徐秀倩 吳小芹 吳天宇 曾夢嫚

（1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037；2. 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗室，南京 210007）

土壤微生物群落豐富，各具有不同的生物學(xué)功能。植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）生存于植物根際和根表［1］，具有促進(jìn)植物生長，拮抗病原微生物［2］，提高植物抗性，修復(fù)土壤，維持土壤質(zhì)量健康等功能［3-4］。如PGPR可在植物根際快速繁殖，固定大氣中的氮素［5］、使植物充分利用土壤的養(yǎng)分，促進(jìn)植物更好生長［6］。Liu等［7］從楊樹根際篩選出一株熒光假單胞菌（Pseudomonads fluorescent）JW-JS1，可顯著促進(jìn)NL-895楊和美洲黑楊苗木的生長和營養(yǎng)元素含量的提高。宋芳旭等［8］發(fā)現(xiàn)根際細(xì)菌水拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）JZ-GX1對楊樹潰瘍病菌金黃殼囊孢（Cytospora chrysosperma）的防效可達(dá)84%。部分芽孢桿菌屬（BacillusCohn）還可提高植物對重金屬的耐受性［9］，Kuramshina 等［10］發(fā)現(xiàn) 用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）內(nèi)生菌株處理Sinapis alba種子可提高植物對鎘和鎳毒性作用的抵抗力，并減少地上部分的傷害表現(xiàn)。

在自然條件下PGPR對植物的有益功能是多方面相互作用的結(jié)果，然而目前關(guān)于PGPR的研究大多側(cè)重于某個或某些生物學(xué)功能，對PGPR綜合性能的研究相對較少。本實(shí)驗室前期從楊樹根際分離出一株具有解有機(jī)磷和產(chǎn)ACC脫氨酶特性的細(xì)菌菌株JYZ-SD5，初步研究表明其對楊樹具有一定的促生作用。但關(guān)于該菌株更多的生物學(xué)功能并不十分清楚，其分類地位也不明確。為深入探討和弄清該菌的潛在特性和應(yīng)用價值，本研究進(jìn)一步對該林木根際細(xì)菌JYZ-SD5的促生抗逆性能進(jìn)行檢測，同時展開林木溫室促生試驗，并確定其分類地位，以期為評估該林木根際細(xì)菌JYZ-SD5在野外試驗中的應(yīng)用價值提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試根際細(xì)菌：實(shí)驗室前期從山東楊樹根際分離出的細(xì)菌JYZ-SD5。供試林木病原菌：水杉赤枯病菌：細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、異角狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis heterocornis）；茶樹紋葉枯病菌：山茶球座菌（Guignardia camelliae）；茶樹輪斑病菌：異色狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis vesicolor）；松枯梢病菌：松杉球殼孢（Sphaeropsis sapinea）；楊樹潰瘍病菌：七葉樹殼梭孢（Fusicoccus aesculi）；銀杏葉枯病菌：鏈格孢（Alternariasp.）。所有菌株保存于南京林業(yè)大學(xué)森林病理學(xué)實(shí)驗室。

1.1.2 植物材料 2年生水杉盆栽實(shí)生苗，基質(zhì)選用南京林業(yè)大學(xué)北大山林木根際表層土。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基，蒙金娜培養(yǎng)基用于測定菌株溶解有機(jī)磷的能力［11］，無氮培養(yǎng)基用于固氮能力定性測定［12］，解鉀能力檢測培養(yǎng)基［13］，纖維素剛果紅培養(yǎng)基用于分解纖維素能力的測定［14］。蛋白質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基［15］，金氏培基B（King’S medium B，KB）用于菌株產(chǎn)IAA的測定［11］。

1.2 方法

1.2.1 根際細(xì)菌JYZ-SD5固氮、解磷、解鉀性能測定 （1）固氮特性檢測：將供試菌株采用平板劃線的方法接種在無氮培養(yǎng)基中，每個處理3次重復(fù)，置于28℃低溫恒溫培養(yǎng)箱（MIR-553，Japan），連續(xù)觀察細(xì)菌的生長狀況。（2）解有機(jī)磷特性檢測：將供試菌株采用三點(diǎn)接菌的方法接種在解有機(jī)磷培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)3次，置于28℃培養(yǎng)箱中，連續(xù)觀察菌落周圍透明圈的有無。（3）解鉀能力測定：將供試菌株采用液體培養(yǎng)的方法，接種到解鉀檢測液體培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)3次，置于28℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)數(shù)天后，用火焰分光光度計（FP6410，上海）檢測細(xì)菌的解鉀能力（解P1為空白對照，P2為接菌處理）。

1.2.2 根際細(xì)菌JYZ-SD5產(chǎn)IAA能力檢測 （1）定性檢測：挑取單菌落接入金氏培基B中，恒溫?fù)u床（Multitron Standard，Switzerland）37℃ 培養(yǎng) 24 h，用無菌槍頭吸取1 mL菌液于無菌離心管中，加入4 mL Sackowcki’s 顯色劑之后迅速充分混合，室溫下避光顯色40 min，觀察顏色變化。（2）定量檢測：精確稱取IAA10 mg，先用少量乙醇溶解，再用蒸餾水定容至100 mL（濃度為100 μg/mL），然后分別稀釋成 0、4、8、12、16、20、24 μg/mL，取各濃度1 mL，分別加入4 mL顯色劑，40℃暗保溫40 min，與OD535下測定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將培養(yǎng)的菌懸浮液和空白對照，離心10 min（10 000 r/min）后取上清液4 mL加入等量比色液，在黑暗中靜置40 min，取出立即用HexIOS分光光度計（Lamnda365，Korea）測定OD535值，每個樣品重復(fù)測3次，以加入比色液的空白對照調(diào)零，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線計算該菌株分泌IAA量，連續(xù)測定7 d。

1.2.3 根際細(xì)菌JYZ-SD5拮抗林木病原菌活性測定 （1）平板拮抗：供試病原真菌接種于PDA培25℃養(yǎng)基中，每皿接種一塊，重復(fù)3次，用接種環(huán)沾取液體搖培24 h后的菌液，在菌落兩側(cè)對稱劃線，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)觀測記錄菌株的抑菌效果。（2）胞外代謝產(chǎn)物拮抗活性：獲取供試菌發(fā)酵液，發(fā)酵液移入滅菌50 mL離心管中，10 000 r/mim，4℃離心10 min，取上清液，過細(xì)菌濾膜，得無菌胞外代謝產(chǎn)物。將無菌胞外代謝產(chǎn)物按0.5%的比例加入PDA培養(yǎng)基中，搖勻倒平板。將林木病原菌接種于平板中，重復(fù)3次，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察該菌抑菌效果（抑菌率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%）。

1.2.4 根際細(xì)菌JYZ-SD5產(chǎn)纖維素酶、蛋白酶測定 （1）纖維素酶檢測：將供試菌株采用三點(diǎn)接菌的方法接種在纖維素酶檢測培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)3次，置于28℃培養(yǎng)箱中，連續(xù)觀察菌落周圍透明圈的有無。（2）蛋白酶檢測：將供試菌株采用三點(diǎn)接菌的方法接種在蛋白酶檢測培養(yǎng)基中，每個處理重復(fù)3次，置于28℃培養(yǎng)箱中，連續(xù)觀察菌落周圍透明圈的有無。

1.2.5 根際細(xì)菌JYZ-SD5的重金屬耐受性測定 （1）配制NA培養(yǎng)基，分別添加KMnO4、NiCl2.6H2O、K2Cr2O7、CuSO4.5H2O。 使 Mn7+、Ni2+、Cr6+、Cu2+濃度 梯 度 為 5、10、15、20、30、40、50、80、100、200、300、400 mg/L（ 以 純 Mn7+、Ni2+、Cr6+、Cu2+計），對照為純培養(yǎng)基。將菌株接種于上述培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中，24 h后進(jìn)行觀察。（2）不同重金屬濃度脅迫下菌株JYZ-SD5生長曲線的測定：將菌株JYZ-SD5接種到不同重金屬濃度的液體NB培養(yǎng)基中，用微生物全自動生長曲線分析儀（Bioscreen C，F(xiàn)inland），每隔2 h測定不同鹽脅迫下的OD600值，并以時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制菌株JYZSD5的生長曲線。

1.2.6 根際細(xì)菌JYZ-SD5對水杉促生試驗 用接種環(huán)挑取單菌落于含有50 mL NA液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。獲得細(xì)菌發(fā)酵液，將上述發(fā)酵液稀釋5倍，施用到2年生水杉盆栽苗中，每株施用50 mL稀釋液（菌體量5×108CFU/mL），對照組接種等量搖培24 h后的NA培養(yǎng)基。施菌后實(shí)生苗置于室外，在施菌后20 d、40 d后采用手持葉綠素儀（SPAD-502 plus，Japan KONICA MINOLTA 制造公司）測定處理組和對照組相對葉綠素含量并測其苗高和地徑。

1.2.7 根際細(xì)菌JYZ-SD5的鑒定 （1）菌體形態(tài)、特征觀察及生理生化指標(biāo)測定：參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株JYZ-SD5進(jìn)行生理生化測定，描述菌落形態(tài)、特性。（2）16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹：以提取的細(xì)菌總DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA的一對通用引物（上游引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）， 下 游 引 物1492r（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'） 對 細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：mix10 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個循環(huán)；72℃延伸10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色，紫外燈下拍照。有條帶則將獲得的PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物技術(shù)公司純化測序。所測得的16S rRNA 與 Ez Taxon 和 Gen Bank中的序列進(jìn)行基因序列比對，用 MEGA 8.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所測數(shù)據(jù)采用 Excel 2013 軟件繪圖，用prism cracked軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株的固氮、解磷和解鉀特性

測定表明，根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株在固氮培養(yǎng)基上可以生長（圖1-A），在解有機(jī)磷培養(yǎng)基上生長出現(xiàn)透明圈（圖1-B），說明該菌具有固氮、解有機(jī)磷的能力；同時在解鉀能力檢測中，發(fā)現(xiàn)對照組中鉀含量為7.9 μg/mL，處理組中鉀含量為11 μg/mL，比對照提高了2.1 μg/mL，菌株JYZ-SD5的解鉀能力為39%（表1）。

表1 菌株JYZ-SD5解鉀能力測定

2.2 根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株產(chǎn)IAA能力

采用Salkowski比色法測定表明，在含有色氨酸培養(yǎng)液的比色反應(yīng)中其顏色為淡紅色，說明菌株JYZ-SD5具有一定產(chǎn)IAA的能力。采用標(biāo)準(zhǔn)IAA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析，得出菌株JYZ-SD5培養(yǎng)1 d后在不含色氨酸的培養(yǎng)液中分泌的IAA濃度為3.938 5 μg/mL；在含L-色氨酸的培養(yǎng)液中IAA濃度達(dá)到7.152 0 μg/mL，且菌株JYZ-SD5在培養(yǎng)4 d后產(chǎn)IAA量達(dá)到最高。在不含色氨酸的培養(yǎng)液中分泌的IAA濃度最高為6.818 6 μg/mL；在含L-色氨酸的培養(yǎng)液中IAA濃度最高為12.199 6 μg/mL（圖2）。

2.3 根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株對幾種林木病原真菌的拮抗活性

測定表明，該菌株胞外代謝產(chǎn)物對鏈格孢、七葉樹殼梭孢、異色狀擬盤多毛孢的抑菌效果較明顯，其中對銀杏葉枯病菌鏈格孢抑菌效果最大，抑菌率為20.22%（表2）。菌株JYZ-SD5與供試林木病原真菌的平板對峙結(jié)果表明，該菌株對茶樹輪斑病菌異色狀擬盤多毛孢，鏈格孢，茶樹云紋葉枯病菌山茶球座菌，水杉赤枯病菌細(xì)極鏈格孢的抑制效果較為明顯（圖3）。

圖2 根際細(xì)菌JYZ-SD5的IAA定量檢測

表2 根際細(xì)菌JYZ-SD5胞外代謝產(chǎn)物對供試林木病原真菌的抑菌率

2.4 根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株的蛋白酶和纖維素酶活性

菌株JYZ-SD5在蛋白酶檢測培養(yǎng)基、纖維素酶檢測培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯透明圈（圖4），表明該菌含有蛋白酶和纖維素水解酶，具有一定的水解蛋白質(zhì)和分解纖維素的能力。

A：鏈格孢；B：細(xì)極鏈格孢；C：山茶球座菌；D：異色狀擬盤多毛孢。其中，A1-D1為CK；A2-D2為接菌劃線處理

圖4 根際細(xì)菌JYZ-SD5蛋白酶（A）和纖維素酶（B）檢測

2.5 根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株的金屬耐受性

該菌在Mn7+、Gr6+存在的供試濃度下均可以生長，耐受濃度最高均可達(dá)到400 mg/L，在Ni2+濃度為0-200 mg/L可以較好的生長，在Cu2+濃度為5 mg/L及以上時該菌無法生長。在Gr6+、Ni2+濃度不超過200 mg/L時，該菌與在正常生長條件下時相比無明顯差異；在Mn7+存在的情況下，該菌達(dá)到穩(wěn)定期的時間明顯推遲，說明Mn7+的存在會抑制該菌的繁殖速度，且當(dāng)Mn7+濃度在200-300 mg/L時，該菌前30 h生長較好，30 h以后菌體量突然減少，說明在200-300 mg/L濃度下，該菌的耐受性減弱，培養(yǎng)后期會出現(xiàn)大量菌體死亡的現(xiàn)象。綜合來看，重金屬濃度在0-200 mg/L之間時，該菌對重金屬脅迫耐受能力為 Ni2+＞ Gr6+＞ Mn7+＞ Cu2+；當(dāng)重金屬濃度高于200 mg/L時，只能在Mn7+、Gr6+存在的情況下緩慢生長（表3，圖5）。

2.6 林木根際細(xì)菌JYZ-SD5對水杉的促生作用

施菌處理后，水杉實(shí)生苗的苗高和地徑相對于對照組均有明顯提高。施菌20 d后苗高和地徑凈增長量均提高了200%左右；施菌40 d后，水杉葉綠素相對含量相對于對照增加了37.8%，苗高和地徑的凈增長量分別提高了74%和88%，施菌處理和對照處理間存在顯著性差異。說明接種根際細(xì)菌JYZSD5菌株對水杉的生長有顯著的促進(jìn)作用（圖6）。

表3 林木根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株在不同重金屬脅迫下24 h后的生長狀況

圖5 根際細(xì)菌JYZ-SD5在不同重金屬脅迫下的生長曲線

圖6 根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株對水杉的促生作用

2.7 林木根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株鑒定

2.7.1 形態(tài)特征及生理生化特性 菌株JYZ-SD5在NA培養(yǎng)基上菌落為近圓形，邊緣不整齊，乳白色，菌落中間無凸起，濕潤、有光澤（圖7-A、7-B）。菌體短桿狀，無鞭毛，革蘭氏陽性菌，在芽孢染色觀察中可看到著綠色的芽孢，說明產(chǎn)芽孢（圖7-C）。

圖7 根際細(xì)菌JYZ-SD5在NA平板上培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)（A、B）及革蘭氏染色（C）、芽孢染色（D）結(jié)果

菌株JYZ-SD5在VP實(shí)驗、甲基紅實(shí)驗、吲哚實(shí)驗、硝酸還原實(shí)驗中結(jié)果呈陽性，可以水解淀粉、明膠。接觸酶和氧化酶實(shí)驗結(jié)果為陽性，在糖、醇發(fā)酵實(shí)驗中，葡萄糖產(chǎn)酸檢驗結(jié)果為陽性，苯丙氨酸脫氨酶、木糖、甘露醇檢驗結(jié)果呈陰性（表4），結(jié)果與擬蕈狀芽孢桿菌（Bacillus paramycoides）的特征基本相符。

表4 JYZ-SD5菌株生理生化測定結(jié)果

2.7.2 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹 菌株JYZSD5的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測結(jié)果，在1 500 bp附近有一條明亮的PCR目的條帶，且無其他非特異性條帶。表明16S rDNA擴(kuò)增獲得的目的DNA片段可用于測序。經(jīng)測序獲得菌株JYZ-SD5的16S rDNA基因有1 420個堿基（GenBank 登錄號 ：MH894221）。

通過將菌株JYZ-SD5與 Ez Taxon 和 GenBank 中的序列進(jìn)行基因序列比對，并將同源性最高、且已定名的模式菌的序列信息，通過 MEGA8.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8），菌株JYZ-SD5與擬蕈狀芽孢桿菌NH24A2模式菌株聚在一起，相似性達(dá)99%。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹相似性分析，結(jié)合形態(tài)、生理生化特征比對，初步鑒定菌株JYZ-SD5為擬蕈狀芽孢桿菌。

圖8 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的JYZ-SD5菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

植物根際細(xì)菌一般通過提高植物對根際養(yǎng)分吸收、產(chǎn)生植物激素類物質(zhì)等促進(jìn)植物生長［16-17］。從研究結(jié)果看，林木根際細(xì)菌JYZ-SD5具有固氮、解有機(jī)磷和解鉀的能力，具有較高的產(chǎn)IAA能力，不加色氨酸前體下產(chǎn)IAA量為6.818 6 μg/mL。Yasmi［18］等發(fā)現(xiàn)具有固氮、解磷和產(chǎn)IAA能力的兩種細(xì)菌Exiguobacteriumsp.和Stenotrophomonassp.對卡琪花蒂瑪（Labisia Pumila）有促生作用。本研究通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，林木根際細(xì)菌JYZ-SD5對水杉有很好的促生作用，能明顯提高水杉的株高和地徑，施菌40 d后，相對于對照組苗高和地徑的凈增長量分別提高了74%和88%。說明林木根際細(xì)菌JYZSD5存在某種促進(jìn)植物生長的機(jī)制。結(jié)合其固氮、解磷、解鉀，產(chǎn)IAA的能力分析，推測該根際細(xì)菌對水杉的促生機(jī)制可能是通過提高植物對土壤氮、磷、鉀養(yǎng)分的吸收，同時產(chǎn)生一定的促生物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。

研究證實(shí)，部分重金屬耐受性較高的根際細(xì)菌，在重金屬污染地區(qū)可修復(fù)被污染的土壤，提高植物在污染地區(qū)生長狀況［19］；如Krishnendu等［20］發(fā)現(xiàn)Enterobacter aerogenesK6菌株對 Cd2+、Pb2+和 As3+的耐受性高，并且在鎘脅迫下施用該菌，水稻幼苗生長顯著增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株具有良好的耐重金屬的能力，對Mn7+、Gr6+的耐受性最高均可達(dá)400 mg/L，對重金屬Ni2+的耐受最高也可達(dá)200 mg/L。并且林木根際細(xì)菌JYZ-SD5菌株可以產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶，而蛋白酶和纖維素酶能夠降解真菌細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)和纖維素，破壞病菌菌絲，使病菌生長受到抑制［21］；同時本實(shí)驗也證明該根際細(xì)菌JYZ-SD5對鏈格孢的抑菌率可達(dá)20.22%，對其他林木病原菌也具有一定的抑菌效果。由此推測JYZ-SD5菌株在重金屬污染地區(qū)及林木病害防治方面具有較好的應(yīng)用價值。

林木根際細(xì)菌JYZ-SD5經(jīng)鑒定為擬蕈狀芽孢桿菌，屬芽孢桿菌屬。擬蕈狀芽孢桿菌是Liu等［22］2017年通過多相分類學(xué)方法，依據(jù)表型和16S rRNA基因序列分析數(shù)據(jù)，認(rèn)為其屬于蠟狀芽孢桿菌中的低dDDH和ANI值菌株，而重新被劃分出的一個新種Bacillus paramycoidessp. nov. type strain NH24A2T，該新種的模式菌株來自海洋。而本研究中將來自林木根際的菌株JYZ-SD5鑒定為擬蕈狀芽孢桿菌，這是該菌分離自陸地生態(tài)系統(tǒng)的首次報道。研究結(jié)果表明擬蕈狀芽孢桿菌JYZ-SD具有較好的促生抗逆特性，具有作為一種新型的微生物菌株資源開發(fā)應(yīng)用的潛力。

4 結(jié)論

本研究通過對菌株JYZ-SD5生物學(xué)特性進(jìn)行檢測，得到該菌具有固氮、解磷、解鉀、產(chǎn)IAA能力，對林木生長具有明顯促進(jìn)作用，對某些林木病原真菌具有一定的拮抗效果，對Ni2+、Gr6+、Mn7+等重金屬耐受性較高，并通過形態(tài)觀察、生理生化特性分析、16S rDNA序列分析將菌株JYZ-SD5鑒定為擬蕈狀芽孢桿菌。