寧百樂(lè)， 張芹欣， 鄧敏貞， 王南卜， 方永奇

（1.廣東省中醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院、廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其患病率為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的第2位，全球患病率為400～1 900/10萬(wàn)[1，2]。我國(guó)65歲以上人群的患病率為1 700/10萬(wàn)，并隨年齡增長(zhǎng)而升高，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[3]。該病的主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失和α-突觸核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）異常積聚形成路易小體，其主要生化改變?yōu)榧y狀體區(qū)多巴胺（dopamine，DA）等神經(jīng)遞質(zhì)降低，臨床癥狀包括靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)平衡障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀及嗅覺(jué)減退、睡眠障礙、便秘和抑郁等非運(yùn)動(dòng)癥狀。目前PD的發(fā)病機(jī)制仍沒(méi)有明確，使探尋治療PD療法的道路困難重重。

目前，治療本病的方法和手段包括藥物治療、手術(shù)治療、運(yùn)動(dòng)療法、心理疏導(dǎo)及照料護(hù)理等。藥物治療為首選，且是整個(gè)治療過(guò)程中的主要治療手段。手術(shù)治療則是藥物治療的一種有效補(bǔ)充。藥物治療雖可暫時(shí)緩解癥狀，但不良反應(yīng)亦較明顯，并易產(chǎn)生耐藥[4]。幸運(yùn)的是，中醫(yī)藥治療PD可持續(xù)改善癥狀，減輕西藥不良反應(yīng)，降低耐藥性，與西藥合用可提高療效。石菖蒲作為醒腦開(kāi)竅的代表藥物被用于PD的治療，它具有開(kāi)竅豁痰、醒神益智、化濕辟穢的功效。現(xiàn)代研究表明，石菖蒲揮發(fā)油的主要有效成分為β-細(xì)辛醚，它分子量小，親脂性高，在體內(nèi)吸收快、分布快[5]，能快速通過(guò)血腦屏障，在腦組織內(nèi)分布廣泛[6，7]。我們前期發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚能夠改善6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)的PD模型大鼠的行為學(xué)，升高紋狀體內(nèi)高香草酸（HVA）、DA及5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）的含量，還可以降低α-syn的含量，同時(shí)促進(jìn)腦內(nèi)的酪氨酸羥化酶（TH）的表達(dá)[8]；此外，β-細(xì)辛醚能夠促進(jìn)左旋多巴（L-DOPA）入腦，升高腦內(nèi)DA的含量[9]。美多芭是臨床上治療PD的常用藥物，能夠有效改善PD的臨床癥狀，但是隨著應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)，多會(huì)出現(xiàn)療效減低和不隨意運(yùn)動(dòng)等副作用。如何延長(zhǎng)美多芭的應(yīng)用時(shí)間，減輕美多芭引起的副作用，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。因此，本研究觀(guān)察β-細(xì)辛醚聯(lián)合低劑量美多芭對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠的行為學(xué)、DA等神經(jīng)遞質(zhì)、DA合成酶及肝腎功能和組織病理學(xué)的影響，探討聯(lián)合用藥后，能否減少美多芭的使用劑量，療效是否與單獨(dú)使用美多芭相當(dāng)，是否能減輕肝腎功能的損害?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年SPF級(jí)SD大鼠70只，雌雄各半，220～250 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0034。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意（TCMF1-2015024）。

1.2藥物與試劑石菖蒲，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，產(chǎn)地四川，經(jīng)鑒定為天南星科植物石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）的干燥根莖，批號(hào)：150501；美多芭，上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：SH2244。阿撲嗎啡（APO）標(biāo)準(zhǔn)品，上海瑞齊生物科技有限公司，批號(hào)：100839-201212；維生素C片，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：150105；6-OHDA，上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：YY12246；水合氯醛，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)，批號(hào)：20140512；Anti-tyrosine hydroxylase antibody，美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab137869；Goat anti-rabbit IgG，F(xiàn)ITC conjugated，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)：CW0114；DA標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司，CAS：62-31-7；左旋多巴標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，貨號(hào)：100170-200303；高香草酸標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼斯特生物科技有限公司，貨號(hào)：must-12122301；5-羥色胺標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼斯特生物科技有限公司，貨號(hào)：Must-12122605；3，4-二羥苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma-Alorich公司，貨號(hào)：1451791V；多巴脫羧酶（DDC）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）（血清）試劑盒，加拿大Elixir醫(yī)藥公司，批號(hào)：D085SC；DDC ELISA（組織）試劑盒，加拿大ELIXIR醫(yī)藥公司，批號(hào)：D085FC；磷酸二氫鉀，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)，批號(hào)：20150123；甲醇（色譜純），德國(guó)Merck公司，CAS：67-56-1；乙腈（色譜純），德國(guó)Merck公司，CAS：75-05-8；4%多聚甲醛，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)：DF0135；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的ELISA（血清）試劑盒（批號(hào)：C009-2）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的ELISA（血清）試劑盒（批號(hào)：C010-2）、肌酐（Cr）的ELISA（血清）試劑盒，（批號(hào)：C011-2）、血尿素氮（BUN）的ELISA（血清）試劑盒（批號(hào)：C013-2）、總膽紅素（TBIL）ELISA（血清）試劑盒（批號(hào)：C019-1），南京建成生物工程研究所。

1.3儀器腦立體定位儀，美國(guó)STOELTING公司；疲勞轉(zhuǎn)棒儀，成都泰盟科技有限公司，型號(hào)：ZB-200；曠場(chǎng)箱，自制；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司，型號(hào)：Waters-2695；Symmetry色譜柱（150 mm×4.6 mm），美國(guó) Waters公司，Lot NO.0291351623；針筒式微孔濾膜過(guò)濾器，天津市騰達(dá)過(guò)濾器廠(chǎng)，規(guī)格：直徑25 mm，孔徑0.45 μm；Multiskan MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號(hào)：AE-200；3K30低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；ARATHON牙科鉆，SAEYANG公司；流式細(xì)胞儀，Beckman公司，型號(hào)：FC 500。

1.4藥物制備石菖蒲揮發(fā)油的制備：按照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部附錄揮發(fā)油的提取方法提取揮發(fā)油。稱(chēng)取石菖蒲，加8倍量的水，煎煮8 h，收集揮發(fā)油備用。β-細(xì)辛醚單體的制備：取石菖蒲揮發(fā)油，采用冷凍結(jié)晶法進(jìn)行純化和分離得白色晶體。β-細(xì)辛醚單體純度的檢測(cè)：用氣質(zhì)聯(lián)用法證實(shí)其純度為99%以上[10]。

1.5 PD模型制備在給予大鼠100 g/L水合氯醛（劑量為350 mg/kg）麻醉的狀態(tài)下，于左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束內(nèi)，單點(diǎn)注射6 μL（質(zhì)量濃度為4 g/L）的6-OHDA， 坐 標(biāo) 為 tooth bar： -2.3 mm， antero-Posterior： -4.4 mm，medio-lateral：1.2 mm，dorsoventral：-7.8 mm[11]。假手術(shù)組 10 只大鼠注射 6 μL的0.2 g/L維生素C生理鹽水。造模1個(gè)月后，將腹腔內(nèi)注射劑量為0.5 mg/kg的阿撲嗎啡（APO），且出現(xiàn)在水平地面轉(zhuǎn)圈，向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于7圈/min的大鼠判斷為成功PD模型。

1.6分組與給藥將造模成功的大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為模型組（蒸餾水，劑量為1 mL/100 g）、美多芭組（美多芭，劑量為75 mg/kg）、β-細(xì)辛醚組（β-細(xì)辛醚，劑量為15 mg/kg）、β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組（β-細(xì)辛醚15 mg/kg+美多芭18.75 mg/kg）、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組（β-細(xì)辛醚15 mg/kg+美多芭37.5 mg/kg）和β-細(xì)辛醚+美多芭組（β-細(xì)辛醚15 mg/kg+美多芭75 mg/kg）。每天分2次灌胃給藥，給藥30 d。本課題組研究β-細(xì)辛醚多年，認(rèn)為15 mg/kg的β-細(xì)辛醚最為合理。

1.7行為學(xué)檢測(cè)各組大鼠在給藥第28天進(jìn)行自主運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試（曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)）、平衡能力與協(xié)調(diào)性測(cè)試（轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)）和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)整合功能測(cè)試（前肢實(shí)驗(yàn)）的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。在給藥第29、30天進(jìn)行正式的行為學(xué)檢測(cè)。檢測(cè)前，每只大鼠要適應(yīng)5 min。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：自制60 cm×60 cm×40 cm的木箱，底部以10 cm×10 cm劃分，將大鼠放在中央格內(nèi)，記錄大鼠的移動(dòng)格子數(shù)，站立次數(shù)和中央停留時(shí)間；轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)：將大鼠放在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上，記錄大鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間；前肢實(shí)驗(yàn)：記錄右前肢的啟動(dòng)時(shí)間。

1.8取材第31天，將各組大鼠用100 g/L水合氯醛（劑量為350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，打開(kāi)大鼠的胸腹腔，腹主動(dòng)脈取血，用9.0 g/L生理鹽水心臟灌注（直到大鼠的肺完全變白為止），取肝腎，隨后開(kāi)顱取腦，分離紋狀體和中腦，稱(chēng)質(zhì)量記錄，放入相應(yīng)編號(hào)的離心管，紋狀體置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9觀(guān)察指標(biāo)與方法

1.9.1 高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定紋狀體內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)L-DOPA、DA、3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）、5-羥色胺（5-HT）、5-HIAA、HVA的含量 將紋狀體按1 mg∶5 μL加入5%高氯酸，電動(dòng)勻漿，離心（12 000 g，4℃）10 min后將上清液過(guò)濾放置于相應(yīng)編號(hào)的樣品瓶中，置于4℃待測(cè)。色譜條件：流動(dòng)相0.1 mol/L KH2PO4∶甲醇=80∶20，Waters Symmetry色譜柱（150 mm ×4.6 mm），柱溫30℃，流速1 mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)330 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.9.2 HPLC測(cè)定血清單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA的含量 取血清500 μL于相應(yīng)編號(hào)的離心管中，按1∶1（v/v）加入500 μL 5%高氯酸，渦旋混勻，離心（12 000 g，4℃）10 min后將上清液過(guò)濾放置于相應(yīng)編號(hào)的樣品瓶中，置于4℃待測(cè)。色譜條件：流動(dòng) 相 0.1 mol/L KH2PO4∶甲 醇 =80∶20， Waters Symmetry色譜柱（150 mm×4.6 mm），柱溫30℃，流速1 mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)330 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.9.3 ELISA檢測(cè)血清和中腦內(nèi)DDC的含量 取血清和中腦組織，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，檢測(cè)DDC的含量。

1.9.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定中腦內(nèi)TH的表達(dá)率 取各組新鮮中腦組織加入PBS 1 mL，用小剪刀剪碎組織（約100次），用吸管吹勻（約50次），用吸管吸出上液于100目篩網(wǎng)上；濾液用300目濾網(wǎng)過(guò)濾到流式管，離心（1 140 r/min，5 min），去上清液，加入PBS 1 mL，離心，去上清液，再加入PBS 1 mL，重復(fù)上述操作1次，根據(jù)指標(biāo)加入2 mL的PBS。

取單細(xì)胞懸液（1×106/mL）加入封閉液（含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的PBS液）2 mL，搖勻后室溫放置15 min，搖勻后均分到各個(gè)指定的指標(biāo)管中。離心去上清液，加入固定劑A 100 μL，搖勻后室溫固定15 min，加入1 mL封閉液洗1次。離心去上清液，加入破膜劑B 100 μL，一抗100 μL，搖勻后室溫避光孵育30 min，PAB洗1次。離心去上清液，加入二抗100 μL，搖勻后避光孵育20 min，PBS洗1次，離心去上清液，加入10 g/L多聚甲醛1 mL固定，封口待測(cè)。

1.9.5 肝腎功能檢測(cè) 取各組大鼠的血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，對(duì)ALT、AST、Cr、BUN和總膽紅素進(jìn)行檢測(cè)。

1.9.6 肝腎病理學(xué)檢測(cè) 取各組大鼠的肝腎組織，脫水，進(jìn)行蘇木素—伊紅（HE）染色，封片，在顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀(guān)察。

1.10統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組

別之間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，若方差齊性檢驗(yàn)P＞0.05，兩兩之間比較采用LSD，否則兩兩之間比較采用Dunnett's test，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)結(jié)果表1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠移動(dòng)格子數(shù)、站立次數(shù)和轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間明顯減少（P＜0.05），中央格停留時(shí)間和右前肢啟動(dòng)時(shí)間明顯增加（P＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，各治療組移動(dòng)格子數(shù)、站立次數(shù)和轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間均增加，中央格停留時(shí)間和右前肢啟動(dòng)時(shí)間明顯減少，除β-細(xì)辛醚組移動(dòng)格子數(shù)、站立次數(shù)，β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組站立次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，各治療組其余指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與美多芭組比較，β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組、β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的移動(dòng)格子數(shù)，β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的中央格停留時(shí)間，β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組和β-細(xì)辛醚+美多芭組的大鼠站立次數(shù)轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間、右前肢啟動(dòng)時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明β-細(xì)辛醚聯(lián)合小劑量美多芭對(duì)PD模型大鼠的行為異常有改善作用，且療效與常規(guī)劑量美多芭療效相當(dāng)。

2.2 β-細(xì)辛醚聯(lián)合美多芭對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響表2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的DA、DOPAC和5-HT含量明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組和β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠L-DOPA含量明顯增加（P＜0.05），美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組和β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的DA和DOPAC含量明顯增加（P＜0.05），β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組和β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組大鼠的5-HT含量明顯增加（P＜0.05）；與美多芭組大鼠比較，β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組大鼠的L-DOPA含量，β-細(xì)辛醚組、β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組和β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的DA含量，β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組和β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的DOPAC含量，β-細(xì)辛醚組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組和β-細(xì)辛醚組+美多芭組大鼠的5-HT含量，β-細(xì)辛醚組、β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組和β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的5-HIAA和HVA含量均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。表明PD模型大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量減少，β-細(xì)辛醚聯(lián)合不同劑量美多芭能夠增加PD模型大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量，且β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組與美多芭組紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量相當(dāng)。

表1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 .Results for behavioral tests ()

表1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 .Results for behavioral tests ()

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與美多芭組比較

組別假手術(shù)組模型組美多芭組β-細(xì)辛醚組β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組β-細(xì)辛醚+美多芭組右前肢啟動(dòng)時(shí)間（t/s）5.3±1.2&15.9±4.5①6.2±1.7②8.6± 2.6②③6.6±2.2②6.5±1.8②6.8±2.0②N 10 10 10 10 10 10 10移動(dòng)格子數(shù)（n/個(gè)）98.8±13.0 41.6±11.3①76.5±11.1②52.0±12.5③61.2± 13.1②③69.9±14.4②84.0±12.4②站立次數(shù)（n/次）17.8±4.2 4.6±1.6①8.6±2.7②5.3±1.8③6.6±2.4 7.4±2.2②10.2±3.0②中央格停留時(shí)間（t/s）1.9±0.7 7.7±2.0①2.5±1.0②5.2± 1.9②③5.2± 1.8②③4.5± 1.5②③1.8±0.8②轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間（t/s）40.8±9.8 11.5±2.8①22.1±4.1②17.5 ± 4.4②③17.6±3.3②19.1±4.3②19.2±3.1②

表2 各組紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)含量比較Table 2 Comparison of the contents of neurotransmitters in the striatum of various groups ()

表2 各組紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)含量比較Table 2 Comparison of the contents of neurotransmitters in the striatum of various groups ()

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與美多芭組比較

組別假手術(shù)組模型組美多芭組β-細(xì)辛醚組β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組β-細(xì)辛醚+美多芭組HVA[w/（ng·mg-1）]1.6±0.4 1.3±0.3 1.5±0.4 1.3±0.3 1.6±0.3 1.3±0.2 1.5±0.3 N 10 10 10 10 10 10 10 L-DOPA[w/（ng·μg-1）]36.8±5.2 30.4±2.0 119.2±28.3②39.3±2.7③68.5±16.4③98.7±9.7②88.0± 11.6②③DA[w/（ng·mg-1）]14.5±2.7 11.7±1.4①16.2±3.1②14.2±1.8 20.1±4.2②25.5±1.6②③20.1±3.1②DOPAC[w/（ng·mg-1）]1.200±0.100 0.003±0.000①1.300±0.200②0.040±0.006③0.700±0.040②0.900±0.090②0.900±0.100②5-HT[w/（ng·μg-1）]49.0±7.2 8.5±2.3①24.6±5.8 19.8±9.0 61.8±14.4②③53.0±10.1②30.8±7.2 5-HIAA[w/（ng·μg-1）]154.1±25.1 154.0±20.1 170.2±38.2 198.0±41.9 235.1±31.2 253.7±18.2 137.7±15.6

2.3 β-細(xì)辛醚聯(lián)合美多芭對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)的影響表3結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠DA含量無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組及β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠DA含量明顯增高（P＜0.05）；與美多芭組比較，β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組、β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的DA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明β-細(xì)辛醚聯(lián)合使用減少劑量的美多芭后，對(duì)血清DA含量無(wú)明顯影響。

2.4 β-細(xì)辛醚聯(lián)合美多芭對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠相關(guān)酶的影響表4結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠中腦酪氨酸羥化酶（TH）表達(dá)率明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，美多芭組和β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組大鼠的TH表達(dá)率明顯增高（P＜0.05）。表明PD模型TH減少，美多芭和β-細(xì)辛醚+1/2美多芭均能夠升高中腦TH的含量。

表3 各組血清DA含量比較Table 3 Comparison of the serum content of DA in various groups ()

表3 各組血清DA含量比較Table 3 Comparison of the serum content of DA in various groups ()

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與美多芭組比較

組別假手術(shù)組模型組美多芭組β-細(xì)辛醚組β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組β-細(xì)辛醚+美多芭組DA[ρ/（μg·mL-1）]129.04±41.68 152.61±44.73 296.06±43.22①169.70±42.03②209.83±68.15 289.90±55.45①273.43±51.40①N 10 10 10 10 10 10 10

與假手術(shù)組比較，模型組血清中DDC含量無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，美多芭組、β-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組和β-細(xì)辛醚+美多芭組的大鼠的血清中DDC的含量明顯下降（P＜0.05）。表明美多芭、β-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚+1/4美多芭、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭和β-細(xì)辛醚+美多芭均能夠抑制血清DDC含量。

各組中腦內(nèi)DDC含量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明PD大鼠中腦DDC無(wú)明顯變化，美多芭、β-細(xì)辛醚單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥治療亦對(duì)中腦DDC無(wú)明顯影響。

2.5 β-細(xì)辛醚聯(lián)合美多芭對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠肝腎功能的影響表5結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的ALT、AST、Cr、BUN和TBIL的含量無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與模型組比較，美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組和β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的ALT和BUN含量明顯增加（P＜0.05），美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組、β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組、β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠CR含量明顯增加（P＜0.05），各治療組AST、TBIL無(wú)明顯差異（P＞0.05）。表明PD模型肝腎功能無(wú)損害，應(yīng)用美多芭后，肝腎功能指標(biāo)明顯升高。

表4 各組中腦TH表達(dá)率，血清、中腦內(nèi)DDC含量比較Table 4 Comparison of the expression rate of DDC in the mesocerebrum and the content of DDC in the serum and mesocerebrum of various groups ()

表4 各組中腦TH表達(dá)率，血清、中腦內(nèi)DDC含量比較Table 4 Comparison of the expression rate of DDC in the mesocerebrum and the content of DDC in the serum and mesocerebrum of various groups ()

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組美多芭組β-細(xì)辛醚組β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組β-細(xì)辛醚+美多芭組DDC中腦[w/（ng·g-1）]5.1±1.5 4.0±1.1 4.1±2.0 5.5±2.7 4.3±1.7 3.4±2.0 3.4±1.6 N 10 10 10 10 10 10 10中腦TH表達(dá)率（p/%）10.4±1.7 7.5±1.9①9.0±0.8②8.9±1.6 8.5±2.6 10.5±2.6②7.0±1.5血清[ρ/（ng·mL-1）]13.9±2.5 12.7±2.5 7.5±1.1②9.4±1.0②9.7±3.0②9.5±1.1②8.1±0.9②

2.6 β-細(xì)辛醚聯(lián)合美多芭對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠肝腎病理變化的影響圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組、模型組和β-細(xì)辛醚組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，形態(tài)完整，未見(jiàn)脂肪空泡，匯管區(qū)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。腎皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，腎小球未見(jiàn)增生或萎縮、毛細(xì)血管袢未見(jiàn)壞死，腎小球毛細(xì)血管未見(jiàn)擴(kuò)張充血、管壁未見(jiàn)增厚，腎間質(zhì)未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。美多芭組的大鼠的肝組織匯管區(qū)較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)。腎間質(zhì)小片狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。聯(lián)合用藥組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，形態(tài)完整，未見(jiàn)脂肪空泡，匯管區(qū)可見(jiàn)不同程度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且以β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組大鼠的匯管區(qū)炎性細(xì)胞最少。β-細(xì)辛醚+美多芭組大鼠的腎間質(zhì)內(nèi)小灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組大鼠的腎間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞逐漸減少，β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組大鼠的腎間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞最少。

表5 各組肝腎功能比較Table 5 Comparison of the hepatic-renal function in various groups ()

表5 各組肝腎功能比較Table 5 Comparison of the hepatic-renal function in various groups ()

①P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組美多芭組β-細(xì)辛醚組β-細(xì)辛醚+1/4美多芭組β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組β-細(xì)辛醚+美多芭組TBIL[c/（μmol·L-1）]4.2±1.0 4.0±1.3 3.7±1.9 4.5±1.8 4.8±1.5 3.9±1.2 4.0±1.6 N 10 10 10 10 10 10 10 ALT[J/（U·L-1）]11.3±3.0 10.6±2.5 17.4±4.3①10.8±3.1 12.3±1.5 14.8±2.2①18.5±2.2①AST[J/（U·L-1）]13.9±3.1 14.7±3.5 13.4±3.8 14.2±4.2 12.7±4.5 14.4±4.5 15.6±4.3 Cr[c/（μmol·L-1）]17.5±3.3 22.0±6.6 43.5±10.2①23.6±4.8 29.1±5.8①36.6±7.3①42.7±6.3①BUN[c/（mmol·L-1）]61.7±12.7 65.0±16.1 100.0±30.2①70.0±5.6 79.6±21.5 93.5±18.1①100.4±20.1①

圖1 各組肝腎組織病理變化比較（n=3，HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathological changes of liver and kidney tissues in vaious groups（n=3，by HE staining，×200）

3 討論

PD屬于中醫(yī)學(xué)的顫證，亦稱(chēng)“顫振”、“振掉”、“震顫”等，是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。病理特征為多巴胺能神經(jīng)元減少及神經(jīng)元內(nèi)路易小體的形成。臨床癥狀主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵直及姿勢(shì)步態(tài)異常等。美多芭是臨床上治療PD的常用藥物，能夠有效改善PD的臨床癥狀，但隨著應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)，多會(huì)出現(xiàn)療效減低和不隨意運(yùn)動(dòng)等副作用。本研究觀(guān)察β-細(xì)辛醚聯(lián)合美多芭對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠的行為學(xué)、DA等神經(jīng)遞質(zhì)、促進(jìn)DA合成的相關(guān)酶及肝腎功能和組織病理學(xué)的影響，結(jié)果顯示β-細(xì)辛醚聯(lián)合1/2或1/4劑量美多芭，療效與單獨(dú)使用美多芭相當(dāng)，可減輕血清肝腎功能和肝腎病理的損害，從而達(dá)到減少美多芭的使用劑量的目的，這樣可以延長(zhǎng)美多芭的應(yīng)用時(shí)間，減輕美多芭引起的肝腎功能損害。

本研究觀(guān)察到β-細(xì)辛醚聯(lián)合小劑量美多芭能夠改善6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠的自主運(yùn)動(dòng)功能、平衡能力與協(xié)調(diào)性及感覺(jué)運(yùn)動(dòng)整合功能，減輕肝腎功能損害。這與我們的前期研究結(jié)果一致，β-細(xì)辛醚能夠明顯改善PD模型大鼠的自主活動(dòng)次數(shù)、滾軸運(yùn)動(dòng)能力，使PD模型大鼠平衡能力明顯增高[12]；聯(lián)合L-DOPA能夠改善PD模型大鼠的行為學(xué)，并能夠減少肝腎功能損害[9]。說(shuō)明β-細(xì)辛醚聯(lián)合小劑量美多芭的療效與單獨(dú)使用常規(guī)劑量的美多芭療效相當(dāng)。

DA是腦內(nèi)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，PD患者的黑質(zhì)紋狀體中DA的含量不足導(dǎo)致PD的運(yùn)動(dòng)障礙。L-DOPA是合成DA的中間產(chǎn)物，是DA的前體，在L-DOPA轉(zhuǎn)化為DA的限速酶DDC的作用下生成DA。L-DOPA可以通過(guò)血腦屏障，而DA本身則不能，因此L-DOPA被用作治療PD的藥物來(lái)增加DA的水平。L-DOPA在腦外以及大腦組織中發(fā)生快速脫羧反應(yīng)生成DA，使得大多數(shù)L-DOPA不能到達(dá)腦內(nèi)，而外周產(chǎn)生的DA常會(huì)引起不良反應(yīng)。因此，抑制腦外組織中L-DOPA的脫羧反應(yīng)是十分必要的。L-DOPA與外周脫羧酶抑制劑芐絲肼同時(shí)給藥即可達(dá)到這一目的。美多芭是L-DOPA與芐絲肼按4∶1制成的復(fù)方制劑，在臨床試驗(yàn)和治療應(yīng)用中已證明這一比例具有最佳療效，與單獨(dú)給予大劑量L-DOPA的效果相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀(guān)察到：聯(lián)合用藥可以增加紋狀體內(nèi)L-DOPA、DA、DOPAC和5-HT的含量，增加血清內(nèi)DA的含量，同時(shí)抑制血清中的DDC。β-細(xì)辛醚可能通過(guò)抑制血清DDC，從而減少L-DOPA在腦外脫羧轉(zhuǎn)化為DA，這能夠減輕L-DOPA在腦外轉(zhuǎn)化為DA所產(chǎn)生的副作用，并提高腦內(nèi)DA的含量。

TH是酪氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-DOPA的限速酶，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀(guān)察到：美多芭組和β-細(xì)辛醚+1/2美多芭組的大鼠的TH的表達(dá)率明顯增高。這一結(jié)果表明，聯(lián)合用藥能夠增加腦內(nèi)L-DOPA的生成量，有利于DA的生成。

本研究觀(guān)察到應(yīng)用美多芭后，肝腎功能血液及病理變化指標(biāo)比沒(méi)有應(yīng)用美多芭組有明顯升高，說(shuō)明美多芭對(duì)肝腎功能有影響。故減少美多芭的使用劑量，可以減輕美多芭引起的肝腎功能損害。

綜上所述，β-細(xì)辛醚聯(lián)合低劑量美多芭，療效與單獨(dú)使用美多芭相當(dāng)，且可減輕對(duì)肝腎功能和肝腎病理的損害，從而達(dá)到減少美多芭的使用劑量的目的，這樣可以延長(zhǎng)美多芭的應(yīng)用時(shí)間，減輕美多芭引起的肝腎功能損害。其原因可能是通過(guò)提高腦組織內(nèi)TH含量，抑制血清內(nèi)DDC的含量來(lái)增加腦組織內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量。本研究為臨床治療PD提供了新的思路。