方珞 吳小芹

（1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037）

濕地松（Pinus elliottiiEngelm）為松科，松屬樹種，原產(chǎn)于美國東南部濕潤暖熱的低海拔地區(qū)（600 m以下）。我國湖北、浙江、江西、江蘇、安徽、福建等地均有引進(jìn)栽植。濕地松是一種良好的用材及經(jīng)濟(jì)樹種，高產(chǎn)松脂，木材收益率高；其次，還是很好的園林綠化樹種，既抗旱又耐澇、耐瘠，又有著良好的適應(yīng)性和抗逆性，對松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和松毛蟲（Dendrolimus superans）具有較高的抗性，已成為我國南方重要的造林綠化樹種之一［1］。然而，1978年后，松針褐斑?。↙ecanostictaacicola）在我國濕地松人工林中接連發(fā)生，這使得濕地松在我國的應(yīng)用受到了較嚴(yán)重的制約［2-3］。所以探尋松針褐斑病的防治方法顯得十分迫切，國內(nèi)外都對此病害進(jìn)行了一些研究，但目前還沒有找出有效的防治辦法。因此，培育抗病性強(qiáng)的濕地松的優(yōu)良家系成為規(guī)模造林的重要途徑。自20世紀(jì)80年代初，我國已展開了對抗松針褐斑病濕地松優(yōu)良家系的篩選，并建立了濕地松抗病種子園［3］。但由于種子園中種子產(chǎn)量的限制，且種子質(zhì)量會(huì)受天氣等影響，制約了優(yōu)良抗性濕地松的大量繁殖與推廣。為了將優(yōu)良的抗性濕地松家系較快的應(yīng)用到林業(yè)生產(chǎn)中，完善抗性濕地松體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)變得十分重要。

關(guān)于針葉樹種的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究已經(jīng)有一些報(bào)道，國外學(xué)者Hakman等［4］在1985年使用了白云杉（Picea glauca）細(xì)胞進(jìn)行了懸浮培養(yǎng)試驗(yàn)。由于在懸浮培養(yǎng)中，細(xì)胞是完全暴露在營養(yǎng)液內(nèi)，所以對培養(yǎng)的環(huán)境十分敏感，對培養(yǎng)條件的要求較高。在針葉樹體細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，影響其生長狀態(tài)的因素很多。有報(bào)道稱杉木（Cunninghamia lanceolata）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過長時(shí)（超過10 d），懸浮細(xì)胞會(huì)發(fā)生褐化甚至死亡的現(xiàn)象［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，火炬松（P. taeda）胚性愈傷組織的懸浮培養(yǎng)繼代時(shí)間對愈傷組織胚性的保持和體胚分化有著顯著的影響［6］。

目前，關(guān)于濕地松體細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)尚未見報(bào)道，南京林業(yè)大學(xué)松屬植物組織培養(yǎng)課題組已在選育優(yōu)良抗性濕地松家系的基礎(chǔ)上，對抗性濕地松未成熟合子胚進(jìn)行體胚發(fā)生技術(shù)的研究，篩選出適宜的胚性愈傷組織固體增殖培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等，并初步獲得再生植株［7］。

本研究對抗松針褐斑病濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)周期、激素及繼代添加比等進(jìn)行初步探究，旨在建立抗松針褐斑病濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，以期獲得大量較佳的胚性愈傷材料，為進(jìn)行抗性濕地松體胚發(fā)生、規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自2015、2016年誘導(dǎo)獲得的抗性濕地松胚性愈傷組織13#-3、13#-9、12#-1、12#-3、12#-9、7#-4和30#-4共7個(gè)無性系。將其放在胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基（LP+0.3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L KT+1 mg/L NAA［8］）上培養(yǎng)至10 d，待懸浮培養(yǎng)使用。

1.2 方法

1.2.1 增殖培養(yǎng) 稱取1 g增殖狀態(tài)較佳抗性濕地松胚性愈傷組織，放入倒有30 mL液體培養(yǎng)液的100 mL三角瓶中，并用鑷子輕輕打散至均勻，用膜將瓶口封口，放于振蕩培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d［9］。

1.2.2 細(xì)胞沉降體積（Sedimentation Volume Cell）的測定 將培養(yǎng)7 d的懸浮細(xì)胞液倒入100 mL量筒中，殘留在量筒壁上的懸浮細(xì)胞團(tuán)，可加入清水震蕩后倒入量筒中。靜置1 h后，讀取沉降在量筒底部的胚性愈傷組織體積即為細(xì)胞沉降體積。

1.2.3 細(xì)胞活力（OD值）的測定 將懸浮培養(yǎng)7 d的胚性愈傷組織懸浮液使用布氏漏斗法使得培養(yǎng)液與胚性愈傷組織分離。用分析天平稱取200 mg胚性愈傷組織，置于5 mL的離心管中，加入2.5 mL 0.4%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液以及2.5 mL 0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液，放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)13 h。然后，用吸管去除上清液，加入5 mL清水洗滌3次，加入5 mL 95%無水乙醇，震蕩，60℃恒溫水浴30 min，水浴期間需振蕩幾次，至胚性愈傷組織無色后，用紫外分光光度計(jì)（Nanodrop ND-100紫外分光光度計(jì)，美國Nanodrop公司）中測其上清液OD485nm值，即為細(xì)胞活力［10］。

1.2.4 不同培養(yǎng)方式的胚性愈傷組織形態(tài)觀察與體胚成熟分化測定 以胚性愈傷組織7#-4、30#-4和30#-13為材料，稱取1 g胚性愈傷組織，放入30 mL新鮮培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)，懸浮培養(yǎng)液成分為激素減半的增殖培養(yǎng)液（LP+0.15 mg/L 6-BA+0.15 mg/L KT+0.5 mg/L NAA），用鑷子輕輕將其細(xì)胞團(tuán)打散。封口，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-9 d，取出，同時(shí)取在增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行固體增殖14 d的胚性愈傷組織，用醋酸洋紅和伊文思藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞染色。蔡司體視鏡（SteREO Discovery.V20）觀察記錄細(xì)胞的狀態(tài)。并將兩種培養(yǎng)方式得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接至成熟分化培養(yǎng)基（LP+70 mg/L ABA+180 g/L PEG8000+1 g/L活性炭、麥芽糖60 g/L和植物凝膠3 g/L）進(jìn)行體胚的誘導(dǎo)，2-3個(gè)月后觀察體胚發(fā)生情況。

1.2.5 基本培養(yǎng)基的篩選 以胚性愈傷組織30#-4作為實(shí)驗(yàn)材料，分別以1/2 LP、1/2 DCR、1/4 LP和1/4 DCR為基本培養(yǎng)基，1/2和1/4均指激素減量，統(tǒng)一加入6-BA、KT和NAA 3種激素，即1/2為添加0.3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L KT+1 mg/L NAA，1/4為添加0.15 mg/L 6-BA+0.15 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。振蕩培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7-9 d后，分別測其細(xì)胞沉降體積和細(xì)胞活力OD值。

1.2.6 培養(yǎng)周期細(xì)胞活力的測定 以胚性愈傷組織30#-4作為實(shí)驗(yàn)材料，以1/4 DCR為基本培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、3、5、7、9、11、13、15和17 d取樣，測其細(xì)胞沉降體積和細(xì)胞活力OD值。

1.2.7 不同基因型細(xì)胞活力的測定 以胚性愈傷組織13#-3、13#-9、12#-1、12#-3和12#-9及30#-4為實(shí)驗(yàn)材料。以1/4 DCR為基本培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7-9 d后，取出測其細(xì)胞沉降體積和細(xì)胞活力OD值。

1.2.8 NAA濃度的測定 以胚性愈傷組織30#-4作為實(shí)驗(yàn)材料，以1/4 DCR為基本培養(yǎng)基，激素統(tǒng)一加入6-BA和KT 2種，添加量為6-BA+0.15 mg/L KT。 分 別 取 NAA 濃 度 為 0、0.5、1、1.5和 2.0 mg/L，放入振蕩培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7-9 d后，分別測其細(xì)胞沉降體積和細(xì)胞活力OD值。

1.2.9 麥芽糖濃度的測定 以胚性愈傷組織30#-4作為實(shí)驗(yàn)材料，以1/4 DCR為基本培養(yǎng)基，激素統(tǒng)一加入6-BA、KT、NAA三種，添加量為6-BA+0.15 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。分別取麥芽糖濃度為0、5、10、15和20 g/L。放入振蕩培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7-9 d后，分別測其細(xì)胞沉降體積和細(xì)胞活力OD值。

1.2.10 繼代添加比的測定 以胚性愈傷組織30#-4作為實(shí)驗(yàn)材料，以1/4 DCR為基本培養(yǎng)基，激素統(tǒng)一加入6-BA、KT、NAA 3種，添加量為6-BA+0.15 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。振蕩培養(yǎng)7-9 d后，取出進(jìn)行繼代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4種繼代添加比，即用移液槍取在培養(yǎng)7-9 d的30 mL初代懸浮細(xì)胞液中2/3（即原液取20 mL，新鮮營養(yǎng)液取10 mL）、1/2（即原液15 mL）、1/3（即原液10 mL）、1/6（即原液5 mL）的原液，并分別加入新鮮營養(yǎng)液至30 mL。放入振蕩培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7-9 d后，分別測其細(xì)胞沉降體積和細(xì)胞活力OD值。

1.2.11 培養(yǎng)條件 除非特別說明外，以上實(shí)驗(yàn)所配培養(yǎng)基均添加麥芽糖：15 g/L，肌醇：1 g/L，谷氨酰胺：0.45 g/L，水解酪氨酸：0.5 g/L，抗壞血酸：5 mg/L，0.15 mg/L 6-BA，0.15 mg/L KT，0.5 mg/L NAA，pH 5.8，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間7-9 d。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 分別使用沉降細(xì)胞體積和細(xì)胞活力OD值作為評價(jià)胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)方式的胚性愈傷組織形態(tài)觀察與體胚成熟分化的測定

雙染色法處理的胚性愈傷組織，胚頭部分為紅色，胚柄部分為藍(lán)色?？剐詽竦厮膳咝杂鷤M織經(jīng)懸浮培養(yǎng)7-9 d后得到的懸浮細(xì)胞相較于固體培養(yǎng)13-15 d的胚性愈傷組織，有一定差異。懸浮細(xì)胞在形態(tài)上較為分散，形成一個(gè)個(gè)具有完整胚頭胚柄的胚胎細(xì)胞（圖1-B）。而固體培養(yǎng)得到細(xì)胞較為集中，多為聚集體，即較多的體細(xì)胞胚頭聚集在一起，胚柄朝外呈發(fā)散狀，只有少部分胚胎細(xì)胞分散開（圖1-A）。

圖1 抗性濕地松固體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷組織形態(tài)

將2種培養(yǎng)方式得到的胚性愈傷組織接入體胚成熟分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)2個(gè)月，發(fā)現(xiàn)固體增殖的胚性愈傷組織可產(chǎn)成熟體胚56個(gè)/g，懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷組織可產(chǎn)成熟體胚153個(gè)/g。由此可得，懸浮培養(yǎng)后的細(xì)胞由于其較分散，更容易形成大量的抗性濕地松體細(xì)胞胚，且減少因空間不足擠壓導(dǎo)致營養(yǎng)無法充分獲得而發(fā)育畸形的體細(xì)胞胚胎（圖2）。

在選取的3個(gè)基因型中，7#-4不適合懸浮培養(yǎng)，其懸浮培養(yǎng)后幾乎無法獲得抗性濕地松成熟體胚。30#-4固體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)后均能獲得較多的成熟體胚且差異不大。30#-13懸浮培養(yǎng)后所獲得的成熟體胚數(shù)量顯著高于固體培養(yǎng)所得，因此，并非所有基因型都適合懸浮培養(yǎng)（圖3）。

圖2 抗性濕地松經(jīng)固體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)后體胚成熟狀況

圖3 不同基因型的抗性濕地松胚性愈傷組織經(jīng)固體及懸浮培養(yǎng)后體胚成熟狀況

2.2 基本培養(yǎng)基對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

從圖4可以看出，抗性濕地松懸浮體細(xì)胞在供試的4種基本培養(yǎng)基中均可生長，其中體細(xì)胞在1/4 DCR中的活力較高，在1/2 LP中次之。但在1/2 DCR和1/4 LP的培養(yǎng)液中，抗性濕地松懸浮體細(xì)胞的細(xì)胞活力有明顯的下降趨勢。因此，在保證體細(xì)胞正常生長量的前提下，選取1/4 DCR作為抗性濕地松懸浮體細(xì)胞培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基較佳。

圖4 基本培養(yǎng)基對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

2.3 培養(yǎng)周期對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

研究發(fā)現(xiàn)抗性濕地松懸浮體細(xì)胞的生長量在供試期內(nèi)保持穩(wěn)定的增加，而細(xì)胞活力在培養(yǎng)0-9 d內(nèi)保持增長狀態(tài)，至9 d時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最大值，9 d后，雖然細(xì)胞仍在生長，但其活力已經(jīng)明顯下降甚至喪失（圖5），表明抗性濕地松懸浮體細(xì)胞的較佳培養(yǎng)時(shí)間為7-9 d，此后，應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)液進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

圖5 培養(yǎng)周期對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

2.4 不同基因型對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

研究結(jié)果（圖6）顯示，抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在不同的基因型中有一定的差異，在選取的6個(gè)基因型中，生長量差異不明顯，但細(xì)胞活力有較大的差異。13#-9無性系的細(xì)胞活力較高，30#-4和12#-3無性系次之，12#-1、12#-9和13#-3無性系較差。

圖6 不同基因型對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

2.5 NAA濃度對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

圖7顯示激素NAA對抗性濕地松懸浮體細(xì)胞的生長有一定的影響，當(dāng)NAA濃度較高時(shí)，對其細(xì)胞的活力有著明顯的負(fù)面作用，細(xì)胞活力顯著下降。當(dāng)NAA濃度大于0.5 mg/L時(shí)，則會(huì)對體細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，對濕地松體細(xì)胞的活力作用較佳。

圖7 NAA濃度對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

2.6 麥芽糖濃度對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

研究發(fā)現(xiàn)抗性濕地松懸浮體細(xì)胞在碳源為麥芽糖的培養(yǎng)液中可以有著較好的生長，在5種濃度下均可保持正常的生長量，在0-15 g/L的麥芽糖濃度時(shí)，細(xì)胞活力穩(wěn)定上升，當(dāng)麥芽糖濃度為20 g/L時(shí)，細(xì)胞活力產(chǎn)生下降趨勢（圖8）。因此，麥芽糖濃度為15 g/L時(shí)，對抗性濕地松懸浮體細(xì)胞培養(yǎng)較適宜。

2.7 繼代添加比對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

圖8 麥芽糖濃度對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

研究結(jié)果（圖9）顯示，抗性濕地松體細(xì)胞在經(jīng)過初代培養(yǎng)后，需定期更換營養(yǎng)液進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使其活力得以保持。選取4種繼代添加比，其中1/6（即原液取5 mL，新鮮營養(yǎng)液取25 mL）的繼代方式，體細(xì)胞的生長量較低，不適宜采用。

2/3、1/2和1/3三種繼代添加比，均能保持體細(xì)胞的正常生長量，其中細(xì)胞活力較佳的為1/2，但差異較其他2種并不顯著。因此，抗性濕地松懸浮體細(xì)胞系繼代時(shí)，選取2/3、1/2和1/3三種繼代比均可。

圖9 繼代添加比對抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

3 討論

胚性細(xì)胞的成功懸浮培養(yǎng)是獲得再生植株并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的重要前提條件之一。懸浮培養(yǎng)首先要保證胚性細(xì)胞可以保持較好細(xì)胞活力、狀態(tài)較佳及胚性維持。在此基礎(chǔ)上，保持較高的繁殖系數(shù)，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量胚性材料。

研究發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)方式的胚性愈傷組織的狀態(tài)各異，懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞較為分散利于后期成熟獲得充分營養(yǎng)，但并非所有基因型都適宜懸浮培養(yǎng)，需根據(jù)不同基因型制定較佳的培養(yǎng)方式。

探究懸浮細(xì)胞的生長周期是十分必要的，掌握了它的生長周期后，可以選擇在其繁殖系數(shù)較高、細(xì)胞活性較佳的時(shí)期進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)和繼代培養(yǎng)。有研究使用歐洲黑松（Pinus nigra）的胚性細(xì)胞1 g放入25 mL營養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞生長量達(dá)到最大值［12］，這與本研究中發(fā)現(xiàn)抗性濕地松懸浮細(xì)胞的較適培養(yǎng)周期為7-9 d是一致的。

懸浮培養(yǎng)營養(yǎng)液中各類能源添加量和植物激素的濃度對胚性愈傷組織有著重要的影響。有報(bào)道稱將赤松增殖培養(yǎng)基配方中激素濃度減至一半后，細(xì)胞可以保持較好的活力進(jìn)行生長［12］。本實(shí)驗(yàn)中得到抗性濕地松體細(xì)胞懸浮培養(yǎng)較佳的NAA濃度為0.5 mg/L，正是胚性材料固體增殖中添加量的1/2，這說明在松屬樹種中激素濃度減半的懸浮培養(yǎng)方式具有一定廣譜性。Babula等［13］認(rèn)為懸浮細(xì)胞的繼代培養(yǎng)應(yīng)該降低接種的初始細(xì)胞濃度并適量增加培養(yǎng)時(shí)間，這使得細(xì)胞有足夠的時(shí)間將生理狀態(tài)調(diào)至較佳，提高細(xì)胞活性且能充分利用營養(yǎng)液中的營養(yǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用100 mL的錐形瓶裝取培養(yǎng)液30 mL時(shí)，測得較佳的繼代添加比為1/2，懸浮培養(yǎng)7 d后測得細(xì)胞活力較佳。

4 結(jié)論

初步建立了抗松針褐斑病濕地松懸浮培養(yǎng)體系，抗性濕地松懸浮細(xì)胞的較佳培養(yǎng)周期為7-9 d，較適宜的基本培養(yǎng)基為1/4 DCR，麥芽糖添加量為15 g/L，NAA添加量為0.5 mg/L；較佳的繼代添加比為1/2；不同基因型的抗性濕地松懸浮細(xì)胞在相同的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞活力有一定差異。