羅思思，謝芝勛，謝志勤，謝麗基，鄧顯文，范 晴，黃嬌玲，張艷芳，王 盛，曾婷婷，張民秀

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)根據(jù)表面糖蛋白(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)抗原性差異分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)有18種HA亞型(H1-H18)和11種NA亞型(N1-N11)[1-2]。2013年12月6日，江西省南昌市一名73歲女子罹患H10N8甲型禽流感，因呼吸衰竭、休克死亡，全球首次發(fā)現(xiàn)人類感染H10N8亞型AIV可導(dǎo)致死亡。截至2014年2月15日，在江西共確診3人感染H10N8亞型AIV，其中2人死亡[3-4]。H10和N8亞型AIV在家禽和野鳥(niǎo)散發(fā)，主要是H10N7和H3N8[5]。H10N8亞型AIV感染人雖散發(fā)，但是否存在后續(xù)的感染，或是否存在H10亞型和其他N亞型、其他H亞型和N8亞型的感染，均需監(jiān)測(cè)H10和N8亞型AIV的感染情況，因此，十分有必要建立一種同時(shí)鑒定H10亞型和N8亞型AIV的檢測(cè)方法，為這兩個(gè)亞型的檢測(cè)提供有效方法和技術(shù)儲(chǔ)備。

目前，診斷H10亞型和N8亞型AIV的方法主要是病毒分離鑒定，作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但存在檢測(cè)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)；免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)均需特定的陽(yáng)性血清，在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性。多重RT-PCR是在普通RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，已成功應(yīng)用于很多病原體的檢測(cè)[6-8]。H10亞型和N8亞型的分子生物學(xué)檢測(cè)方法十分欠缺，本研究旨在建立一種同時(shí)檢測(cè)H10亞型、N8亞型和所有亞型AIV的三重RT-PCR方法，同時(shí)對(duì)3個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，以節(jié)約檢測(cè)試劑，簡(jiǎn)化反應(yīng)程序。

1 材料與方法

1.1 毒株和主要試劑 AIV毒株(H3N8、H6N8、H1N1、H3N2、H4N6、H6N1、H9N2和H11)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和傳染性法氏囊病毒(IBDV)由廣西獸醫(yī)研究所分離鑒定保存；AIV毒株(H2N3、H8N4、H10N3、H12N5)由香港大學(xué)惠贈(zèng)；AIV毒株(H10N7、H5N1、H7N2、H13N6、H14N5、H15N9和H16N3)cDNA由美國(guó)康涅狄格大學(xué)惠贈(zèng)；AIV毒株(H1N7和H11N9)由美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)惠贈(zèng)。Minibest viral RNA/DNA extraction kit ver.4.0和反轉(zhuǎn)錄試劑和PCR premix購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)基因庫(kù)中H10亞型AIV 的HA基因、N8亞型AIV的NA基因和所有亞型AIV的M基因，用DNAStar軟件比對(duì)序列找出保守區(qū)域，用primer 5.0軟件分析引物的擴(kuò)增條件，每個(gè)基因均設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，并用NCBI Blast初步驗(yàn)證引物的特異性。序列送至廣州invitrogen公司合成。引物合成后，通過(guò)實(shí)際試驗(yàn)進(jìn)行平行篩選，最終各自篩選出最佳的1對(duì)引物(表1)，用于H10亞型、N8亞型和所有亞型AIV的檢測(cè)。

表1 引物信息Tab 1 The information of primers

1.3 病毒RNA提取與RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

按照Minibest viral RNA/DNA extraction試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提病毒RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR premix 12.5 μL，正、反引物終濃度在0.1～0.6 μmol/L之間調(diào)整，cDNA 2 μL，以無(wú)RNA酶的超純水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序如下： 94 ℃ 5min；94 ℃ 40 s, 50～57 ℃之間調(diào)整 40 s, 72 ℃ 40 s, 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用HA、NA和M基因全長(zhǎng)引物，分別以H10亞型、N8亞型AIV和任一亞型AIV的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到基因全長(zhǎng)的目的片段，將這3個(gè)基因片段分別連接至pGEM T-easy載體上，將含有HA、NA和M基因片段的正確序列的重組質(zhì)粒分別命名為H10、N8和M。

1.5 特異性試驗(yàn) 按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件，用所建立H10亞型和N8亞型AIV三重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)1.1項(xiàng)所列毒株的RNA/DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)其特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將“1.4”構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行等比例混合，并將混合質(zhì)粒10倍梯度稀釋，按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件，用所建立的方法對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)其敏感性。

1.7 臨床樣品檢測(cè) 用所建立的方法對(duì)120份活禽市場(chǎng)棉拭子(同一只家禽的咽喉、泄殖腔拭子為一份)樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將這120份樣品接種10日齡SPF雞胚增殖病毒，用血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)對(duì)尿囊液進(jìn)行HA亞型的鑒定，將鑒定過(guò)的HA毒株，用NA基因全長(zhǎng)引物PCR擴(kuò)增和測(cè)序，確定NA亞型。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過(guò)引物之間濃度的優(yōu)化，H10-F和H10-R引物終濃度為0.2 μmol/L，N8-F和N8-R引物終濃度為0.4 μmol/L，M-F和M-R引物終濃度為0.2 μmol/L。通過(guò)退火溫度的優(yōu)化，確定最佳退火溫度為52 ℃。

2.2 特異性試驗(yàn) 該法對(duì)H10和N8亞型AIV的混合模板擴(kuò)增出3條特異性條帶，分別為267、464和693 bp；對(duì)H10Ny(如H10N7、H10N3，y≠8)亞型AIV擴(kuò)增出2條特異性條帶，片段大小為267和693 bp；對(duì)HxN8(如H6N8、H3N8，x≠10)亞型AIV擴(kuò)增出2條特異性條帶，片段大小為464和693 bp；對(duì)其他亞型AIV擴(kuò)增出693 bp M基因通用檢測(cè)的條帶；而常見(jiàn)禽病病原體均未擴(kuò)增出任何條帶。所有毒株的擴(kuò)增結(jié)果均與實(shí)際相符，表明該法特異性強(qiáng)。部分毒株的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 敏感性試驗(yàn) 該法對(duì)濃度為108～10拷貝/μL的H10、N8和M混合質(zhì)粒進(jìn)行敏感性測(cè)定，圖2結(jié)果顯示：濃度為108～104拷貝/μL的混合質(zhì)粒均有3條明顯的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，片段大小分別為267 bp(H10)、464 bp(N8)、693 bp(M)；濃度為103拷貝/μL的混合質(zhì)粒有2條明顯的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，片段大小分別為267 bp(H10)、464 bp(N8)，已檢測(cè)不到693 bp M基因條帶；濃度為100拷貝/μL混合質(zhì)粒的檢測(cè)均無(wú)擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明，H10和N8亞型AIV的最低檢測(cè)限為103拷貝/μL，AIV M基因引物最低檢測(cè)限為104拷貝/μL。

M. 100 bp Marker; 1. H10+N8; 2. H10N7; 3. H6N8; 4. H1N1; 5. H1N7; 6. H2N3; 7. H3N2; 8. H4N6; 9. H5N1; 10. H6N1; 11. H7N2; 12. H8N4; 13. H9N2; 14. H11N9; 15. H12N5; 16. H13N6; 17. H14N5; 18. H15N9; 19. H16N3; 20. NDV;21. IBV; 22. ILTV; 23. IBDV; 24. 空白對(duì)照?qǐng)D1 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig 1 The results of specificity test

M. 100 bp Marker; 1. 108拷貝/μL; 2. 107 拷貝/μL; 3. 106 拷貝/μL; 4. 105 拷貝/μL; 5. 104 拷貝/μL; 6.103拷貝/μL; 7. 100拷貝/μL; 8.陰性對(duì)照?qǐng)D2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig 2 The results of sensitivity test

2.4 臨床樣品檢測(cè) 用所建立的H10N8亞型AIV三重RT-PCR方法對(duì)120份活禽市場(chǎng)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出2份H10Ny亞型AIV(y≠8)，3份HxN8(如x≠10)，與HI和測(cè)序結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

在2013年12月江西發(fā)現(xiàn)人類感染H10N8之前，公共資源只能查到26株H10N8的序列;H10亞型曾有感染人的報(bào)道，分別是2004年埃及H10N7和2010年澳大利亞H10N7，病人出現(xiàn)結(jié)膜炎和輕度呼吸道癥狀，N8亞型未有感染人的報(bào)道[5];我國(guó)僅有兩例H10N8亞型AIV感染家禽的報(bào)道，一株是2007年從湖南洞庭湖濕地抽檢的水樣中分離到的[9]，被命名為A/environment/Dongting Lake/Human/3-9/2007(H10N8)，另一株則是于2012年1月從廣東活禽市場(chǎng)的鴨中分離出來(lái)[10]，被命名為A/Duck/Guang-dong/E1/2012(H10N8)。此次江西人類感染株與之前的H10N8不同，尤其6個(gè)內(nèi)部基因均來(lái)源于H9N2。2013年爆發(fā)的H7N9毒株的6個(gè)內(nèi)部基因也來(lái)源于H9N2，但H10N8的6個(gè)內(nèi)部基因與H7N9不同。有報(bào)道對(duì)江西第一例H10N8亞型AIV人類感染株(A/Jiangxi-Donghu/346/2013)的受體結(jié)合特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明對(duì)人源受體親和力極弱，并不具備在人群中傳播的能力[4]。

目前，H10N8感染人有3個(gè)病例，在人類屬于散發(fā)，但已能在活禽市場(chǎng)中分離出雞H10N8[11]。我們對(duì)廣西活禽市場(chǎng)進(jìn)行AIV調(diào)查，H10較多與其他亞型混合感染，尚未單獨(dú)分離出H10亞型，N8亞型鑒定出的有H3N8、H4N8、H6N8，尚未分離出H10N8毒株[12]。由于樣品限制，并未用H10N8毒株對(duì)該法進(jìn)行驗(yàn)證，在特異性試驗(yàn)中，只用H10和N8亞型混合模板來(lái)驗(yàn)證該三重RT-PCR的特異性，還需更多臨床樣品對(duì)該法進(jìn)行驗(yàn)證?；谖覀儗?duì)AIV的日常監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)相比以前，H10亞型和N8亞型分離率有所增加，并鑒于發(fā)生了H10N8感染人的案例，且之前就有H10亞型與其他N亞型(H10N7、H10N2、H10N1)[13-15]，其他H亞型與N8亞型的報(bào)道(H3N8、H4N8、H6N8)，因此本研究想建立同時(shí)鑒定H10亞型和N8亞型AIV檢測(cè)方法，對(duì)這兩個(gè)亞型進(jìn)行追蹤檢測(cè)，為AIV的有效防控提供參考資料。

本研究將M基因通用檢測(cè)所有亞型AIV的引物，與H10亞型、N8亞型AIV的引物混合在同一反應(yīng)體系中，對(duì)樣品中含有H10亞型和N8亞型的，多一道驗(yàn)證其確屬AIV的感染，對(duì)樣品中含有其他亞型AIV的，也能檢測(cè)出，讓我們了解到是否存在AIV的感染，為是否需要進(jìn)一步確認(rèn)其他亞型AIV提供參考。引物設(shè)計(jì)和濃度的優(yōu)化是該法成功建立的關(guān)鍵。本研究針對(duì)H10、N8和M基因序列保守區(qū)域，結(jié)合primer 5.0軟件的引物參數(shù)，初步篩出候選引物，再用NCBI-BLAST模擬檢查引物的特異性，但引物是否真正可行，還需經(jīng)過(guò)實(shí)際的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。通過(guò)優(yōu)化3對(duì)引物之間的濃度，用單一模板(H10亞型、N8亞型、不同亞型AIV)、混合模板(H10和N8亞型)和常見(jiàn)禽病病原體作為模板對(duì)該法進(jìn)行特異性的驗(yàn)證，用含有H10、N8和M基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行敏感性測(cè)定，結(jié)果表明所建立的H10亞型和N8亞型AIV三重RT-PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性高，一管即可檢測(cè)H10、N8和M三個(gè)目的基因，具有有效、簡(jiǎn)便、快速、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)，為H10亞型和N8亞型AIV調(diào)查監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。