賀文俊 楊鐵釗 田培 段杜薇 李曉輝 何佳 周健飛

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

烤煙上部葉約占整株煙葉葉數(shù)的33%，占煙葉總產(chǎn)量的40%左右，對烤煙總產(chǎn)質(zhì)量有巨大貢獻(xiàn)［1］。優(yōu)質(zhì)的上部煙葉具有高煙堿含量和香氣量，在現(xiàn)代低焦油烤煙型和混合型卷煙葉組配方中占重要地位，對卷煙的香氣和風(fēng)格也有重要影響［2］。目前，我國上部煙葉葉片窄、組織結(jié)構(gòu)致密、僵硬、填充性差，是導(dǎo)致上部葉質(zhì)量較差、可用性偏低的重要因素［3-7］。因此，促進(jìn)烤煙上部葉生長能有效提高煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。

溫度對烤煙上部葉生長發(fā)育、品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)值等均具有一定影響。周越等［8］研究發(fā)現(xiàn)，夜溫升高能使烤煙上部葉葉長和葉寬顯著提高，產(chǎn)量產(chǎn)值顯著增加。王佩等［9］研究發(fā)現(xiàn)，成熟期增加地溫會使上部葉多酚和西柏類化合物含量降低，從而影響上部葉品質(zhì)。聶榮邦等［10］研究發(fā)現(xiàn)，對煙株上部葉進(jìn)行人工遮陰降溫處理有利于提高上部葉成熟度，提高上等煙比例。

目前，有關(guān)溫度對上部葉生長發(fā)育影響的機(jī)理研究尚少。本研究以云煙116為材料，研究增溫對上部葉胞壁羥脯氨酸含量、胞壁過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性和吲哚乙酸氧化酶（Indoleacetate oxidase，IAAO）活性的影響以及這些物質(zhì)與葉片生長的關(guān)系。旨在為促進(jìn)上部葉生長發(fā)育，提高煙葉產(chǎn)量產(chǎn)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017年在貴州省畢節(jié)市威寧縣黑石頭鎮(zhèn)煙草科技園試驗田中進(jìn)行。試驗田海拔高度2 212 m，東經(jīng) 104°01'06″，北緯 26°44'45″，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候區(qū)，年均溫16℃，年降水量626 mm，無霜期191 d。試驗地土壤為黃棕壤，前茬作物菊花，土壤基礎(chǔ)肥力指標(biāo)：全氮1.63 g/kg，堿解氮46.91 mg/kg，速效磷15.39 mg/kg，速效鉀82.00 mg/kg，有機(jī)質(zhì)23.13 g/kg，土壤 pH 7.59。

供試烤煙品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N云煙116。云煙116為8610-711與單育2號雜交育成的烤煙純系品種。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 設(shè)置2個處理：自然常溫對照（T1）和平頂后增溫處理（T2）。試驗采用小區(qū)對比設(shè)計，每處理重復(fù)3次，每處理100株烤煙，行距110 cm，株距60 cm。試驗小區(qū)設(shè)3壟保護(hù)行相隔，所有栽培措施與環(huán)境調(diào)控措施嚴(yán)格保持一致。

增溫處理各小區(qū)于7月10日搭設(shè)大棚，大棚面積約為63.3 m2，棚高約為2.2 m。大棚用不銹鋼管搭建固定，采用透光性極強(qiáng)的透明塑料專用膜覆蓋（青州市魯冠塑料廠生產(chǎn)），減少光質(zhì)、光強(qiáng)等對試驗結(jié)果的干擾。為降低試驗過程中降雨對試驗的影響，對照也設(shè)置相應(yīng)防雨棚（防雨棚材料與大棚相同）。為保證煙株生長用水，每隔5 d給煙株澆水。每個棚內(nèi)放置一臺雙金屬自動記錄溫度儀進(jìn)行溫度記錄。

1.2.2 測定項目及方法 于7月10日煙株平頂始取樣，并掛牌做標(biāo)記定好葉位（自下向上數(shù)第17片葉），隨后每隔5 d取1次樣，共取5次，樣品液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

每次取樣時用卷尺測量已定位的第17片葉的葉長和葉寬，每次測量10株，用長寬法計算葉面積，葉面積=0.634 5×（葉長×葉寬）；利用液質(zhì)聯(lián)用方法測定煙葉樣品中的羥脯氨酸（Hydroxyproline）含量 ；參照 Maehly和 Chance（1954）［11］的方法測定胞壁過氧化物酶活性；利用吲哚乙酸氧化酶試劑盒測定吲哚乙酸氧化酶活性；烘烤后煙葉按照國家烤煙分級標(biāo)準(zhǔn)GB2635-1992進(jìn)行分級，按煙葉收購價格計算產(chǎn)值、均價與上等煙比例。

1.2.3 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行整理和制圖，采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同處理下溫度變化分析

由圖1可看出，從7月10日至7月30日，平頂后大棚增溫處的棚內(nèi)平均氣溫為25.1℃，而防雨棚內(nèi)的平均氣溫僅為19.4℃。參照畢節(jié)市氣象臺發(fā)布的7月份溫度數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)7月10日至7月30日防雨棚內(nèi)的日平均溫度與自然常溫幾乎相同，可以認(rèn)為大棚內(nèi)平均氣溫較自然常溫高5.7℃。說明搭建大棚可有效提升烤煙生長的環(huán)境溫度。

圖1 不同處理下日平均溫度變化示意圖

2.2 不同處理下烤煙上部葉的羥脯氨酸含量分析

由圖2可看出，2個處理上部葉的羥脯氨酸含量隨時間推移均呈降低趨勢，但較T1處理相比，T2處理的羥脯氨酸含量降低速率更快，從7月15日至7月30日，T2處理上部葉的羥脯氨酸含量顯著低于T1處理（P＜0.05）。說明平頂后適當(dāng)增溫可有效降低煙草上部葉葉片細(xì)胞壁的羥脯氨酸含量。

圖2 不同處理下上部葉的羥脯氨酸含量變化

2.3 不同處理下烤煙上部葉的POD活性分析

由圖3可看出，隨時間的推移，T1處理的上部葉POD活性呈先略升高后降低然后再升高的變化趨勢，而T2處理的上部葉POD活性則呈持續(xù)降低趨勢，從7月15日至7月30日，T2處理的上部葉POD活性顯著低于T1處理（P＜0.05）。說明平頂后適當(dāng)增溫能夠降低上部葉葉片細(xì)胞壁的POD活性。

圖3 不同處理下上部葉的POD活性變化

2.4 不同處理下烤煙上部葉的IAAO活性分析

由圖4可看出，2個處理上部葉的IAAO活性隨時間推移均呈降低趨勢，但與T1處理相比，T2處理的上部葉的IAAO活性降低速率更快。從7月15日至7月30日，T2處理上部葉的IAAO活性顯著低于T1處理（P＜0.05）。說明平頂后適當(dāng)增溫能夠降低上部葉片的IAAO活性。

圖4 不同處理下上部葉葉片的IAAO活性變化

2.5 不同處理下烤煙上部葉生長發(fā)育情況的分析

由圖5可看出，2個處理的上部葉葉長均隨時間的推移而增長，且T2處理增加的速率大于T1處理。從7月15日至7月30日，T2處理的上部葉葉長始終大于T1處理，且差異顯著（P＜0.05）。

圖5 不同處理下烤煙上部葉葉長變化

由圖6可看出，2個處理的上部葉葉寬也隨時間的推移而增寬，7月15日之前，T2處理的增長速率較快，7月15日之后，兩處理的增長速率相近。從7月15日至7月30日，T2處理的上部葉葉寬始終大于T1處理，且差異顯著（P＜0.05）。7月30日時，T2處理的上部葉葉長、葉寬和葉面積分別較T1處理高8.6%、3.9%和12.9%。說明平頂后適當(dāng)增溫能夠有效促進(jìn)烤煙上部葉的生長發(fā)育。

2.6 不同處理下烤煙上部葉的經(jīng)濟(jì)性狀差異分析

由表1可知，在平頂后增溫條件下，烤煙上部葉的經(jīng)濟(jì)性狀指標(biāo)均顯著提高。與T1處理相比，T2處理的產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價和上等煙比例分別提高7.1%、13.8%、6.4%和4.9%。

圖6 不同處理下烤煙上部葉葉寬變化

表1 不同處理下烤煙上部葉經(jīng)濟(jì)性狀比較

3 討論

本研究以烤煙品種云煙116為材料，測定平頂后不同溫度下上部葉胞壁羥脯氨酸含量、胞壁過氧化物酶活性和吲哚乙酸氧化酶活性。結(jié)果表明，在平頂后增溫條件下，胞壁過氧化物酶活性、吲哚乙酸氧化酶活性和胞壁羥脯氨酸含量均顯著降低，上部葉葉長、葉寬和葉面積均顯著提高。羥脯氨酸是伸展蛋白重要的組成物質(zhì)，而伸展蛋白作為植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，在初生壁中約占壁干質(zhì)量的1%-15%，是影響細(xì)胞壁伸展性的重要因素之一［12］。而植物細(xì)胞伸長和擴(kuò)大在很大程度上都取決于細(xì)胞壁的伸展性。因此，羥脯氨酸影響著植物細(xì)胞的生長。Cleland等［13］研究發(fā)現(xiàn)，豌豆上胚軸從伸長到停止這段時間內(nèi)，細(xì)胞壁中的羥脯氨酸含量反而增加。Roberts等［14］研究發(fā)現(xiàn)，用多肽羥化酶阻遏物處理過的洋蔥根伸展蛋白水平降低，導(dǎo)致根細(xì)胞伸長。還有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)燕麥胚芽鞘的介質(zhì)中加入脯氨酸，能抑制羥脯氨酸的形成，導(dǎo)致細(xì)胞伸展性增加［15］。這些研究表明伸展蛋白能夠抑制細(xì)胞的伸展，伸展蛋白的水平隨羥脯氨酸含量增加而提高。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)平頂后增溫處理后，細(xì)胞壁中的羥脯氨酸含量降低，而上部葉葉長、葉寬和葉面積顯著增加，有利于上部葉的生長，與前人研究結(jié)果相符。

伸展素（Expansin）是植物細(xì)胞生長期間釋放的一種能使細(xì)胞壁松弛的蛋白質(zhì)。有研究表明，伸展素中大多羥脯氨酸（Hyp）殘基通過Hyp-O-Ara紐帶與壁多糖相聯(lián)，形成網(wǎng)絡(luò)，限制細(xì)胞生長（紐帶說）［16］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，伸展素多肽鏈間相鄰的異二酪氨酸（Idt）殘基通過二苯基醚鍵兩兩相連形成網(wǎng)絡(luò)，限制細(xì)胞生長（自身交聯(lián)說）［17］。而在這兩種途徑中，胞壁POD對Hyp和Idt的形成都起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，胞壁POD能夠催化伸展素中的脯氨酸（Pro）羥化，形成羥脯氨酸，使羥脯氨酸與脯氨酸之比增大，從而不利于細(xì)胞生長。POD也能使相鄰酪氨酸（Tyr）氧化形成Idt，限制細(xì)胞生長［18］。黃海等［19］研究了伸展蛋白與煙草葉細(xì)胞擴(kuò)大生長的關(guān)系，結(jié)果表明，生長緩慢的圓片細(xì)胞壁強(qiáng)脯氨酸與脯氨酸的比值高于迅速生長的圓片。本研究發(fā)現(xiàn)，在增溫處理下，胞壁POD活性降低，羥脯氨酸含量減少，可能是因為POD活性降低，催化Pro羥基化能力變?nèi)?，羥脯氨酸與脯氨酸比值變小，導(dǎo)致葉片伸展。當(dāng)然，也不排除自身交聯(lián)說。在增溫條件下，胞壁POD活性降低，可能使其氧化Tyr形成Idt的能力變?nèi)?，通過自身交聯(lián)形成的網(wǎng)絡(luò)就變少，從而促使細(xì)胞伸展。但也有研究表明，伸展素能參與植物細(xì)胞壁酸性擴(kuò)張。Cosgrove實驗室分別從黃瓜下胚軸細(xì)胞壁和玉米花粉中分離出α-伸展素和β-伸展素，二者均能恢復(fù)細(xì)胞壁酸性擴(kuò)張［20］，并據(jù)此推測伸展素在纖維素微纖絲表面擴(kuò)散，以一種可逆的方式作用于與纖維素微纖絲表面緊密結(jié)合的基質(zhì)聚合物，使多聚體網(wǎng)絡(luò)之間的氫鍵斷裂，膨壓驅(qū)使纖維素微纖絲與半纖維素相互之間滑動，從而引起細(xì)胞壁伸長［21］。本研究結(jié)果與其相反，可能是試驗材料和試驗環(huán)境不同導(dǎo)致的。由于本研究并未對Hyp、Tyr、Idt等物質(zhì)進(jìn)行測定，關(guān)于伸展素在POD的作用下抑制葉片生長的具體途徑還需進(jìn)一步研究。

Lamport等［22］在研究POD的生理功能時發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶還能通過氧化生長素的方式影響細(xì)胞生長。IAA作為生長素中最重要的一種內(nèi)源激素，與細(xì)胞分裂和擴(kuò)大更是密切相關(guān)［23］。而IAAO和POD作為IAA分解過程中的關(guān)鍵酶，均能氧化分解IAA，調(diào)節(jié)植物生長［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，在平頂后增溫處理下，IAAO和POD活性降低，上部葉葉長、葉寬和葉面積增大。這是因為當(dāng)IAAO和POD活性降低時，氧化分解IAA的能力變?nèi)?，因此，與對照相比，被分解的IAA較少，從而促進(jìn)細(xì)胞生長，有利于上部葉開片。但關(guān)于IAA促進(jìn)上部葉細(xì)胞生長的最適濃度還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

平頂后適當(dāng)增溫能夠顯著降低烤煙上部葉葉片POD活性、IAAO活性和羥脯氨酸含量，顯著提高上部葉葉長、葉寬和葉面積，有效地促進(jìn)烤煙上部葉的生長發(fā)育。經(jīng)大棚增溫處理后，溫度提高了5.7℃，烤煙上部葉葉長、葉寬、葉面積、產(chǎn)量和產(chǎn)值顯著增加，較對照相比分別提高了8.6%、3.9%、12.9%、7.0%和13.8%。