劉裕峰，朱天輝，劉應(yīng)高，譙天敏，李姝江，龍旭梅，韓 珊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，成都 611130）

首次發(fā)現(xiàn)動植物組織能夠分解過氧化氫產(chǎn)生氧氣可追溯到1811年，后被發(fā)現(xiàn)可能是某種酶起作用，直到1901年，該酶被命名為過氧化氫酶（hudrogen peroxidase），又名觸酶（catalase，CAT）[1]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在動物、植物及微生物體內(nèi)均含有大量的CAT。病原菌的入侵會打破超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）等活性氧類（reactive oxygen species，ROS）物質(zhì)的動態(tài)平衡，導(dǎo)致活性氧物質(zhì)在植物體內(nèi)大量積累，長時間的積累而得不到有效的清除，會損傷植物細(xì)胞膜系統(tǒng)，破壞蛋白質(zhì)功能，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株死亡[2]。CAT 作為植物體內(nèi)主要的抗氧化酶之一，它能夠催化植物光呼吸、線粒體電子傳遞及脂肪酸氧化等過程中產(chǎn)生的H2O2生成O2和H2O[3]。有報道稱[4]，一分子CAT 每分鐘能將大約6×106個H2O2分子轉(zhuǎn)化成H2O 和O2。因此，CAT 對H2O2的清除具有較高的特異性，并且在去除H2O2過量中起關(guān)鍵作用[5]，使得植物不受傷害。

大量研究表明，CAT 與植物的抗病性存在著緊密的聯(lián)系。Pei Z.M.等[6]研究發(fā)現(xiàn)，缺失CAT 基因的煙草體內(nèi)H2O2含量增加，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；Jiang M.等[7]發(fā)現(xiàn)，植物的CAT 活性能夠被水楊酸抗病因子抑制，導(dǎo)致過多的ROS 產(chǎn)生，進(jìn)而引起植物系統(tǒng)性的防御反應(yīng)；病原菌浸染植物的初期階段，CAT 催化H2O2生成O2，觸發(fā)苯甲酸生成水楊酸，導(dǎo)致系統(tǒng)性防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生[8]；轉(zhuǎn)玉米CAT2 基因的煙草遭受病原菌侵染后，誘發(fā)嚴(yán)重的超敏反應(yīng)，進(jìn)而有效地控制細(xì)菌的進(jìn)一步感染[9]；轉(zhuǎn)基因煙草植株體內(nèi)酵母CAT1 基因的過量表達(dá)，能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的抗病毒侵染能力[10]。

植物CAT 基因家族由多個基因編碼，其表達(dá)受病原、溫度、光照、干旱等多種因子的調(diào)控[11]。目前，已從火龍果[12]、人參[13]、甘薯[14]、南瓜[15]、水稻[16]、壇紫菜[17]等多種植物中克隆獲得CAT 基因并進(jìn)行相關(guān)分析。但目前關(guān)于板栗CAT 基因的相關(guān)研究較少，異源表達(dá)方面的研究尚屬空白。本研究在板栗轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[18]的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR 技術(shù)克隆獲得板栗CAT 基因全長cDNA 序列，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，同時構(gòu)建pET28a-CmCAT 原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行了融合表達(dá)，旨在了解其基因結(jié)構(gòu)和功能，為進(jìn)一步研究板栗抗病的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試板栗品種為“石豐”，種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院崇州基地；植物RNA 提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T 載體購自大連TaKaRa 公司；DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；表達(dá)載體pET-28a 由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理學(xué)實驗室提供；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI、T4DNA 連接酶購自NEB（北京）有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA 的提取與cDNA 的合成

以板栗幼葉作為RNA 提取材料，使用植物多糖多酚RNA 提取試劑盒（北京華越洋生物）提取總RNA。提取的總RNA 經(jīng)BioMate 3S（BioMate 3S，Thermo Scientific）及1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和完整性。cDNA 第一鏈的合成使用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（TaKaRa，大連），具體操作步驟參照說明書進(jìn)行。合成的cDNA保存于-80 ℃，用于后續(xù)試驗。

1.3 CmCAT 基因的克隆

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中已公布的其他植物CAT基因核苷酸序列，將其與板栗基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.hardwoodgenomics.org/）進(jìn)行同源比對，尋找并分析板栗CAT 基因EST 序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計一對特異性引物CmCAT-F：5'-ATG GATCCCTACAAGTACCG-3'，CmCAT-R：5'- TCA CATTGTTGGCCTCAC-3'。以反轉(zhuǎn)錄的板栗cDNA為模板，進(jìn)行PCR 擴增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行純化回收，回收片段連接pMD19-T 載體并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，于氨芐青霉素（ampicillin，Amp）培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單克隆菌落進(jìn)行PCR 鑒定，將菌落PCR 檢測的陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.4 CmCAT 基因序列的生物信息學(xué)分析

通過軟件DNAMAN6.0 查找序列的ORF，并將其翻譯為氨基酸序列；通過在線NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）的Blast 進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列相似性分析；應(yīng)用ClustalX1.81 和ESPript3.0軟件對其編碼蛋白進(jìn)行多重對比分析；運用在線蛋白分析工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）對其編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析；利用工具ScanProsite（http：//prosite.expasy.org/scanprosite）對其編碼蛋白的功能位點及功能域進(jìn)行預(yù)測分析；利用軟件MEGA6.05 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)前期克隆獲得的CmCAT 基因CDS 序列，設(shè)計一對含酶切位點的引物CmCAT-EcoRI-F：5'-CGGAATTCATGGATCCCTACAAGTACCG-3'（下劃線為EcoRI 酶切位點），CmCAT-XhoI-R：5'-CCGC TCGAGTCACATTGTTGGCCTCAC-3'（下劃線為XhoI酶切位點）。以pMD19-T-CmCAT 質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴增，擴增條件同1.3。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進(jìn)行純化回收?；厥债a(chǎn)物與pET-28a 載體質(zhì)粒均進(jìn)行EcoRI 和XhoI 雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后，使用T4 DNA 連接酶16 ℃連接12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），于卡那霉素（kanamycin，Kan）培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，挑取單個菌落于LB 液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，提取鑒定正確的菌液質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和XhoI 雙酶切鑒定后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 檢測

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21（DE3）。挑取含有pET28a-CmCAT 重組質(zhì)粒的BL21（DE3）單菌落，接種于含有Kan（50 μg/mL）LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃（200 r/min）過夜振蕩培養(yǎng)。次日按1∶100 的接種量進(jìn)行擴增培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600值約為0.6～0.8 時，分別進(jìn)行不同條件的誘導(dǎo)。首先利用不同濃度IPTG（終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）誘導(dǎo)3 h，收取1 mL 菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測；以上述最優(yōu)IPTG 濃度進(jìn)行誘導(dǎo)時間（1、2、3、4、5、6 h）的優(yōu)化。

最后以最優(yōu)IPTG 濃度和最優(yōu)誘導(dǎo)時間進(jìn)行不同溫度（25 ℃、30 ℃、37 ℃）的誘導(dǎo)優(yōu)化并進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白的可溶性分析。收集1 mL 菌液于1.5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心10 min，取沉淀，加入100 μL PBS（pH7.4）懸浮菌體，12 000 r/min 離心1 min，收集菌體，再次加入60 μL PBS（pH 值7.4）懸浮菌體后，4 ℃超生破碎，12 000 r/min 離心10 min。收集超聲破碎后的上清液和沉淀（加入60 μL 8 mol/L尿素重懸，4 ℃螯合30 min）。分別加入4×蛋白上樣緩沖液20 μL 混勻，煮沸10 min，冰上冷卻后，12 000 r/min 離心10 min，取10 μL 上清進(jìn)行SDSPAGE（5%濃縮膠，12%分離膠）電泳檢測。所有的SDS-PAGE 電泳檢測均以pET28a-BL21（DE3）以及未誘導(dǎo)的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗CmCAT 基因全長cDNA 的擴增與克隆

使用CmCAT-F 和CmCAT-R 特異性引物，對CmCAT 基因完整閱讀框（ORF）進(jìn)行RT-PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)一條約為1 500 bp 的單一條帶，通過pMD19-T 克隆測序，發(fā)現(xiàn)獲得了長度為1 479 bp 的CmCAT 基因片段（見圖1）。

圖1 CmCAT 基因PCR 擴增電泳圖Figure 1 The electrophoresis of PCR product of CmCAT gene

2.2 板栗CmCAT 基因的核苷酸序列分析

板栗CmCAT 基因全長cDNA 序列為1 479 bp，通過ORF Finder 在線軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列為一個完整的閱讀框，無5'非編碼區(qū)和3'非編碼區(qū)，編碼492 個氨基酸（見圖2），將該基因cDNA 序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，注冊登錄號：KY312851。CmCAT基因核苷酸序列在GenBank 中進(jìn)行序列相似性對比，結(jié)果顯示該序列與核桃（Juglans regia，XM_01 8980866.1）CAT 基因序列一致性最高，為85%，與毛果楊（Populus trichocarpa，XM_002301884.1）、茶（Camellia sinensis、KR819178.1）、蘿卜（Raphanus sativus，AF031318.2）等多種植物CAT 基因序列一致性均在77%以上。表明克隆獲得的CmCAT 基因?qū)儆诎謇踹^氧化氫酶基因家族成員之一。

2.3 板栗CmCAT 蛋白的氨基酸序列分析

圖2 CmCAT 基因cDNA 序列及其所推導(dǎo)的氨基酸序列Figure 2 cDNA sequence of CmCAT gene and its deduced amino acid sequence

利用ExPASy ProtParam tool 對CmCAT 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相關(guān)信息分析，預(yù)測CmCAT 蛋白分子質(zhì)量為56.883 kDa；理論pI 為5.83；在組成CmCAT 蛋白的所有氨基酸中，精氨酸（Arg）為使用頻率最高的氨基酸，占總氨基酸量的8.1%，半胱氨酸（Cys）為使用頻率最低的氨基酸，占總氨基酸量的1.0%；其含有61個負(fù)電性氨基酸殘基（Asp + Glu），59 個正電性氨基酸殘基（Arg + Lys），分子式為C2550H3865N719O736S16；預(yù)測不穩(wěn)定指數(shù)為36.20，屬于穩(wěn)定性蛋白；脂肪族氨基酸指數(shù)69.15；總平均疏水指數(shù)-0.586，屬于親水性蛋白。使用ClustalX1.81 與ESPript3.0 軟件并結(jié)合BlastP 對CmCAT 蛋白序列進(jìn)行多序列相似性分析，結(jié)果顯示（見圖3），CmCAT 蛋白序列與蔓花生（Arachis duranensis，XP_015934030.1）等多種植物CAT 蛋白序列同源性達(dá)到82%以上。通過Blastp 和ScanProsite 工具對CmCAT 蛋白功能域進(jìn)行分析，均發(fā)現(xiàn)其含有catalase 保守結(jié)構(gòu)域，位于序列第14-492 位氨基酸之間?？梢?，CmCAT 屬于CAT 蛋白家族成員之一。通過在線工具M(jìn)otif 發(fā)現(xiàn)，CmCAT 蛋白還具有2 個重要的功能位點，分別是過氧化氫酶近端活性位點（catalase proximal active site signature），位于第54-70 位氨基酸之間，序列為FERERIPERVVHARGAS；過氧化物酶近血紅素位點（catalase proximal heme-ligand signature），位于第344-352 位氨基酸之間，序列為RIFAYGDTQ（見圖2）。進(jìn)一步說明CAT 蛋白在進(jìn)化過程中是較為保守的，CmCAT 蛋白與其他植物的CAT 蛋白結(jié)構(gòu)和功能是較為相似的。

2.4 板栗CmCAT 蛋白的進(jìn)化分析

為了解不同植物CAT 間的進(jìn)化關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載了23 個物種CAT 氨基酸序列，利用MEGA6.05 軟件，采用鄰接法，重復(fù)檢測1 000 次，構(gòu)建其與CmCAT 氨基酸序列之間的進(jìn)化關(guān)系（見圖4）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，24 個物種CAT 聚集為兩大類群，草本植物CAT 聚為一簇，木本植物CAT 聚為一簇，符合植物的生物進(jìn)化規(guī)律。板栗CmCAT 與核桃JrCAT 同為一個分支，親緣關(guān)系最近，推測它們可能由同一個祖先進(jìn)化而來。其次，與薔薇科（Rosaceae）植物親緣關(guān)系較近，而板栗CmCAT 與葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜、黃瓜、絲瓜等植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 CmCAT 與其他植物CAT 蛋白質(zhì)序列多重對比Figure 3 Sequence multialignment of the deduced CmCAT protein with other plant CAT proteins

圖4 Neighbor-joining（NJ）方法構(gòu)建CmCAT 蛋白與其他植物CAT 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 4 Neighbor-joining （NJ） method to build CmCAT protein and other plant CAT protein phylogenetic tree

2.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以pMD19-T-CmCAT 質(zhì)粒為模板，使用CmCAT-EcoRI-F/CmCAT-XhoI-R 引物擴增獲得帶酶切位點的CmCAT 基因片段，將PCR 產(chǎn)物純化回收后與pET-28a 載體分別進(jìn)行EcoRI/XhoI 雙酶切，分別回收目的片段與載體酶切產(chǎn)物并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取單菌落進(jìn)行PCR 鑒定（見圖5），條帶與預(yù)期大小一致；提取PCR 鑒定正確的陽性菌液質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗證（見圖6），獲得預(yù)期大小的酶切片段。將驗證正確的陽性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序鑒定，測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，CmCAT 基因片段與pET-28a 載體成功連接，表明pET28a-CmCAT 重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.6 板栗CmCAT 蛋白的原核表達(dá)

挑取pET28a-CmCAT-BL21（DE3）單菌落過夜培養(yǎng)作為母液。在37 ℃下進(jìn)行不同IPTG 濃度誘導(dǎo)表達(dá)6 h，以未誘導(dǎo)的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）、pET28a-BL21（DE3）以及誘導(dǎo)的pET28a-BL21（DE3）（IPTG 終濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)3 h）空載體作為對照。結(jié)果表明，對照組無目的蛋白表達(dá)，實驗組在各IPTG 濃度下均能誘導(dǎo)大量表達(dá)，組間表達(dá)量并無多大差異，分子量約為60 kDa，與預(yù)期大小一致（見圖7）。因此，以終濃度0.2 mmol/L 作為IPTG 最優(yōu)誘導(dǎo)濃度。

圖5 pET28a-CmCAT-DH5α PCR 檢測Figure 5 PCR detection of pET28a-CmCAT-DH5α

圖6 pET28a-CmCAT 雙酶切鑒定Figure 6 Double enzyme identification of pET28a-CmCAT

使用上述最優(yōu)表達(dá)條件（37 ℃、0.2 mmol/L IPTG），對pET28a-CmCAT-BL21（DE3）最優(yōu)表達(dá)時間進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。將OD600 值為0.6～0.8 區(qū)間的pET28a-CmCAT-BL21（DE3）菌液在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG 下進(jìn)行不同時間的誘導(dǎo)（分別為誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6 h）。從圖8中可以看出，隨著誘導(dǎo)時間的增加，目的蛋白的量也在逐漸增加，誘導(dǎo)6 h 獲得的目的蛋白量最大。而對照中載體與pET28a-CmCATBL21（DE3）未誘導(dǎo)均未有目的蛋白出現(xiàn)。因此，以誘導(dǎo)6 h 作為pET28a-CmCAT-BL21（DE3）在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG 下最優(yōu)誘導(dǎo)時間長度。

最后對pET28a-CmCAT-BL21（DE3）進(jìn)行不同溫度（25 ℃、30 ℃、37 ℃）誘導(dǎo)，同時檢測表達(dá)的目的蛋白的可溶性。SDS-PAGE 蛋白電泳分析顯示，3個溫度下均有大量目的蛋白出現(xiàn)，且對照無此條帶（見圖9），在30 ℃下誘導(dǎo)獲得的目的蛋白最為豐富。在上清中無明顯目的蛋白出現(xiàn)，其主要以包涵體的形式存在。

圖7 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）誘導(dǎo)濃度優(yōu)化Figure 7 Concentration optimization of pET28a-CmCATBL21（DE3） IPTG induction

圖8 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）誘導(dǎo)時間優(yōu)化Figure 8 Induction time optimization of pET28a-CmCATBL21（DE3）

圖9 pET28a-CmCAT-BL21（DE3）誘導(dǎo)溫度優(yōu)化及可溶性檢測Figure 9 Optimization of the induction temperature of pET28a-CmCAT-BL21（DE3）and its solubility detection

3 討論與結(jié)論

植物中復(fù)合抗氧化防御體系主要由抗氧化酶組成。其中，CAT 是第一個被發(fā)現(xiàn)和描述的[12]。植物遭受病原微生物侵染后會產(chǎn)生大量的H2O2[19]，而H2O2的積累會對植物組織、細(xì)胞產(chǎn)生巨大的傷害。CAT 對H2O2具有較高的親和性[20]，能有效清除過多的H2O2，在防御逆境脅迫和維持植物細(xì)胞氧化還原平衡方面具有重要的意義[21]。通過RT-PCR 方法，成功克隆出板栗CmCAT 基因，該基因全長1 479 bp，為一個完整的ORF，編碼492 個氨基酸。Blast 分析表明，CmCAT 基因核苷酸序列及氨基酸序列與其他植物的CAT 基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性分別在77%和82%以上，顯示其較高的保守性。Motif Scan 分析顯示，CmCAT 蛋白序列具有CAT 蛋白家族的catalase 結(jié)構(gòu)域，同時還具有該蛋白家族2個保守的功能位點：過氧化氫酶近端活性位點和過氧化物酶近血紅素位點。分析板栗CmCAT 蛋白序列與其他23 個物種CAT 蛋白序列之間的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)草本植物和木本植物分為兩個大的分支，其中板栗與核桃的親緣關(guān)系最近，與葫蘆科草本植物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

利用基因工程技術(shù)成功獲得pET28a-CmCAT重組載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG 誘導(dǎo)后獲得分子量約為60 kDa 的目的條帶，比預(yù)測的CmCAT 蛋白分子量（56.883 kDa）略大，pET28a 載體自帶的His-tag 標(biāo)簽序列是造成這種偏差的主要原因之一[22]，同時，誘導(dǎo)獲得的目的蛋白與大豆GmCAT 基因在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白分子量大小（60 kDa）一致[23]。隨后從IPTG 濃度、誘導(dǎo)時間及誘導(dǎo)溫度方面進(jìn)行最優(yōu)誘導(dǎo)條件的篩選，以期獲得更大量的目的蛋白。通過SDS-PAGE 電泳分析發(fā)現(xiàn)，30 ℃，0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)菌株6 h 獲得的目的蛋白量最大，但主要以包涵體的形式存在，且在誘導(dǎo)溫度降低的條件下（25℃）仍為包涵體。大腸桿菌已經(jīng)成功地用于表達(dá)來自細(xì)菌和低等真核生物的活性重組CAT[24]。然而，利用大腸桿菌系統(tǒng)尚未得到可溶性植物CAT 重組蛋白[25]。陳金峰等[23]將大豆3 個CAT 基因連接pET28a 載體后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行融合表達(dá)，獲得的融合蛋白也均為包涵體。彭丹等[26]發(fā)現(xiàn)，鹽穗木CAT 基因在BL21（DE3）中，通過低溫誘導(dǎo)能獲得可溶性的目的蛋白，但表達(dá)量較低。其所用的表達(dá)載體為pET32a，可能對植物CAT 基因在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用。N.Engel 等[25]發(fā)現(xiàn)，昆蟲細(xì)胞系能夠作為獲得植物來源的活性重組CAT 的替代方法。作為真核生物，昆蟲細(xì)胞系在遺傳上更相容，可以提供足夠的蛋白質(zhì)折疊機器（分子伴侶）的支持，以及足夠的血紅素代謝池，并入新合成的重組血紅素蛋白。

本研究成功從板栗中克隆了一個CAT 基因，通過多種生物信息學(xué)軟件分析了CmCAT 基因的同源性、蛋白結(jié)構(gòu)以及分子進(jìn)化等相關(guān)信息，初步分析了CmCAT 基因在不同條件下的原核表達(dá)情況，為深入研究CmCAT 基因的功能和揭示板栗抗病過程中的分子機制奠定了基礎(chǔ)。