外參比制劑泰勇相接近，吸收速率明顯慢于泰勇和菲嚴(yán)康。藥時(shí)曲線房室模型擬合結(jié)果表明三種制劑均符合一級(jí)吸收，權(quán)重為1的二室開放模型，具體藥代參數(shù)見表1。

圖1 空白血漿色譜圖Fig 1 Chromatogram of blank plasma

圖2 血漿 5 μg/mL替米考星加標(biāo)色譜圖Fig 2 Chromatogram of plasma spiked with 5 μg/mL tilmicosin

圖3 三種制劑平均藥時(shí)濃度曲線Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of three formulations

表1 房室模型分析Tab 1 Compartmental analysis

表2 非房室模型分析Tab 2 Non-compartmental analysis

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis results

NS表差異不顯著(P>0.05)

表4 雙向單側(cè)t檢驗(yàn)及90%置信區(qū)間分析結(jié)果Tab 4 Results of two one-sided t test and 90% confidence interval analysis

3 討論與結(jié)論

3.1 藥代動(dòng)力學(xué)特性 目前關(guān)于豬體內(nèi)的替米考星藥代動(dòng)力學(xué)報(bào)道，主要以傳統(tǒng)劑型磷酸替米考星及替米考星水溶液為主[8-11]。本研究中采用單劑量(10 mg/kg b.w.)口灌給藥后，20%樹脂包被替米考星顆粒在體內(nèi)的藥時(shí)曲線符合帶吸收的二室開放模型，這與此前的報(bào)道結(jié)果相一致[8,12]。其吸收速率常數(shù)Ka為0.7003 h-1，小于報(bào)道的替米考星原粉(6.586 h-1)及替米考星微囊制劑(2.471 h-1)(按每頭豬單劑量30 mg/kg b.w.口灌給藥)[12]，這表明20%樹脂包被替米考星顆粒比替米考星原粉及替米考星微囊制劑吸收要慢，從而起到了藥物緩釋作用；其消除速率常數(shù)K10為0.0071 h-1，表觀清除速率CL/F為0.2259 mg/kg/h，均比報(bào)道的磷酸替米考星可溶性粉要小(按每頭豬單劑量9.6 mg/kg b.w.口灌給藥，K10為0.1456 h-1，CL/F為2.5379 mg/kg/h)，這說(shuō)明20%樹脂包被替米考星顆粒比磷酸替米考星消除要慢；其中央室表觀分布容積V/F(c)為32 L/kg同樣大于磷酸替米考星(26.2789 L/kg)，這表明20%樹脂包被替米考星顆粒組織穿透能力強(qiáng)，很可能在豬肺部出現(xiàn)了藥物組織富集[13]；同時(shí)將自身參數(shù)比較，還可發(fā)現(xiàn)K10要遠(yuǎn)小于Ka，這表明該劑型同樣遵循吸收迅速，消除緩慢的藥代動(dòng)力學(xué)特性，從側(cè)面驗(yàn)證了前人的結(jié)論[3,14-15]。

非房室模型分析發(fā)現(xiàn)20%樹脂包被替米考星顆粒藥物濃度達(dá)峰實(shí)測(cè)值tmax為4 h，要晚于替米考星原粉(tmax-0.75 h)[12]、磷酸替米考星可溶性粉(tmax-2 h，單劑量口服9.6 mg/kg b.w.)[8]、20%磷酸替米考星顆粒Resmitil?(tmax-2 h)[16]以及其余報(bào)道(浙江國(guó)邦制藥有限公司，tmax-3 h)[15]；藥物濃度Cmax實(shí)測(cè)值為0.2830±0.0292 μg/mL,比磷酸替米考星可溶性粉小(0.4818±0.1366 μg/mL，單劑量口服9.6 mg/kg b.w.)，表明藥物吸收較慢但比較充分；藥物平均駐留時(shí)間MRT(75.8230±4.7082 h)和藥物消除半衰期t1/2(52.1867±5.6972 h)均大于20%磷酸替米考星顆粒Resmitil?(MRT-27.9±4.4 h；t1/2-23.5±4.7 h)[16],這表明20%樹脂包被替米考星顆粒在豬體內(nèi)的藥物作用時(shí)間更為持久，消除緩慢，這與經(jīng)典房室模型分析的藥代動(dòng)力學(xué)特征相吻合。

3.2 生物等效性分析 生物等效性分析一般采用非房室模型參數(shù)，由tmax參數(shù)可知，20%樹脂包被替米考星顆粒藥物平均達(dá)峰時(shí)間(4 h)要晚于菲嚴(yán)康(1 h)和泰勇(0.75 h)；從參數(shù)Cmax來(lái)看，20%樹脂包被替米考星顆粒藥物峰濃度(0.2830±0.0292 μg/mL)與泰勇(0.2815±0.0291 μg/mL)幾乎相等，比菲嚴(yán)康小了幾乎1/2(0.4087±0.0421 μg/mL)；這表明20%樹脂包被替米考星顆粒在生物安全性上(峰濃度幾乎相同)與泰勇接近一致，但要優(yōu)于菲嚴(yán)康(預(yù)實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)報(bào)道中的常規(guī)劑量30 mg/kg b.w.灌服，出現(xiàn)胃腸道刺激反應(yīng))，同時(shí)相較于泰勇和菲嚴(yán)康緩釋作用明顯。

AUC0-∞作為衡量生物等效性的主要關(guān)鍵性指標(biāo)，同時(shí)還能反映出藥物在機(jī)體內(nèi)的暴露程度，由相對(duì)生物利用度的計(jì)算結(jié)果可知,20%樹脂包被替米考星顆粒AUC0-∞要大于泰勇和菲嚴(yán)康，這表明20%樹脂包被替米考星顆粒在體內(nèi)能夠長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮藥效。結(jié)合方差分析(P>0.05)、雙向單側(cè)t檢驗(yàn)(t1、t2>t1-0.05(8))及90%置信區(qū)間分析(均落在國(guó)標(biāo)規(guī)定的80%～125%內(nèi))綜合判斷可得出,20%樹脂包被替米考星顆粒、泰勇和菲嚴(yán)康三種制劑間具備生物等效性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示20%樹脂包被替米考星顆?？诜o藥的總體藥代動(dòng)力學(xué)特征與國(guó)際、國(guó)內(nèi)參比制劑相吻合，三者之間具有生物等效性，同時(shí)還有良好的緩釋作用和一定的生物安全性，相較于同類產(chǎn)品在今后的獸醫(yī)臨床用藥中具有良好的推廣和應(yīng)用價(jià)值。