趙靖康 韓雙羽 劉慧峰 任媛 王霞 劉旭 何媛

青光眼在全球是僅次于白內(nèi)障的導(dǎo)致視力喪失的主要病因[1]。預(yù)計(jì)到2040年，全世界的青光眼患者將超過1.1億[2]。眼壓在青光眼的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著極其重要的作用，因此通過實(shí)驗(yàn)升高眼壓導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性改變的動(dòng)物模型一般認(rèn)為是最適用于模擬人類青光眼的動(dòng)物模型。高眼壓的青光眼動(dòng)物模型可以更好地篩選出能夠商業(yè)化的降眼壓藥物[3]。嚙齒類動(dòng)物和人類的眼睛在解剖學(xué)上具有許多共同的重要特征，包括前房引流結(jié)構(gòu)和房水動(dòng)力學(xué)[4]。大鼠和小鼠與人眼的生理機(jī)能相似，且具有廉價(jià)、易于維持、生命周期相對較短及易于進(jìn)行遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)，故適宜作為青光眼模型[5]。

卡波姆是丙烯酸鍵合烯丙基蔗糖或季戊四醇而形成的高分子聚合物，有良好的乳化性、增稠性、助旋性和成膜性[6]。卡波姆pH值較低時(shí)呈溶液狀，隨著pH值的升高，其黏稠度逐漸增加?？ú愤M(jìn)入前房后，與pH值為7.3～7.5的房水形成卡波姆混懸液，隨著房水循環(huán)卡波姆凝膠阻塞小梁網(wǎng)，從而升高眼壓[7-8]。本研究擬通過對大鼠前房注射卡波姆建立穩(wěn)定的大鼠高眼壓模型，觀察卡波姆升眼壓效果及對大鼠眼前節(jié)和視網(wǎng)膜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康8周齡SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，所有動(dòng)物均由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。雌雄鼠分開飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例，并通過西安醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 卡波姆混懸液的配制取0.15 g卡波姆940(上海索萊寶生物科技有限公司)放入燒杯內(nèi)，加入蒸餾水30 mL后，用磁力攪拌器(韓國Daihan scientific有限公司)攪拌20 min，使混懸液變成半透明狀。使用100 g·L-1氫氧化鈉溶液滴定，使混懸液pH值為7.3～7.5。

1.2 方法

1.2.1 注射前的準(zhǔn)備每只大鼠注射前均經(jīng)過連續(xù)3 d基礎(chǔ)眼壓的測量，測量前按摩大鼠，消除其緊張情緒，每次均測量3次取平均值記錄。使用100 g·L-1水合氯醛按3.5～4.0 mL·kg-1體質(zhì)量腹腔注射麻醉大鼠。將大鼠右眼定為實(shí)驗(yàn)眼，前房內(nèi)注射1 mL卡波姆混懸液，左眼為對照眼不做處理。實(shí)驗(yàn)眼注射前常規(guī)剪去大鼠胡須。

1.2.2 注射方法大鼠麻醉后用顯微鑷夾住結(jié)膜固定眼球。使用1 mL注射器抽取卡波姆混懸液 1 mL，連接到30 G針頭上，在顯微鏡下將注射器針頭于角膜緣外1 mm處穿刺進(jìn)入前房，針頭避免與晶狀體前囊、虹膜和角膜內(nèi)皮接觸，抽出針頭，隨著房水的流出，前房變淺，眼球變軟。然后從原傷口進(jìn)針，進(jìn)入前房后轉(zhuǎn)動(dòng)針頭，使注射器的針頭斜面朝向房角，將30 μL 5 g·L-1卡波姆混懸液快速注射并推入前房。此時(shí)虹膜血管顏色淡，前房深。隨著眼壓的升高，部分卡波姆從穿刺口流出，抽出針頭的同時(shí)，助手立即用無齒鑷夾住結(jié)膜傷口持續(xù)約1 min，然后用左氧氟沙星眼膏(參天制藥中國有限公司)涂抹于角膜表面，待大鼠蘇醒后放入籠內(nèi)。之后用左氧氟沙星滴眼液(參天制藥中國有限公司)滴眼，每天2次，連續(xù)7 d。

1.2.3 眼前節(jié)觀察分別于注射后即刻及每周末進(jìn)行眼前節(jié)照相，觀察并記錄眼前節(jié)組織結(jié)構(gòu)的變化情況。

1.2.4 注射后眼壓的測量大鼠清醒狀態(tài)下，用回彈式眼壓計(jì)(天津索維電子技術(shù)有限公司)測量眼壓，眼壓計(jì)默認(rèn)測量3次的平均值作為一個(gè)眼壓值。注射后每日早10時(shí)和晚22時(shí)測量眼壓。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察注射后4周，保留4只實(shí)驗(yàn)眼持續(xù)高眼壓狀態(tài)的大鼠繼續(xù)觀察至注射后9周，余26只大鼠均處死后迅速摘除雙眼眼球，并于40 g·L-1多聚甲醛中固定，24 h后梯度酒精脫水，將浸蠟的組織包埋，平行于眼軸方向切片，切片厚4 μm，烤片、脫蠟，HE染色后選取實(shí)驗(yàn)眼和對照眼均完整切到視神經(jīng)的切片，用圖像處理軟件分別測量距離視神經(jīng)200 μm處的視網(wǎng)膜厚度并對比。同時(shí)對比同一只大鼠雙眼HE染色切片，觀察實(shí)驗(yàn)眼和對照眼的房角形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼壓注射前，實(shí)驗(yàn)眼白天眼壓為(11.10±0.90)mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，夜間眼壓為(11.92±1.07)mmHg；對照眼白天、夜間眼壓分別為(11.22±1.07)mmHg和(11.76±1.08)mmHg。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，大鼠實(shí)驗(yàn)眼與對照眼之間，白天、夜間眼壓差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)；實(shí)驗(yàn)眼白天眼壓比夜間低(0.80±1.20)mmHg，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，對照眼白天眼壓比夜間低(0.58±1.38)mmHg，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。注射后，26只實(shí)驗(yàn)眼高眼壓均可以維持4周，另外4只實(shí)驗(yàn)眼眼壓可以維持在20 mmHg以上達(dá)6～9周。注射后第1天至第27天，實(shí)驗(yàn)眼與對照眼夜間眼壓相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；注射后第28天，實(shí)驗(yàn)眼與對照眼夜間眼壓相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射后第1天至第19天，實(shí)驗(yàn)眼與對照眼白天眼壓相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；注射后第20天，實(shí)驗(yàn)眼與對照眼白天眼壓相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)眼、對照眼不同時(shí)間點(diǎn)眼壓的變化。黑色箭頭示注射日

2.2 眼前節(jié)改變注射后即刻行眼前節(jié)照相可見，對照眼眼前節(jié)未見異常(圖2A)；實(shí)驗(yàn)眼半透明的卡波姆沉積于前房，由于眼壓升高，虹膜血管顏色變淡，瞳孔大小與對照眼相當(dāng)(圖2B)。注射后1周，實(shí)驗(yàn)眼出現(xiàn)典型的兩種卡波姆存在方式：(1)彌散型：卡波姆彌散在前房，呈薄霧狀，虹膜血管窺不清(圖3A)；(2)沉積型：卡波姆沉積于瞳孔區(qū)，呈團(tuán)塊狀(圖3B)。計(jì)算兩種卡波姆沉積方式實(shí)驗(yàn)眼1周內(nèi)的平均眼壓，彌散型為(17.83±3.54)mmHg，沉積型為(13.00±1.55)mmHg，兩者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高眼壓維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(注射后9周)的大鼠眼前節(jié)觀察可見，對照眼前房透明，虹膜血管清晰可見(圖4A)；注射后1周，卡波姆呈云霧狀，新生血管長入角膜，卡波姆界限明顯，眼球突出于眼瞼，使眼瞼閉合不全(圖4B)；注射后3周時(shí)卡波姆較1周時(shí)局限(圖4C)，夜間眼壓維持在25 mmHg；注射后6周，眼壓依然維持在25 mmHg，卡波姆呈團(tuán)塊狀沉積于前房，眼球突出更加明顯，角膜水腫，有潰瘍面(圖4E)，裂隙燈下檢查發(fā)現(xiàn)，前房消失(圖4F)。

圖2 注射后即刻眼前節(jié)照相。A：對照眼；B：實(shí)驗(yàn)眼

圖3 實(shí)驗(yàn)眼前房注射卡波姆后的兩種存在方式。A：卡波姆呈彌散型；B：卡波姆呈沉積型

圖4 高眼壓維持的實(shí)驗(yàn)眼前房注射卡波姆后不同時(shí)間觀察。A：對照眼；B：注射后1周；C：注射后3周；D：注射后6周；E：注射后9周；F：注射后9周裂隙燈下

2.3 視網(wǎng)膜形態(tài)和厚度對比注射后4周，實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜全層變薄，內(nèi)叢狀層厚度減少，內(nèi)外核層融合為一層，細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞明顯減少；對照眼視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞清晰可見(圖5)。實(shí)驗(yàn)眼注射后4周視網(wǎng)膜厚度為(254.70±21.80)μm，對照眼為(346.73±24.63)μm，實(shí)驗(yàn)眼與對照眼視網(wǎng)膜厚度相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。

2.4 房角形態(tài)對比注射后4周，對照眼房角形態(tài)正常，可以觀察到虹膜血管及睫狀體(圖6A)；實(shí)驗(yàn)眼前房充滿卡波姆及虹膜的混合成分，緊貼角膜內(nèi)皮并延伸至房角，堵塞小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)，正常虹膜形態(tài)消失(圖6B)。

圖5 注射后4周實(shí)驗(yàn)眼與對照眼視網(wǎng)膜形態(tài)對比(HE，×200)。A：實(shí)驗(yàn)眼；B：對照眼

圖6 注射后4周房角形態(tài)對比。A：對照眼；B：實(shí)驗(yàn)眼(黑色箭頭示前房內(nèi)卡波姆與虹膜的混合成分)

3 討論

青光眼動(dòng)物模型根據(jù)眼壓升高的機(jī)制可分為小梁前、小梁和小梁后模型[9]。小梁前模型由不同類型的外源性物質(zhì)(如硫酸軟骨素、甲基纖維素、聚苯乙烯微珠等)注入前房內(nèi)來阻礙房水流出，這種方法保留了眼部正常的解剖結(jié)構(gòu)，炎癥反應(yīng)相對較輕。小梁模型最廣泛造模方法是小梁激光光凝術(shù)，這種方法通常需要多次激光光凝才能維持?jǐn)?shù)周的高眼壓，由于嚙齒類動(dòng)物眼睛尺寸太小而難以施行。小梁后模型針對鞏膜后靜脈進(jìn)行不同方法的處理，如激光凝固、燒灼或高滲鹽水注射等[10]。小梁后模型實(shí)現(xiàn)了快速但短期的持續(xù)眼壓升高，但它們存在諸如眼球突出和角膜內(nèi)皮失代償?shù)炔焕蛩豙11]；激光對靜脈的處理也可能損傷睫狀神經(jīng)，鞏膜靜脈阻塞可引起角膜緣或脈絡(luò)膜局部缺血、缺氧變化，以上弊端可能會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生根本性的影響[12-13]。國內(nèi)外報(bào)道的前房注射外源性物質(zhì)阻塞房水排出的模型，注射體積一般都小于15 μL，但我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射15 μL卡波姆混懸液時(shí)，卡波姆容易沉積在瞳孔區(qū)，升眼壓效果并不明顯[14]，而注射30 μL卡波姆混懸液，可以使前房充滿卡波姆，升眼壓效果穩(wěn)定。Frankfort等[15]使用22 G玻璃針對大鼠前房注射6 μm和10 μm的混合微珠從而升高眼壓，其采用透明角膜的穿刺方法，通過特殊制成的針頭，在針管末端抽取黏彈劑，黏彈劑的作用是使微珠漏出的量減少。該方法用針頭較本實(shí)驗(yàn)粗，在透明角膜上的穿刺口有感染的風(fēng)險(xiǎn)。

本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)在于手術(shù)過程中如何將盡可能多的卡波姆留在前房內(nèi)。在模型優(yōu)化過程中，我們比較了不同濃度卡波姆混懸液的升眼壓效果，發(fā)現(xiàn)5 g·L-1的卡波姆混懸液是獲得大鼠持續(xù)高眼壓的最有效濃度。30 G的注射器針頭可以順利排出濃度為5 g·L-1的卡波姆混懸液，更高濃度的混懸液不利于卡波姆的排出。采用結(jié)膜下進(jìn)針、穿刺進(jìn)入前房及針頭斜面朝向角膜緣的方法，可以使卡波姆沿著房角分布[16]。出針時(shí)用無齒鑷夾住傷口避免卡波姆從前房漏出，可使更多的卡波姆留在眼內(nèi)[17]。

注射后前房深度、前房混濁程度及虹膜血管顏色是判斷眼壓高低的指標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn)，注射后實(shí)驗(yàn)眼前房混濁、卡波姆呈彌散狀、虹膜血管顏色淡的大鼠眼壓相對較高，并且可以維持高眼壓水平較長時(shí)間；而注射后卡波姆分布不夠均勻、虹膜血管部分清晰可見、卡波姆最后沉積在瞳孔區(qū)的大鼠，升眼壓效果相對較差，維持時(shí)間相對較短。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是彌散的卡波姆會產(chǎn)生不同質(zhì)量的卡波姆凝膠顆粒，對小梁網(wǎng)的阻塞效果更好，而凝聚成團(tuán)的卡波姆無法釋放小分子卡波姆凝膠顆粒。以往的大鼠高眼壓模型均只取白天眼壓作為讀數(shù)，并未提及夜間眼壓，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)眼夜間眼壓明顯高于對照眼及白天眼壓。吉富健志[18]使用熒光光度計(jì)進(jìn)行家兔房水產(chǎn)生的測定，發(fā)現(xiàn)房水的產(chǎn)生量在明室內(nèi)下降，在暗室內(nèi)增加。所以推測本組大鼠高眼壓產(chǎn)生晝夜波動(dòng)的原因可能是夜間暗室環(huán)境中產(chǎn)生的房水大量增加引起。實(shí)驗(yàn)眼眼壓升高4周可出現(xiàn)視網(wǎng)膜改變，4周后，眼壓下降的大鼠數(shù)目增多，視網(wǎng)膜修復(fù)可能出現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)方法屬于小梁前模型，通過卡波姆阻塞房水流出通路來升高眼壓，單次注射可維持眼壓升高4周以上，注射后眼壓的晝夜波動(dòng)符合人類青光眼的特點(diǎn)。

綜上，卡波姆前房注射建立大鼠高眼壓模型引起晝夜眼壓升高的效果理想，操作簡便，重復(fù)性好，副作用少，升高的眼壓維持穩(wěn)定，是較為理想的大鼠高眼壓模型，值得進(jìn)一步研究。