張良 陳小青 宋佳宇 毛然然 姜倩雯 林向民

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

大腸桿菌（Escherichia coli）是廣泛存在于人體和動(dòng)物腸道中的一種革蘭氏陰性菌，也是臨床感染中最為常見(jiàn)的人畜共患病原菌，可引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥［1］。使用抗生素是應(yīng)對(duì)致病性大腸桿菌感染的有效策略，但是由于抗生素使用廣泛且使用不當(dāng)，導(dǎo)致當(dāng)今細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)峻，耐藥菌株不斷增多，并且出現(xiàn)多重耐藥菌株［2］。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示，大腸桿菌對(duì)一些藥物的耐藥率已超過(guò)50%，對(duì)全球公共健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［3］。

在防治大腸桿菌感染的藥物中，最常見(jiàn)的是喹諾酮類抗生素。巴洛沙星（Balofloxacin）是一種新型的第四代喹諾酮類藥物，可以用于治療呼吸道感染和泌尿道感染，具有廣譜抗菌活性，特別是對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌效果較好［4］。但是當(dāng)前已有越來(lái)越多的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)對(duì)巴洛沙星耐藥的臨床菌株出現(xiàn)，使得細(xì)菌耐藥的形勢(shì)更加嚴(yán)峻［5］。為了進(jìn)一步探究大腸桿菌應(yīng)對(duì)巴洛沙星的分子機(jī)制，本研究以模式菌株大腸桿菌為研究對(duì)象，利用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合高分辨質(zhì)譜鑒定的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，比較大腸桿菌K12在巴洛沙星脅迫下，蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，以期發(fā)現(xiàn)細(xì)菌應(yīng)對(duì)抗生素的分子機(jī)制，為細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中使用的菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）K12 BW25113，該菌為常見(jiàn)工程菌，由中山大學(xué)彭宣憲教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 MIC值及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 采用二倍稀釋法，用LB培養(yǎng)基將巴洛沙星進(jìn)行梯度稀釋，使其濃度為 5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 g/mL，將活化過(guò)夜的菌液進(jìn)行稀釋，并分別加入含有巴洛沙星LB培養(yǎng)基中，不含抗生素的LB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照［6］。然后于37℃靜置培養(yǎng)16 h，記錄MIC值，并使用酶標(biāo)儀測(cè)定各濃度的OD600nm。根據(jù)測(cè)得的MIC值，使用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定大腸桿菌在不同濃度巴洛沙星下的生長(zhǎng)情況，濃度梯度為1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1×MIC和 2×MIC， 以及空白對(duì)照，每組重復(fù)3次，于37℃每隔1 h測(cè)定并記錄OD600nm，連續(xù)測(cè)定12 h，使用Prism 5軟件繪制圖。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 將大腸桿菌轉(zhuǎn)接入LB 培養(yǎng)基中，置于37℃搖床，以 200 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，然后將菌株按1∶100稀釋到含有1/4MIC巴洛沙星的新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm=1.0，該處理組為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)將未經(jīng)抗生素處理的稀釋液作為對(duì)照組。

1.2.3 全菌蛋白的提取 在5 000 ×g轉(zhuǎn)速下將培養(yǎng)

好的菌株離心10 min，用生理鹽水洗滌兩次，接著用5 mL 含有PMSF的PBS重懸細(xì)菌，之后進(jìn)行超聲破碎。在15 000 ×g轉(zhuǎn)速下離心30 min清除碎片，并將上清液用20 % TCA在冰上沉淀1 h，用預(yù)冷丙酮在15 000 ×g、4℃，離心10 min洗滌2次。用200 μL裂解液（8 mol/L尿素、0.1%SDS、2%Triton X-100溶解在pH8.5的0.5 mol/L三乙基碳酸氫銨緩沖液（TEAB））重懸沉淀得到蛋白樣品。最后利用BCA方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度并將蛋白質(zhì)分裝保存于-80℃。

1.2.4 iTRAQ標(biāo)記與LC-MALDI TOF/TOF約100 μg的蛋白質(zhì)樣品在5 mmol/L TCEP中37℃還原1 h，然后用終濃度為10 mmol/L的S-甲基硫代甲磺酸鹽（MMTS）在室溫下進(jìn)行烷基化處理10 min，再用0.5 mmol/L TEAB將上述樣品稀釋8倍，并按1∶20（W/V）的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解過(guò)夜。根據(jù)iTRAQ標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)將酶解的多肽樣品進(jìn)行標(biāo)記合并，然后利用Sep-Paks Vac C18柱除鹽、干燥，最后將重懸于0.5% TFA中的多肽樣品經(jīng)LC- 4800 Plus MALDI TOF/TOF（AB SCIEX）分析鑒定。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 將兩次重復(fù)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)合并，然后利用Proteinpilot 4.2軟件對(duì)原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)在大腸桿菌K12數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，檢索結(jié)果通過(guò)嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選（1% FDR），然后再篩選肽段匹配數(shù)≥2以及P-Value＜0.05的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，iTRAQ比值＞2.0或＜0.5的蛋白為差異表達(dá)蛋白。然后借助 OmicsBean（http：//www.omicsbean.com：88）在線軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行Gene Ontology（GO）分析，并利用STRING 10.0軟件分析KEGG 代謝通路以及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)［7］。

1.2.6 qPCR驗(yàn)證相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)變化 用1/4MIC的巴洛沙星處理大腸桿菌，以未處理為對(duì)照，分別培養(yǎng)至OD600nm=1.0，收集菌體，用TRIZOL法提取細(xì)菌總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為qPCR的模板檢測(cè)基因在mRNA水平上的表達(dá)情況，以16S rRNA作為內(nèi)參基因［8］。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌對(duì)巴洛沙星的MIC值及生長(zhǎng)曲線

根據(jù)大腸桿菌BW25113在不同濃度的巴洛沙星下的生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，其對(duì)巴洛沙星的MIC值為0.625 μg/mL。然后，依照測(cè)定的MIC值，分別用1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1×MIC和2×MIC的巴洛沙星處理大腸桿菌，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。與對(duì)照相比，抗生素處理之后大腸桿菌的生長(zhǎng)受到了不同程度的抑制（圖1），而在1/4MIC處理下，抑制作用較為明顯，但同時(shí)該菌還具有較高的活性，故選擇1/4MIC作為巴洛沙星的處理濃度。

圖1 不同濃度巴洛沙星脅迫下大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線

2.2 巴洛沙星脅迫下大腸桿菌蛋白的SDS-PAGE圖譜

用1/4MIC濃度的巴洛沙星處理大腸桿菌E.coliBW25113，培養(yǎng)至OD600nm=1.0，提取全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離。研究顯示，與對(duì)照相比，抗生素處理之后蛋白條帶發(fā)生了明顯的差異表達(dá)（圖2）。

2.3 LC-MALDI TOF/TOF質(zhì)譜分析

將100 μg處理后的蛋白樣品進(jìn)行還原和烷基化，加入胰蛋白酶降解成多肽，然后進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記。最后，將除鹽后的混合多肽樣品，在LC-MALDI TOF/TOF 上進(jìn)行分離鑒定，共鑒定出764個(gè)蛋白。與未添加抗生素處理組為對(duì)照，定量分析發(fā)現(xiàn)118個(gè)差異蛋白（差異倍數(shù)±2倍），其中包括52個(gè)表達(dá)上調(diào)蛋白和66個(gè)表達(dá)下調(diào)蛋白。

2.4 差異蛋白的功能分類與注釋

圖2 巴洛沙星脅迫下大腸桿菌全蛋白SDS-PAGE

為進(jìn)一步了解大腸桿菌在巴洛沙星脅迫中差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能，利用OmicsBean在線軟件對(duì)表達(dá)差異的蛋白進(jìn)行GO注釋，從細(xì)胞組分（Cellular component，CC）分子功能（Molecular function，MF）和生物學(xué)途徑（Biological Process，BP）3個(gè)分類進(jìn)行富集分析。圖3為表達(dá)差異蛋白的細(xì)胞組分分析結(jié)果，從圖中可以看出，除了在“其他細(xì)胞組分”分類中下調(diào)蛋白數(shù)目較多以外，大部分上調(diào)或者下調(diào)蛋白的細(xì)胞組分并沒(méi)有發(fā)生多大變化，均屬于胞漿蛋白；在分子功能中，下調(diào)蛋白主要參與了蛋白結(jié)合功能（Potein binding），還有不少蛋白涉及到能量代謝相關(guān)酶的活性。此外，有一些蛋白具有蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Protein transmembrane transporter activity）以及肽段轉(zhuǎn)運(yùn)活性（Peptide transporter activity）， 如 OmpF、SecA、SecG 和 OppD等蛋白。而上調(diào)蛋白主要參與了催化作用（Catalytic activity）中。另外，各有2個(gè)蛋白參與了硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶、連接酶、RNA多聚酶等酶活性，還有一些蛋白與小分子或蛋白結(jié)合作用相關(guān)（圖4）；在生物學(xué)過(guò)程中，分別有6%和3%的下調(diào)蛋白參與了脅迫響應(yīng)以及抗生素刺激的響應(yīng)。此外，還有一些蛋白參與了蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程（Protein transport），其中包括OppD、SecA和SecG等蛋白。在上調(diào)蛋白中發(fā)現(xiàn)，大部分蛋白參與了核酸代謝過(guò)程。還有一些蛋白涉及到磷酸鹽的化合物代謝過(guò)程以及氮循環(huán)代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)（圖5）。

2.5 巴洛沙星脅迫下差異蛋白的代謝途徑（KEGG）分析

圖3 巴洛沙星脅迫下大腸桿菌差異蛋白的細(xì)胞組分分析

借助STRING 10.0軟件，對(duì)大腸桿菌在巴洛沙星脅迫中的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了KEGG代謝通路分析。由圖6可以看出，下調(diào)蛋白參與了很多代謝過(guò)程，比如碳代謝（10個(gè)）、甲烷代謝（4個(gè)）、細(xì)菌不同環(huán)境下代謝（14個(gè)）、?；撬崤c?；撬岽x（2個(gè)）等，而且涉及能量代謝途徑的蛋白也不在少數(shù)，如糖酵解途徑（6個(gè)）、丙酮酸途徑（9個(gè)）、TCA循環(huán)（4個(gè)）。而在上調(diào)蛋白相關(guān)代謝途徑中，也有17個(gè)蛋白參與了細(xì)胞代謝過(guò)程，此外上調(diào)蛋白更多集中在DNA或者RNA的合成代謝相關(guān)途徑，如有7個(gè)蛋白參與嘌呤代謝，6個(gè)參與嘧啶代謝，以及2個(gè)蛋白參與RNA多聚酶（Rif，RpoZ），提示在巴洛沙星處理下，細(xì)菌的核酸生物合成過(guò)程受到了壓力。

圖4 巴洛沙星脅迫下大腸桿菌中差異蛋白的分子功能（MF）分析

2.6 巴洛沙星脅迫下差異蛋白的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)在行使生物學(xué)功能的過(guò)程中不是孤立的，往往形成復(fù)雜的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)對(duì)外界條件的變化。利用STRING在線軟件并結(jié)合GO與KEGG分析結(jié)果，本研究構(gòu)建了大腸桿菌在巴洛沙星脅迫中的差異表達(dá)蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖7）。與上述GO與KEGG分析結(jié)論類似，大部分表達(dá)下調(diào)的蛋白參與了能量生成相關(guān)的代謝途徑并形成了復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。例如，巴洛沙星脅迫導(dǎo)致碳代謝（圖7中虛線圈2）途徑中10個(gè)蛋白表達(dá)差異，其中除了TalB，AccB和Ppc蛋白上調(diào)以外，均為下調(diào)蛋白。而嘌呤與嘧啶代謝途徑差異蛋白則與上調(diào)蛋白為主。例如，在圖7虛線圈1中6個(gè)嘧啶代謝相關(guān)差異蛋白中，只有一個(gè)蛋白表達(dá)下降（Pnp蛋白）。

2.7 q-PCR驗(yàn)證

根據(jù)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果，本文選取了與碳代謝以及嘧啶代謝途徑相關(guān)的基因，利用q-PCR技術(shù)分析了這些基因在mRNA水平上表達(dá)量的變化。在大腸桿菌響應(yīng)巴洛沙星的脅迫過(guò)程中，以16S rRNA為內(nèi)參基因，這些基因在mRNA水平上的表達(dá)量如圖8所示。在11個(gè)與碳代謝相關(guān)的基因中，除了accB在mRNA水平表達(dá)與蛋白水平相反，其他基因均與蛋白水平變化趨勢(shì)一致，均為下調(diào)表達(dá)。在嘧啶代謝途徑，有4個(gè)基因mRNA水平的表達(dá)變化與蛋白水平相同，分別是ndrA、pnp、ropB和trxB；而其他3個(gè)基因則呈相反趨勢(shì)?？梢?jiàn)，選取的大部分基因在 mRNA水平上的表達(dá)變化與定量蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果一致，說(shuō)明本研究中蛋白質(zhì)組學(xué)分析的結(jié)果具有一定可信度。

圖6 巴洛沙星脅迫下大腸桿菌中差異蛋白的KEGG代謝通路分析

3 討論

喹諾酮類藥物的抑菌作用機(jī)制主要是作用于細(xì)菌的脫氧核糖核酸，阻礙細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能，從而終止DNA的復(fù)制，使細(xì)菌細(xì)胞不再分裂。如今，關(guān)于細(xì)菌對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥分子機(jī)制的研究有很多，大多與DNA旋轉(zhuǎn)酶中GyrA和GyrB以及拓?fù)洚悩?gòu)酶中ParC和ParE的突變對(duì)細(xì)菌耐藥的影響有關(guān)［9］。此外，還有研究報(bào)道一些重要耐藥蛋白如通道蛋白、外膜蛋白和外排泵蛋白等，在細(xì)菌耐藥中起重要作用［10-11］。但是，還有很多蛋白的耐藥功能及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究中用第四代喹諾酮類藥物巴洛沙星處理大腸桿菌，利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，共得到118種差異蛋白，其中52種上調(diào)，66種下調(diào)。在這些差異蛋白中，有一些蛋白的耐藥功能已被廣泛報(bào)道。例如，文獻(xiàn)報(bào)道在大腸桿菌中缺失涉及DNA修復(fù)的uvrA基因?qū)Νh(huán)丙沙星和甲硝唑的敏感性顯著增強(qiáng)，而缺失另一個(gè)DNA重組修復(fù)相關(guān)基因recA，則對(duì)鈉啶酮酸敏感［12］。本研究中UvrA和RecA蛋白在巴洛沙星脅迫下表達(dá)均升高，提示這些蛋白可能通過(guò)提高核酸修復(fù)能力來(lái)減輕喹諾酮類抗生素對(duì)核酸的破壞。變化的差異蛋白還包括4個(gè)表達(dá)下調(diào)的外膜蛋白（OmpC、OmpA、FadL和Slp）。前期研究發(fā)現(xiàn)OmpC與OmpF受細(xì)菌雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)EnvZ/OmpR的調(diào)控，通過(guò)控制外膜孔蛋白孔徑的大小，調(diào)節(jié)外膜通透性，缺失ompC后可導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)萘啶酮酸、碳青霉烯類及頭孢類抗生素敏感［13-15］。此外研究發(fā)現(xiàn)OmpA與FadL等外膜蛋白均在萘啶酮酸、卡那霉素等抗生素脅迫下也發(fā)生了變化，提示這些外膜蛋白可能在細(xì)菌耐藥過(guò)程中起重要的作用［16-17］。

研究表明，細(xì)菌耐藥的形成除了幾個(gè)關(guān)鍵耐藥蛋白以外，胞內(nèi)代謝通路的改變也可以改變細(xì)菌耐藥特性［18］。例如，Su等［19］通過(guò)外源添加代謝物逆轉(zhuǎn)細(xì)菌體內(nèi)代謝流，與抗生素聯(lián)用可顯著殺死耐藥細(xì)菌。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，巴洛沙星的脅迫也導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)代謝通路發(fā)生顯著的波動(dòng)，在能量生成相關(guān)的代謝途徑，如TCA循環(huán)、丙酮酸代謝以及糖酵解/糖異生等途徑中，則顯著下降。該表現(xiàn)與嗜水氣單胞菌應(yīng)對(duì)土霉素脅迫中的行為類似，提示能量代謝相關(guān)蛋白下調(diào)可能是細(xì)菌應(yīng)對(duì)抗生素壓力的一個(gè)普遍機(jī)制［20-22］。此外，在上調(diào)蛋白通路中，嘌呤與嘧啶代謝途徑相關(guān)蛋白表達(dá)普遍上升，提示細(xì)菌可能通過(guò)上調(diào)核酸代謝過(guò)程中相關(guān)蛋白的數(shù)量，如DNA 多聚酶 I（PolA）和RNA 多聚酶亞基（RpoZ），以此減輕抗生素攻擊靶點(diǎn)的壓力，“稀釋”抗生素的相對(duì)作用濃度，從而使細(xì)菌存活。綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)巴洛沙星脅迫下大腸桿菌定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，為研究細(xì)菌的耐藥機(jī)制以及今后新型抗生素的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

圖7 巴洛沙星脅迫下大腸桿菌中差異蛋白的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

圖8 巴洛沙星脅迫下大腸桿菌部分基因在mRNA水平上的表達(dá)情況

4 結(jié)論

大腸桿菌K12 BW25113菌株在1/4 MIC巴洛沙星濃度脅迫下，共鑒定到了118個(gè)差異蛋白，包括52個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白和66個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白，這些差異蛋白主要參與了能量代謝以及核酸代謝來(lái)調(diào)整細(xì)菌耐藥狀態(tài)。