成冬，郭磊，姜天龍，周仁義，劉文博，羅鵬，梅潤宏，楊旭浩

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001）

線粒體自噬是一種選擇性自噬，通過自噬體—溶酶體系統(tǒng)去除損傷和功能障礙的線粒體，確保細胞內(nèi)線粒體功能穩(wěn)定和細胞存活。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨的唯一細胞類型，線粒體功能影響軟骨細胞存活，因此線粒體自噬與骨性關(guān)節(jié)炎 （osteoarthritis，OA） 的發(fā)病緊密相關(guān)［1］。最近發(fā)現(xiàn)17 β-雌二醇不僅與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡有關(guān)，還與自噬相關(guān)。已有研究［2］證明，在Raw 264.7細胞中17 β-雌二醇可以通過激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。17 β-雌二醇可以通過ER-ERK-mTOR途徑促進成骨細胞自噬，保護成骨細胞免受無血清誘導(dǎo)的細胞凋亡［3］。G蛋白耦聯(lián)雌激素受體30 （G-protein coupled estrogen receptor-30，GPR30） 是一種7次跨膜G蛋白耦聯(lián)雌激素受體，能介導(dǎo)快速的細胞反應(yīng)。細胞自噬中，新合成的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 （microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3） 經(jīng)剪切修飾變成胞漿蛋白LC3-Ⅰ，之后轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的伸展擴張。TOM20是線粒體外膜復(fù)合體轉(zhuǎn)位亞基，參與線粒體前體蛋白轉(zhuǎn)運，被認為是線粒體自噬的潛在標志物［4］。熱休克蛋白60 （heat shock protein 60，Hsp60） 主要定位于線粒體內(nèi)，可通過催化過氧化氫還原成水，保護線粒體免于活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 誘導(dǎo)的損傷。新的證據(jù)表明，雌激素可通過GPR30對脊髓損傷進行保護；可通過改變PI3K/Akt-mTOR信號通路調(diào)節(jié)細胞自噬，從而降低脊髓損傷后的損傷程度［5］。本研究擬探討17 β-雌二醇是否通過抑制線粒體自噬保護ATDC5軟骨細胞，以及17 β-雌二醇是否通過GPR30/PI3K/Akt途徑調(diào)節(jié)線粒體自噬。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

17 β-雌二醇購自美國Sigma-Aldrich公司。含有L-谷氨酰胺和HEPES以及胎牛血清的DMEM/F12購自美國Logan公司。選擇性GPR30拮抗劑 （G15） 購自美國Tocris Bioscience公司。P38抑制劑、JNK抑制劑、PI3K抑制劑、抗-GPR30 （sc-48525-R，多克隆，WB 1∶200，IF 1∶50） 、抗Lamp2 （sc-8100，多克隆，IF 1∶50） 、抗TOM20 （sc-11415，多克隆，WB 1∶200，IF 1∶50） 、抗-LC3 （sc-376404，單克隆，WB 1∶100） 和抗Hsp60 （sc-1052，多克隆，WB 1∶200） 均購自美國Santa Cruz Biotechnology公 司。Anti-Total/phosphor-Akt購自美國Abcam公司。具有alexa fluor 555標記的驢抗兔IgG （P0179） 的免疫熒光染色試劑盒購自中國江蘇Beyotime Biotechnology公司。IFKine?綠色結(jié)合驢抗山羊IgG （A24231） 購自美國Abbkine公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：購買小鼠軟骨原代細胞系A(chǔ)TDC5（中國南京Kebai公司） 。用含有5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)ATDC5細胞。將細胞在37 ℃含有5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次培養(yǎng)基。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，將細胞用不同濃度的17 β-雌二醇（ 0 mol/L，10-9mol/L，10-8mol/L和10-7mol/L，含或不含15 μ mol/L的G15或20 μ mol/L的LY294002） 處理24 h。

1.2.2 免疫熒光染色（ immunofluorescence staining，IF） 分析：將ATDC5軟骨細胞在24孔板中培養(yǎng)孵化后，用4%多聚甲醛固定并加入0.1 mol/L磷酸鹽（ pH7.3） 緩沖30 min。標本固定后，用PBS洗滌10 min。用0.1%TritonX-100處理細胞30 min以透化細胞膜，再用PBS洗滌10 min。用含有5%牛血清白蛋白的TBST封閉30 min，加入特異性一抗Lamp2抗體（ 1∶50），TOM20抗體（ 1∶50） 或GPR30抗體（ 1∶50），4 ℃過夜。用PBS洗滌細胞10 min，并加入二抗IgG（ A24231，1∶1 000） 和IgG（ P0179，1∶1 000） 反應(yīng)30 min。DAPI染色5 min后，PBS洗滌15 min。通過Olympus FV1000共焦激光掃描顯微鏡觀察，峰值發(fā)射波長在518 nm（ 綠色） 和565 nm（ 紅色） 。

1.2.3 Western blotting：用PBS洗滌ATDC5軟骨細胞，通過加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（ 中國Beyotime公司） 和磷酸酶抑制劑（ 中國KeyGen公司） 的放射性免疫沉淀測定緩沖液（ 中國Beyotime公司） 獲得總蛋白質(zhì)；用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（ 中國Beyotime公司）測定其濃度。采用SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF，70 V處理1.5 h。為了阻斷非特異性結(jié)合，室溫下將PVDF膜在脫水脫脂牛乳中處理120 min，用含Tween 20的TBS洗滌3次，持續(xù)30 min。加入一抗，在4℃下孵育過夜。TBST洗滌30 min，與辣根過氧化物酶綴合的抗物二抗體室溫下孵育2 h。TBST洗膜3次共30 min，采用BeyoECL plus試劑盒使蛋白質(zhì)顯像。

1.2.4 細胞活力和增殖檢測：將ATDC5軟骨細胞接種于96孔板（ 2×103/孔），培養(yǎng)24 h。將細胞轉(zhuǎn)移至不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中（ 含有1 7β-雌二醇10-7mol/L），37 ℃孵育24 h后，加入10 μ L MTT試劑（ 5 mg/mL），37 ℃孵育4 h。除去培養(yǎng)基，用100 μ L二甲基亞砜溶去甲臜晶體。所有實驗均重復(fù)3次。參考570 nm波長，使用酶標儀（ 光譜最大加384微板讀數(shù)器，德國Ismaning公司） 測量光密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 17 β-雌二醇增強ATDC5軟骨細胞中GPR30的表達

Western blotting分析 （圖1A、1B） 和IF染色 （圖1C） 結(jié)果顯示，GPR30在ATDC5中有表達。用不同濃度的17 β-雌二醇 （0，10-9，10-8和10-7mol/L，含或不含15 μ mol/L的G15） 處理ATDC5軟骨細胞24 h，結(jié)果顯示17 β-雌二醇以劑量依賴性方式提高GPR30的表達水平，濃度為10-7mol/L時GPR30表達水平最高 （P ＜0.05） （圖1A、1B） 。此外，Western blotting結(jié)果還顯示GPR30表達水平以時間依賴性方式遞增 （圖1A） 。IF染色顯示，17 β-雌二醇提高了GPR30在細胞膜和細胞質(zhì)中的表達 （P ＜ 0.05） （圖1C） 。

圖1 17 β-雌二醇增強ATDC5軟骨細胞內(nèi)GPR30的表達Fig.1 17 β-estradiol can stimulate the activation of GPR30 expression in ATDC5 chondrocytes

2.2 17 β-雌 二 醇 通 過 調(diào) 節(jié)ATDC5細 胞 中LC3、TOM20和Hsp60的磷酸化抑制線粒體自噬

為了解17 β-雌二醇對線粒體自噬蛋白質(zhì)活性的影響，本研究檢測了LC3、TOM20和Hsp60的表達。與對照組相比，用17 β-雌二醇處理的細胞LC3-Ⅱ的表達水平顯著降低；而17 β-雌二醇和G15或PI3K抑制劑對細胞內(nèi)LC3-Ⅱ的表達沒有影響 （圖2） 。與對照組相比，用17 β-雌二醇處理的細胞內(nèi)TO M20和Hsp60的表達水平更高；而G15或PI3K抑制劑對TOM20和Hsp60的表達沒有影響 （圖3） 。

2.3 17 β-雌 二 醇 通 過GPR30/PI3K/Akt途 徑 保 護ATDC5軟骨細胞

圖2 17 β-雌二醇通過ATDC5細胞中GPR30/PI3K/Akt通路調(diào)控LC3、TOM20和Hsp60的表達Fig.2 17 β-estradiol regulates the expression of LC3，TOM20，and Hsp60 in mitophagy through the GPR30/PI3K/Akt pathway in ATDC5 cells

圖3 17 β-雌二醇通過ATDC5細胞中GPR30/PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)線粒體自噬。Fig.3 17 β-estradiol regulates mitophagy through the GPR30/PI3K/Akt pathway in ATDC5 cells

Western blotting結(jié)果顯示，用17 β-雌二醇處理的細胞Akt磷酸化水平升高，總Akt表達水平保持不變。當(dāng)用G15 （15 μ mol/L） 或PI3K抑制劑 （20 μ mol/L） 處理細胞時結(jié)果相反 （圖2），表明ATDC5細胞中17 β-雌二醇 （10-7mol/L） 可以通過GPR30激活PI3K/Akt途徑。此外，mTOR磷酸化 （p-mTOR） 的抑制程度可作為自噬途徑活化的指標。結(jié)果顯示，17 β-雌二醇 （10-7mol/L） 可提高ATDC5細胞內(nèi)p-mTOR的水平，而在用G15或mTORi （10-7mol/L） 處理的細胞中則結(jié)果相反（圖3），表明ATDC5細胞中17 β-雌二醇可通過GPR30激活p-mTOR，抑制線粒體自噬。

此外，17 β-雌二醇對ATDC5細胞的作用可以被GPR30抑制劑、PI3K抑制劑或mTORi消除 （圖2、3），表明17 β-雌二醇通過GPR30/PI3K/Akt途徑抑制線粒體自噬。

為了確定雌二醇是否通過GPR30/JNK或GPR30/P38途徑保護ATDC5軟骨細胞，用添加或不添加JNK抑制劑 （10 μ mol/L） 、P38抑制劑 （10 μ mol/L）或G15 （15 μ mol/L） 或混合2種抑制劑的17 β-雌二醇（10-7mol/L） 處理無血清培養(yǎng)的ATDC5細胞24 h。結(jié)果表明，用17 β-雌二醇處理的ATDC5細胞中，P38和JNK沒有磷酸化改變；用G15、P38抑制劑或JNK抑制劑處理細胞，也未觀察到相反的結(jié)果 （圖3） 。MTT結(jié)果顯示，17 β-雌二醇處理的ATDC5軟骨細胞的增殖和活力顯著高于對照組 （P ＜ 0.05），且ATDC5軟骨細胞的增殖和活力可被G15和PI3K抑制劑減弱 （圖4） 。提示17 β-雌二醇可通過GPR30/PI3K/Akt途徑促進無血清培養(yǎng)的ATDC5軟骨細胞的增殖和活力。

圖4 17 β-雌二醇通過GPR30 PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)ATDC5軟骨細胞增殖與活力Fig.4 17 β-estradiol can protect ATDC5 chondrocytes via the GPR30/PI3K/Akt pathway

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，用雌二醇處理的ATDC5細胞中含有較少的自噬體，經(jīng)雌二醇處理的ATDC細胞中TOM20陽性顆粒與Lamp2［6］減少，表明線粒體自噬在ATDC5細胞中可被17 β-雌二醇抑制。然而，雌激素保護軟骨細胞免受損害的分子機制目前尚未明確。本研究結(jié)果顯示，用17 β-雌二醇處理的ATDC5細胞增殖和活力顯著高于對照組，證實了17 β-雌二醇對軟骨細胞的保護作用。

氧化應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體損傷，如果損傷超過線粒體內(nèi)膜的膜電位，則功能失調(diào)的線粒體將通過自噬途徑被去除，也稱線粒體自噬。細胞雖可通過線粒體自噬途徑去除氧化應(yīng)激損傷的線粒體，保護細胞免于凋亡，但過量的線粒體自噬將導(dǎo)致大量重要細胞成分減少，從而導(dǎo)致細胞死亡［7］。已有研究表明，自噬可能是通過消除生長促進分子和細胞器，如蛋白質(zhì)p62，降低細胞的生長速率。當(dāng)p62耗竭或去除時，mTOR不能被激活，導(dǎo)致細胞生長受限［8］。針對過量的自噬，線粒體能夠采用其他機制，如融合/裂變周期以及線粒體解折疊蛋白反應(yīng)的胞內(nèi)質(zhì)控機制，來修復(fù)或去除受損的線粒體，以確保線粒體維持其正常功能［9］。細胞還可通過增加線粒體伴侶蛋白 （Hsp60，Hsp70） 和蛋白酶表達激活線粒體解折疊蛋白反應(yīng)途徑，以保護線粒體免于功能障礙。血清饑餓培養(yǎng)的HeLa細胞可誘導(dǎo)線粒體自噬，隨著LC3-Ⅱ表達的增加可降低TOM20的表達［10］。本研究也發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ的表達水平下降，而Hsp60和TOM20的表達水平上升。因此，17 β-雌二醇可能通過抑制線粒體自噬來保護ATDC5軟骨細胞，并有助于修復(fù)線粒體損傷。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17 β-雌二醇可通過GPR30和PI3K/Akt-mTOR信號通路抑制ATDC5細胞線粒體自噬，表明PI3K/Akt-mTOR信號通路可作為治療OA的新途徑。已有研究［11-12］表明，17 β-雌二醇可通過結(jié)合心肌細胞和癌細胞內(nèi)的GPR30受體執(zhí)行其生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)，GPR30在ATDC5軟骨細胞中也有表達，17 β-雌二醇 （0，10-9，10-8和10-7mol/L） 以劑量依賴性方式增加GPR30的表達水平，提示17 β-雌二醇可能通過作用于GPR30發(fā)揮其生理調(diào)節(jié)功能。Western blotting結(jié)果顯示，17 β-雌二醇對ATDC5軟骨細胞GPR30表達水平的誘導(dǎo)具有時間依賴性，此誘導(dǎo)作用可被GPR30拮抗劑阻斷，導(dǎo)致LC3-Ⅱ高表達，TOM20和Hsp60低表達。提示17 β-雌二醇可能是通過GPR30抑制線粒體自噬。

本研究結(jié)果顯示，用17 β-雌二醇培養(yǎng)ATDC5軟骨細胞24 h后，細胞內(nèi)Akt磷酸化水平增加，總Akt表達水平保持不變。據(jù)文獻報道，mTOR受PI3K正調(diào)控，是自噬的負調(diào)控因子。與對照組相比，用17 β-雌二醇處理的ATDC5細胞中p-mTOR的表達水平顯著升高。17 β-雌二醇對ATDC5細胞的作用可被GPR30抑制劑、PI3K抑制劑或mTORi消除，表明17 β-雌二醇通過GPR30/PI3K/Akt途徑抑制線粒體自噬。已有研究［13］發(fā)現(xiàn)，17 β-雌二醇通過PI3K/Akt信號通路抑制腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)人髓核細胞凋亡。17 β-雌二醇還可以通過PI3K/Akt/caspase-3途徑降低大鼠髓核細胞的凋亡發(fā)生率［3-5］。此外，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與線粒體氧化應(yīng)激負相關(guān)，而PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活能減少ROS的產(chǎn)生［14-15］。本研究中，為了驗證17 β-雌二醇是否也可以通過JNK和P38調(diào)節(jié)線粒體自噬，用P38抑制劑和JNK抑制劑預(yù)處理細胞30 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理前后細胞內(nèi)p-P38和P-JNK的水平無統(tǒng)計學(xué)差異。表明17 β-雌二醇不能通過JNK或P38信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控線粒體自噬。