郭沛 趙龍 胡翮

（湖南省湘潭市食品藥品檢驗所，湘潭 411100）

軍團菌病是一種細菌性疾病，主要表現(xiàn)為自限性非肺炎性龐蒂亞克熱（Pontiac fever）和軍團菌病癥狀，其特征是嚴重的呼吸道癥狀，包括具有高度致命性的肺炎。感染的病原菌為軍團菌，主要是嗜肺軍團菌，約占90%以上［1-2］。軍團菌可在25-45℃的溫水中生長，廣泛存在于人工、自然水環(huán)境以及各種人工供水設(shè)施中，在具有復(fù)雜水管系統(tǒng)的建筑物中較為常見，如淋浴頭、供水管道、水龍頭、浴缸和空調(diào)裝置等，其主要原因在于這些管道的供水水流緩慢，甚至停滯［3］。

人們常在吸入經(jīng)軍團菌污染的水霧后感染，尤其是老年人、免疫功能缺陷或低下的患者、吸煙者和慢性呼吸道疾病患者［4］。最好的預(yù)防方法是將水溫調(diào)節(jié)至20℃以下或者60℃以上，輸水管道中的水溫保持在55℃以上［3，5］。為了防止燙傷，可在水源使用點應(yīng)安裝溫度調(diào)節(jié)裝置。其他的預(yù)防措施還包括合理建設(shè)供水系統(tǒng)以盡可能地減少水流停滯、使用特殊材料防止微生物生長等［5］。

軍團菌病在全球范圍均有發(fā)生，尚有大量未報到的病例［2］。最近，瑞士制定了軍團菌在公共浴室和淋浴水中的微生物標準（FSVO 2017）來預(yù)防軍團菌病。國際標準化組織也制定了相關(guān)的國際標準方法（ISO 11731），以檢測水樣是否符合微生物標準，該方法采用選擇性瓊脂平板培養(yǎng)后檢測病原體并計數(shù)活細胞數(shù)（ISO 2008）。Kirschner等［6］的研究表明這種方法耗時，檢測時間常大于10 d，同時由于技術(shù)限制或其他原因，部分軍團菌可能具有活性但無法通過培養(yǎng)證實，即“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”（Viable but not culturable status，VBNC），而容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果［6-8］。在一定條件下，這部分軍團菌能夠恢復(fù)毒力和感染宿主的能力［9］。目前，以分子為基礎(chǔ)的快速檢測方法得到迅速發(fā)展，但應(yīng)用該方法檢測微生物時，不論是否具有活性的微生物均能被檢測出來，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。采用DNA插層劑的方法可以區(qū)分病原微生物是否具有活性，但是同樣存在缺點，如生物膜的存在會干擾檢測結(jié)果［9］、試劑對檢測物的濃度依賴性細胞毒性作用［10］。

一種檢測活嗜肺軍團菌的分子檢測方法能夠有效地解決這一問題，該方法基于PCR檢測16S rRNA前體中特異性的靶點，這種靶點僅存在于活的嗜肺軍團菌中，有望成為ISO方法的另一可選方案。前體rRNA在微生物rRNA總量中占據(jù)了很大的一部分，由于其具有較高的穩(wěn)定性，比mRNA更容易檢測和處理［11］。前體rRNA是由生長中的細菌合成的，在rRNA成熟過程中其頭端和尾端的序列將隨后被刪除［11-12］。當微生物生長停滯時，其前體rRNA的合成停止，但繼續(xù)成熟，從而導(dǎo)致前體rRNA大量流失，因此，前體rRNA的存在可作為判斷微生物細胞活性的分子指標［11，13-14］。

由于水為軍團菌提供的營養(yǎng)物質(zhì)有限，細胞群很少處于對數(shù)生長期，水中前體rRNA含量處于低水平［7］。將饑餓的軍團菌轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基中可刺激其生長，導(dǎo)致rRNA的合成大量增加，隨后再用核酸提取和逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR方法（Quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）檢測16S rRNA前體，可以極大地提高檢測效能。本研究分別應(yīng)用預(yù)刺激RT-qPCR法和ISO法對嗜肺軍團菌、非嗜肺軍團菌以及非軍團菌進行檢測，驗證兩種方法的特異性和靈敏度。隨后分別應(yīng)用這兩種方法檢測公共場所水環(huán)境中嗜肺軍團菌水平及污染情況，比較兩者結(jié)果的一致性，從而探究該預(yù)刺激方法在公共場所水環(huán)境中快速檢測中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌株 嗜肺軍團菌（ATCC 33152、ATCC 33153）、約旦軍團菌（ATCC 33623）、長灘軍團菌（ATCC 33462）、普通大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、腸炎沙門氏菌（ATCC 13076）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）均由美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）提供。

1.1.2 儀器與試劑 E.Z.N.A. Total RNA Kit試劑盒（美國Omega公司）；One Step PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）；熒光定量PCR儀（美國Roche公司）；5720R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；全自動細胞計數(shù)儀TC10（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計與合成 嗜肺軍團菌16S rRNA的上、下游引物序列分別為：5'-CGAGAGCTAGTGCCGGAAT-3'，5'-CCAAGTTGTCCCCCTCTTC-3'；嗜肺軍團菌16S rRNA的探針序列為：5'-FAMTAGACAGATGGCGAGTGGCGAACG-BHQ1-3'，擴增長度177 bp。上述引物及探針均由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。采用核苷酸BLAST工具（https：/blst.ncbi.nlm.nih.gov）進行計算機模擬分析序列同源性檢索，結(jié)果表明引物和探針對嗜肺軍團菌具有高度特異性。

1.2.2 菌株的培養(yǎng) 軍團菌菌株在含L-半胱氨酸的BCYE瓊脂平板上培養(yǎng)，非軍團菌在5%羊血瓊脂平板上培養(yǎng)，挑選單個的菌落制備成含菌量為105CFU/μL的細菌混懸液供實驗使用。

1.2.3 實驗菌株的預(yù)處理與模板制備 將實驗菌株分為預(yù)刺激組（Pre-stimulated Group，PSG）和普通組（Ordinary group，OG）兩組，分別進行預(yù)刺激處理和普通處理。取普通組細胞混懸液1-1.5 mL EP管中離心，16 000 r/min，4℃，5 min，棄上清液留沉淀。預(yù)刺激組細胞混懸液取1 mL置于50 mL離心管內(nèi)，加入9 mL已預(yù)熱的含L-半胱氨酸的BCYE培養(yǎng)基，37℃孵育一段時間后離心，丟棄9 mL上清液。剩余物轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中再離心16 000 r/min，4℃，5 min，棄上清液留沉淀。采用E.Z.N.A. Total RNA Kit試劑盒制備RNA模板，待測的RNA樣品提取后立即進行分析，隨后置于-70℃冰箱中。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR檢測 反應(yīng)體系（25 μL）為 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL、TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL）0.4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL、PCR Forward Primer（10 μmol/L）1 μL、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL、Probe 0.5 μL、待測樣品 5 μL、DEPC 水補足至 25 μL。PCR擴增條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；95℃預(yù)變性15 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，40個循環(huán)。RT-qPCR檢測的結(jié)果判定以Ct值≤35且擴增曲線呈S型為陽性。

1.2.5 預(yù)刺激時間的選擇 嗜肺軍團菌先進行饑餓預(yù)處理：取標準嗜肺軍團菌1 mL置于50 mL離心管內(nèi)，加入9 mL已預(yù)熱的DEPC水，恒溫37℃孵育24 h，從而抑制16S rRNA前體的合成及分泌。將人工饑餓處理后的嗜肺軍團菌分為9組，分別進行普通處理（1組）及預(yù)刺激處理（8組），預(yù)刺激組分別于刺激后20、40、60、80、100、120、180 及 250 min 進行收集實驗樣品，普通組即為預(yù)刺激后0 min。提取實驗樣本RNA，進行RT-qPCR。CT轉(zhuǎn)化值是指預(yù)刺激組與普通組的CT值（CT Value）的差值。

1.2.6 特異性分析 提取包括嗜肺軍團菌（ATCC 33152、ATCC 33153）、約旦軍團菌（ATCC 33623）、長灘軍團菌（ATCC 33462）、普通大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、腸炎沙門氏菌（ATCC 13076）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）在內(nèi)8株實驗菌株的RNA，采用預(yù)刺激RT-qPCR法檢測的16S rRNA前體的表達，對比ISO法檢測的結(jié)果，分析兩種方法檢測水樣中嗜肺軍團菌的特異性。

1.2.7 靈敏度分析 將饑餓處理后的標準軍團菌株混 懸液按照 106、105、104、103、102、101Cell/L 的濃度進行稀釋，分別采用預(yù)刺激法RT-qPCR方法和ISO法檢測嗜肺軍團菌的表達，分析兩種方法檢測水樣中嗜肺軍團菌的靈敏度，結(jié)果用最低檢測濃度（Limit of detection，LOD）表示。

1.2.8 外環(huán)境水樣檢測 自2017年6月-2017年8月于湖南省湘潭市選擇賓館、飯館、超市、醫(yī)院等公共場所，采集場所自來水、淋浴水、空調(diào)冷卻水等水樣本。采集自來水和淋浴水前應(yīng)先用酒精棉球擦拭出水口，并放水1-2 min后采樣。冷卻水取自集水池液面下20 cm處。公共水環(huán)境的水樣分別進行預(yù)刺激RT-qPCR法及ISO標準法進行檢測。

1.2.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 對實驗數(shù)據(jù)進行錄入及分析，計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗分析，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)刺激時間的選擇

不同預(yù)刺激時間（0、20、40、60、80、100、120、180和240 min）處理嗜肺軍團菌后，RT-qPCR結(jié)果顯示隨著預(yù)刺激時間延長，CT值逐漸減少，而相對應(yīng)的CT轉(zhuǎn)換值逐漸增加，分別為9.2、10.9、12.6、13.1、13.8、14.4、14.8、15.0 個循環(huán)（表 1）。當預(yù)刺激時間＞3 h時，CT轉(zhuǎn)換值的增加明顯變緩（圖 1）。

圖1 不同預(yù)刺激時間處理嗜肺軍團菌CT值變化

2.2 特異性檢測

采用熒光定量PCR檢測2株嗜肺軍團菌、2株非嗜肺軍團菌、4株非軍團菌株的16S rRNA前體的表達，結(jié)果（表1）表明預(yù)刺激RT-qPCR法和ISO法檢測嗜肺軍團菌的特異性均為100%。2株嗜肺軍團菌的16S rRNA前體的編碼序列檢測為陽性，而2株非嗜肺軍團菌、4株非軍團菌的16S rRNA前體的編碼序列檢測為陰性，結(jié)果與ISO標準法完全一致。

表1 不同預(yù)刺激時間處理嗜肺軍團菌CT值變化

2.3 靈敏度檢測

將饑餓處理后的標準嗜肺軍團菌株混懸液按照106、105、104、103、102、101Cell/L的濃度進行稀釋，采用預(yù)刺激RT-qPCR法、ISO標準法進行檢測。結(jié)果表明，預(yù)刺激法在濃度為106、105、104、103、102Cell/L的嗜肺軍團菌混懸液檢測呈陽性，而在101Cell/L的嗜肺軍團菌混懸液檢測呈陰性，因此預(yù)刺激RT-qPCR法的LOD為102Cell/L；ISO標準法在濃度為106、105、104Cell/L的嗜肺軍團菌混懸液檢測呈陽性，而在103、102、101Cell/L的嗜肺軍團菌混懸液檢測呈陰性，因此ISO標準法的LOD為104Cell/L（表 3）。

表2 嗜肺軍團菌經(jīng)標準法與預(yù)刺激法處理后的特異性差異

表3 嗜肺軍團菌經(jīng)標準法與預(yù)刺激法處理后的靈敏度比較

2.4 外環(huán)境水樣檢測

2.4.1 一般情況 調(diào)查湖南省湘潭市地區(qū)的賓館12家、飯館10家、超市3家、醫(yī)院2家等公共場所的自來水、淋浴水以及空調(diào)冷卻水，共計69份水樣品。預(yù)刺激RT-qPCR法及ISO標準法的總陽性率分別為43.5%（30/69）和40.6%（28/69）。

將預(yù)刺激RT-qPCR法與ISO標準法進行對比，預(yù)刺激RT-qPCR法與ISO標準法的一致率為94%，其中27份水樣檢測呈陽性，38份水樣呈陰性；兩種檢測方法中約有6%的水樣出現(xiàn)差異性表達，其中3份水樣檢測結(jié)果預(yù)刺激RT-qPCR法呈陽性而ISO標準法檢測呈陰性，1份水樣檢測結(jié)果預(yù)刺激RT-qPCR法呈陰性而ISO標準法檢測呈陽性（表 4）。

2.4.2 標準法和預(yù)刺激法比較 每份水樣均進行預(yù)刺激RT-qPCR法及ISO標準法檢測，檢測結(jié)果詳見表5。兩組數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)刺激RT-qPCR法及ISO標準法分別檢測水環(huán)境中嗜肺軍團菌的表達，差異無明顯統(tǒng)計學意義（C2=0.119，P=0.730）。

表4 外環(huán)境中嗜肺軍團菌ISO標準法與預(yù)刺激法檢測結(jié)果

表5 外環(huán)境中嗜肺軍團菌兩種檢測方法的比較

3 討論

嗜肺軍團菌是一種革蘭染色陰性的機會致病菌，廣泛存在于公共場所水環(huán)境中，如空調(diào)冷卻水、供水系統(tǒng)、淋浴水、噴泉水。嗜肺軍團菌可經(jīng)氣溶膠吸入引起以發(fā)熱及肺部感染為主要癥狀的軍團菌病。因此，水環(huán)境中嗜肺軍團菌的快速檢測及預(yù)警對控制人群中軍團菌病的發(fā)生具有重要意義［15］。目前常用的嗜肺軍團菌的檢測方法包括分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法和熒光定量PCR法等［16］。其中PCR技術(shù)具有快速定量檢測的優(yōu)勢，因而得到了迅速發(fā)展，但是其缺陷在于無法區(qū)分活菌及死菌，限制了其實際應(yīng)用。本研究首次提出預(yù)刺激RT-qPCR法檢測水樣中的活嗜肺軍團菌，與金標準ISO法進行對比，探究新檢測方法在實際應(yīng)用中的可行性。

預(yù)刺激RT-qPCR法通過誘導(dǎo)16S rRNA的合成增加，并采用RT-qPCR技術(shù)定量分析嗜肺軍團菌的16S rRNA的表達水平，從而可定量檢測出活嗜肺軍團菌。最佳預(yù)刺激時間的選擇是該方法應(yīng)首要解決的問題，本研究通過分析不同預(yù)刺激時間處理嗜肺軍團菌后的CT值變化來確定最佳預(yù)刺激時間。最佳預(yù)刺激時間的選擇應(yīng)盡可能的接近最大效應(yīng)時間，而小于軍團菌的倍增時間。結(jié)果表明，預(yù)刺激時間設(shè)置為3 h是很合理的。饑餓處理后的嗜肺軍團菌在預(yù)刺激1 h后即出現(xiàn)了明顯的CT值改變。Warren等［17］的研究表明嗜肺軍團菌的倍增時間約為6 h甚至更多。當預(yù)刺激時間超過3 h時，CT值增長明顯緩慢［18-19］。因此，最佳預(yù)刺激時間設(shè)置為3 h，此時嗜肺軍團菌16S rRNA的合成既接近于最大效應(yīng)值，又遠小于軍團菌的倍增時間6 h。

預(yù)刺激RT-qPCR法和ISO標準法的特異性分析表明，兩種方法特異性完全一致，均為100%；而在靈敏度檢測中，預(yù)刺激法的LOD為102Cell/L，ISO標準法的LOD為104Cell/L。因此，預(yù)刺激RT-qPCR法檢測具有高特異性和高靈敏度的特點。傳統(tǒng)經(jīng)典的軍團菌檢測方法，即ISO標準法，是軍團菌檢測的“金標準”，據(jù)部分學者報道［20］其特異性高達100%，但Boss等［21］研究表明部分細菌經(jīng)ISO法檢測為假定的嗜肺軍團菌，而通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析（MALDI-TOF MS）證實為不動桿菌。需要指出的是，雖然本研究的特異性也為100%，但是僅進行了2株嗜肺軍團菌、2株非嗜肺軍團菌、4株非軍團菌株的檢測，受檢菌株少可能是的兩種方法特異性如此之高的部分原因。但是，部分歐洲的研究表明被報道的病例中絕大多數(shù)（約70%）的感染是由SG1型嗜肺軍團菌引起，約有20%-30%是由SGs2-15型嗜肺軍團菌引起［22］。本研究選用的2株嗜肺軍團菌均為屬于SG1型嗜肺軍團菌，具有普適性，因此對實際檢測中仍具有一定的指導(dǎo)意義。

公共場所水環(huán)境的檢測結(jié)果表明，預(yù)刺激RT-qPCR法與ISO標準法的結(jié)果基本一致，一致率為94%，兩者差異無明顯統(tǒng)計學意義。預(yù)刺激RT-qPCR法是在熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）的基礎(chǔ)上改進而來的，而qPCR是除了細菌培養(yǎng)外唯一一種編入ISO技術(shù)規(guī)范的嗜肺軍團菌檢測標準，Omiccio Li等［23］對34株軍團菌、16株非軍團菌進行檢測，認為在軍團菌檢測中，qPCR完全能夠取代分離培養(yǎng)法，而不僅僅只是其替代選項。Bonetta等［24］的研究也表明qPCR對外環(huán)境水樣中的軍團菌檢測，其陽性率遠高于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，能夠更加真實地反映出外環(huán)境中軍團菌的污染情況。近年來，隨著衛(wèi)生行政部門對軍團菌越來越重視，醫(yī)院、賓館等公共場所的空調(diào)水系統(tǒng)等被大量使用消毒劑用于消滅和去除軍團菌。環(huán)境中的壓力和氧化還原條件等變化導(dǎo)致水樣中軍團菌向生物膜及原蟲體內(nèi)遷移，亦或者成為“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”，這種狀態(tài)下的軍團菌無法被傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)法檢測出來。Greenhalgh等［25］的研究也證實了VBNC軍團菌的存在可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

此外，預(yù)刺激RT-qPCR法還具有快速檢測的特點。在收集水樣后的8 h即可獲得檢測結(jié)果，而ISO法至少需要花費1周的時間。當疾病疫情爆發(fā)流行時，快速檢測出水樣中的潛在感染源就顯得尤為重要。相較于傳統(tǒng)的核酸技術(shù)而言，預(yù)刺激RT-qPCR法還可區(qū)分活細胞和死細胞，該方法的理論基礎(chǔ)在于Cangelosi等［12］的研究發(fā)現(xiàn)16S rRNA前體在合成后其頭部及尾部的序列立即被刪除，因此利用16S rRNA可檢測出細胞是否具有活性。本研究探究了預(yù)刺激RT-qPCR法與ISO的在實驗室條件下及實際應(yīng)用的差異，對該方法實際推廣有一定指導(dǎo)意義，同時也存在一定的局限，如本研究中實驗菌株較少可能影響到兩種方法的評估，實驗設(shè)備及技術(shù)要求較高導(dǎo)致難以在基層推廣。

4 結(jié)論

預(yù)刺激RT-qPCR法是一種快速有效的檢測活嗜肺軍團菌的方法，診斷靈敏度及特異性高，是ISO標準法潛在的替代方案。特別是在需要快速取得檢測結(jié)果時，該方法可作為首選方案。