王子文，劉兆玉

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽 110004）

肝細胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC） 是肝臟最常見的原發(fā)性腫瘤，是全世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。目前手術(shù)切除和肝臟移植是治療HCC最為有效的方式，但這僅限于早期腫瘤，而且肝臟移植受肝捐贈者的限制導(dǎo)致可操作性不強［1-2］。針對RAF/VEGFR/PDGFR通路的多激酶抑制劑Sorafenib是目前美國食品和藥物管理局 （Food and Drug Administration，F(xiàn)DA） 批準(zhǔn)的唯一用于肝癌治療的藥物，然而它在改善患者存活時間方面的功效還比較有限［3］。因此，尋找新的能夠識別HCC的治療靶點極其必要。

微小RNA （microRNA，miRNA） 是進化保守的非編碼小RNA，通過與靶基因的3’UTR區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解或mRNA翻譯的抑制，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。miRNA已被證明是多種腫瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，根據(jù)其靶基因的生物學(xué)功能，可以發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的作用［4］。研究表明，多種miRNA在肝癌標(biāo)本中存在異常表達，并通過調(diào)節(jié)細胞增殖、生存和侵襲性等調(diào)節(jié)肝細胞癌的進程。因此，推測某些miRNA可能成為治療HCC的潛在的新靶點［5-6］。miR-510已經(jīng)被證明在多種腫瘤中存在異常表達的現(xiàn)象，但是目前尚未見其在HCC中表達情況的報道。

c-MYC癌基因的過度表達是HCC中的常見事件，研究證明c-MYC可以通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR和RAS/MAPK等信號通路促進HCC的進程。本研究擬探討miR-510在HCC中的表達情況及其與c-MYC的關(guān)系，旨在研究miR-510對HCC的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HCC衍生內(nèi)皮細胞HepG2 （中科院典藏細胞庫）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 （天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；miR-510擬似物、miR-510抑制物 （廣州銳博生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒、臺盼藍 ［生工生物工程 （上海） 股份有限公司］；c-MYC、GAPDH及相應(yīng)二抗 （Santa Cruz Biotechnology公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本來源：選取我院由2014年至2018年收治的30位HCC患者作為研究對象。患者年齡47～73歲，平均60.12歲，男21例，女性9例。在獲得患者知情同意后，留取肝癌組織及癌旁組織，并保存于液氮中備用。

1.2.2 芯片篩選：委托沈陽匯佰生物有限公司對肝癌組織及癌旁組織進行miRNA分析。采用Mynasy試劑盒 （QiAGEN，上海尚耀生物技術(shù)有限公司） 從冷凍組織中提取總RNA，用于NTROR miRNA平臺檢測。所有樣品制備和雜交均按照說明書進行操作。

1.2.3 實時PCR：用Qiazol reagent和Mynasi-Mini試劑盒 （QiAGEN，上海尚耀生物技術(shù)有限公司） 從冷凍組織中分離總RNA。使用TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （QiAGEN，上海尚耀生物技術(shù)有限公司） 合成特定miRNA的cDNA，并進行實時PCR。miR-510的正向引物序列為5’-CTTCCATACTCAGGAGAGTG GC-3’，反向引物序列為5’-TATCGTTGTACTCCAGA CCAAGAC-3’。U6用于內(nèi)參對照，正向引物5’-CG CGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物5’-AC GCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。c-MYC正向引物5’-TGCTGCCAAGAGGGTCAAGT-3’，反向引物5’-TC AGCCAAGGTTGTG-3’；GAPDH正向引物5’-CGGAG TCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反向引物5’-AGCCT TCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。反應(yīng)條件為95 ℃10 min，95 ℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s 40個循環(huán)。所有實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細胞培養(yǎng)：用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)人HCC細胞系HepG2。

1.2.5 熒光素酶報告實驗：在96孔板中培養(yǎng)HepG2細胞至貼壁后，使用lipo2000轉(zhuǎn)染50 ng pluc-3’UTR（c-MYC WT，即野生型，及c-MYC MUT，即突變了c-MYC與miR-510結(jié)合位點的突變型）、10 ng Renilla luciferase plasmid和5 pmol miR-510擬似物或陰性對照轉(zhuǎn)染。孵育48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng) （PROMEGA，北京索萊寶科技有限公司） 檢測熒光素酶活性。

1.2.6 CCK-8實驗：在96孔板中接種1×103個轉(zhuǎn)染細胞，分別于接種后0、12、24、36和48 h添加CCK-8 （10 μ L/孔）。37 ℃孵育2 h后，在450 nm處檢測吸光度。

1.2.7 Transwell實驗：在24孔板中轉(zhuǎn)染細胞24 h后，將5×104個細胞懸浮在200 μ L無血清DMEM培養(yǎng)基中，接種至Transwell上室中。加入600 μ L含有10%胎牛血清的DMEM。在5%CO2、37 ℃孵箱中孵育8 h后，用含有0.4%臺盼藍和20%甲醇的染料溶液染色固定細胞，200倍顯微鏡下觀察。

1.2.8 Western blotting：細胞轉(zhuǎn)染24 h后，裂解細胞，提取蛋白，用10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，c-MYC （1∶1 000）或GAPDH （1∶10 000） 抗體4 ℃孵育過夜，洗膜，對應(yīng)二抗室溫孵育2 h，再次洗膜，ECL發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用t檢驗，比較肝癌組織與癌旁組織的miRNA分布情況。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-510在HCC中低表達

芯片分析結(jié)果顯示，有10種miRNA在HCC中異常表達，其中miR-510在癌組織中的表達遠遠低于在癌旁組織中的表達，下降約76.27倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.001），見圖1。

圖1 多種miRNA在肝細胞癌與癌旁組織中存在差異性表達Fig.1 Differential expression of miRNAs in hepatocellular carcinoma and adjacent tissue

實時PCR結(jié)果顯示，miR-510的表達在HCC癌組織中顯著下調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P =0.019），見圖2。

2.2 miR-510靶向作用于c-MYC

圖2 miR-510在HCC癌組織與癌旁組織中的表達Fig.2 The expression of miR-510 in hepatocellular carcinoma and adjacent tissue

miRDB軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，miR-510與c-MYC具有結(jié)合位點。報告基因?qū)嶒炛赋?，miR-510能夠抑制c-MYC的活性，但是如果突變了兩者的結(jié)合位點，則該抑制作用消失，結(jié)果見圖3。

Western blotting結(jié)果顯示，HepG2細胞中miR-510過表達可以顯著抑制c-MYC的表達，而當(dāng)miR-510受到抑制后c-MYC的表達水平上升，見圖4。

2.3 miR-510對HepG2增殖和遷移的影響

MTT結(jié)果顯示，miR-510過表達后，HepG2細胞的增殖受到顯著抑制；反之，miR-510表達下調(diào)則能夠促進HepG2細胞的增殖，見圖5。

圖3 miR-510可以直接打靶c-MYCFig.3 miR-510 can directly target c-MYC

圖4 Western blotting檢測miR-510對HepG2細胞中c-MYC蛋白表達的影響Fig.4 The expression of c-MYC in HepG2 after treated by miR-510 or miR-510 inhibitor detected by Western blotting

Transwell結(jié) 果 顯 示，miR-510過 表 達 可 抑 制HepG2的遷移，miR-510表達下調(diào)則能促進HepG2細胞的遷移，見圖6。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，各種腫瘤抑制因子的丟失和細胞生長信號的異常調(diào)控，如ERK/MAPK、Wnt/β-catenin和c-MYC/Akt/ras等通路的異常，都與肝腫瘤發(fā)生有關(guān)［7-8］，但HCC的分子發(fā)病機制目前仍知之甚少。

近年來，miRNA的異常調(diào)控已被認(rèn)為與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在肝癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種miRNA存在異常表達的現(xiàn)象，這些miRNA調(diào)控的靶基因可能是致癌基因或者抑癌基因，因此不同miRNA在肝癌中發(fā)揮的作用也不盡相同［9］。miR-29、miR-21和miR-221可以通過影響肝癌細胞中癌基因的表達，調(diào)節(jié)某些信號通路的過度激活，從而參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、凋亡、遷移和侵襲［10-11］。本研究通過基因芯片技術(shù)分析了HCC與癌旁組織中miRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個差異性表達明顯的miRNA，其中miR-510在HCC中下調(diào)的現(xiàn)象最為顯著。

圖5 miR-510對HepG2細胞增殖的影響Fig.5 Effect of miR-510 on the proliferation of HepG2 cells

圖6 miR-510對HepG2細胞遷移的影響 ×200Fig.6 Effect of miR-510 on migration of HepG2 ×200

研究［12］發(fā)現(xiàn)miR-510可以抑制腎細胞癌及胃癌的發(fā)生發(fā)展。雖然在乳腺癌中miR-510發(fā)揮癌基因還是抑癌基因的作用目前仍存在爭議［13］。但是本研究在30對肝癌和癌旁組織中發(fā)現(xiàn)，miR-510的下調(diào)顯著，而且miR-510可以與癌基因c-MYC的3’UTR區(qū)域靶向結(jié)合，因此推斷miR-510在HCC中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-510在肝癌組織中的表達低于癌旁組織，且miR-510與c-MYC具有結(jié)合位點。在HCC細胞中miR-510可以通過靶向作用抑制c-MYC的生物學(xué)活性與蛋白表達。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-510過表達可以發(fā)揮抑制HCC增殖和遷移的作用，而當(dāng)miR-510表達下調(diào)時，肝癌細胞的增殖和遷移能力則得到促進。

本研究通過生物學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-510可以打靶HCC中高表達的c-MYC，且miR-510的表達與c-MYC的表達呈負相關(guān)。

本研究分別通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blotting實驗證明了miR-510過表達可以抑制c-MYC的表達，當(dāng)miR-510表達下調(diào)時，c-MYC的表達水平增高。

c-MYC在HCC的生長與遷移中發(fā)揮重要作用，miR-510也被證明可以通過影響多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用抑制多種腫瘤細胞的生長和遷移。本研究隨后在HepG2細胞中分別過表達miR-510或抑制miR-510表達，并通過MTT和Transwell實驗檢測了miR-510對于細胞增殖和遷移的影響。結(jié)果表明，miR-510可以抑制HepG2的增殖和遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-510可以通過抑制c-MYC蛋白的表達來實現(xiàn)抑制HCC細胞增殖和遷移的作用，為HCC的治療提供了新的方向。