賈 寧 魏 翔 葛若木 劉江波 李 明 張素梅

色素失禁癥(incontinentia pigmenti, IP, OMIM308300)，是一種少見X染色體顯性遺傳病，可伴隨多系統(tǒng)發(fā)育障礙，可累及牙齒、眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其他器官，以皮膚損害為典型特征[1]。皮膚典型的臨床表現(xiàn)分為四期，第一期為紅疹-水皰，線性分布于軀干或肢端，可在出生及出生兩周后出現(xiàn)；第二期為疣狀角化丘疹和斑塊，分布于肢端，出生2～6周后出現(xiàn)；第三期色素沉著，沿Blaschko線條紋狀或旋渦狀分布于軀干，在出生12～26周后出現(xiàn)；第四期蒼白萎縮性斑塊或色素減退，可在青春早期到成年的任何時期出現(xiàn)[2]。 這四個階段的皮損可同時出現(xiàn)或依次出現(xiàn)。 2000年，Smahi[3]等發(fā)現(xiàn)NEMO(inhibitor of κ polypeptide gene enchancer in B cells)基因突變是色素失禁癥病因，該基因組重排可修復(fù)NF-κB活性。 Minic[4]等總結(jié)發(fā)現(xiàn)NEMO 外顯子4～10大片段缺失存在于70%～80%患者中，其它突變?yōu)樵摶螯c突變或移碼突變等，目前已報道出53個不同突變位點。本文報道1例中國漢族色素失禁癥家系(圖1)，對NEMO 基因進(jìn)行外顯子測序，發(fā)現(xiàn)位于第5號外顯子存在新的移碼突變c.723_c.724insCAGG并在家系內(nèi)傳遞，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 先證者，女，5歲。2012年9月出生，于2013年1月外院檢查發(fā)現(xiàn)四肢、腋下、腹部及背部見散在大小不等，形狀不規(guī)則的褐色色素沉著，眼睛、牙齒及神經(jīng)系統(tǒng)查體無特殊。至2018年2月復(fù)檢發(fā)現(xiàn)軀干和四肢可見漩渦狀潑墨樣色素沉著斑，余未見明顯異常(圖2a、2b)。2018年4月入我院檢查，表現(xiàn)同2018年2月。先證者母親，即家系內(nèi)成年患者，出生時即有皮疹，成年后可見軀干及雙下肢呈現(xiàn)條索狀色素減退斑塊，但無其他外胚層發(fā)育不良表現(xiàn)。病程類似先證者，但病情與之相比較輕(圖2c)。除先證者及家系內(nèi)患者，家族中其他人無明顯異常(圖1)。結(jié)合臨床表現(xiàn)及Sanger測序結(jié)果，診斷為：色素失禁癥。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取 經(jīng)由新華醫(yī)院允許，并獲得患者及家屬的知情同意，我們收集先證者和母親以及其余正常家屬的外周血2 mL至含2%EDTA抗凝劑管，-20℃儲存，并采用鹽析法提取基因組DNA。同時，對100名正常人的外周血也進(jìn)行基因組DNA提取，作為健康對照，以排除基因多態(tài)性干擾。

1.2.2 引物設(shè)計及PCR 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。NEMO基因引物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行設(shè)計及合成，巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)由上海安百隆生物技術(shù)有限公司完成。巢式PCR分為兩輪反應(yīng)，第一輪反應(yīng)目的為去除同源序列，第二輪反應(yīng)目的為擴(kuò)增目的片段。NEMO第5號外顯子引物序列如下：第一輪引物：上游5’-ACTGAAAACCCACTTTAGCA-3’，下游5’-GCAGTCTAGGAAAGAACTCC-3’；第二輪引物：上游5’-GCAAACA CGTCTTAAGCAAA-3’，下游5’-CAGATTGGATGCTGGTA GAC-3’。PCR擴(kuò)增程序如下：第一輪反應(yīng)：3 min升溫至95℃，并在95℃變性持續(xù)30 s，于55℃退火，持續(xù)30 s，于72℃延伸，持續(xù)10 min，共35個循環(huán)，72℃終極延伸5 min。第二輪反應(yīng)：與第一輪反應(yīng)基本一致，但72℃延伸，持續(xù)30 s，共35個循環(huán)，72℃終極延伸5 min。

1.2.3 MLPA及Sanger測序 MLPA用于檢測NEMO基因是否存在大片段缺失。Sanger測序用于檢測NEMO基因外顯子及側(cè)翼序列是否存在突變。此兩種測序均在上海安百隆生物科技有限公司進(jìn)行，ABI 3730測序儀用于檢測MLPA PCR產(chǎn)物，并以ROX500 SIZE為標(biāo)準(zhǔn)，后應(yīng)用Coffalyzer 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。ABI 3730XL用于檢測Sanger PCR產(chǎn)物，并以已報道的NEMO未突變序列為參照，采用Chromas 2.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

圖1IP家系圖圖22a,2b：四肢及軀干沿Blaschko線條紋狀或旋渦狀分布的色素沉著斑；2c：先證者母親雙下肢網(wǎng)格狀色素減退斑

圖3 IP家系NEMO基因MLPA檢測結(jié)果(3a,3b,3c分別是先證者，先證者母親，家系內(nèi)正常人)：均無大片段缺失

2 結(jié)果

利用MLPA檢測該家系先證者、母親及正常人的NEMO基因是否存在大片段缺失， 結(jié)果表明，家系內(nèi)三位被檢測者的NEMO基因均無大片段缺失(圖3a-3c)。利用Sanger測序檢測該家系先證者、母親及正常人的NEMO基因點突變情況，結(jié)果表明，先證者NEMO基因第5號外顯子檢測出移碼突變c.723_c.724 insCAGG，在基因組723位插入CAGG四個連續(xù)堿基致終止密碼子提前出現(xiàn)，導(dǎo)致第256位表達(dá)氨基酸由精氨酸(Arg)變成終止密碼子(Stop)(p. A241fsX256)，形成截短N(yùn)EMO蛋白(圖4a)。家系內(nèi)患者也檢測出相同位點突變(圖4b)。 表型正常的其他家族成員及100名健康對照未發(fā)現(xiàn)此突變位點(圖4c)。

圖4IP家系NEMO基因突變檢測結(jié)果(4a,4b,4c分別是先證者，先證者母親，家系內(nèi)正常人)：先證者及母親檢出相同突變，家系內(nèi)正常人未檢出此突變

3 討論

自從1925年Bruno Bloch[5]首次發(fā)現(xiàn)色素失禁癥以來，越來越多的散發(fā)病例或家系病例被報道。 該病是一種少見的X染色體連鎖顯性遺傳性疾病，常表現(xiàn)為外胚層發(fā)育障礙，可影響多個系統(tǒng)正常發(fā)育，同時伴有皮膚異常表現(xiàn)，成年后常表現(xiàn)為皮膚色素減退或皮膚萎縮。 盡管有男性患者的存活病例，但是色素失禁癥常見于大部分女性患者，且在同一家系的女性間傳遞[6]。 然而，仍存在一些少見的遺傳方式，如在父女間傳遞，表型正常的父母生出多個IP患兒等，也可能間接說明除了NEMO基因突變，還有其他因素也導(dǎo)致色素失禁癥發(fā)生[7,8]，當(dāng)然NEMO基因的嵌合突變也可以導(dǎo)致上述情況的發(fā)生，該病目前尚無特殊療法。

在本研究中，家系內(nèi)成年患者被檢測出NEMO基因突變，表現(xiàn)出前臂及大腿處輕微皮膚改變，而檢出相同突變的先證者，在軀干及雙下肢均可見典型第三期色素失禁癥皮膚損害，截止到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)伴隨的其他系統(tǒng)異常，但是皮損也可能伴隨其他皮膚附件的損害，如頭頂部脫發(fā)、趾甲營養(yǎng)不良等[9]。 甚至已有幾例色素失禁癥病例在童年時期與腫瘤形成有關(guān)[4，10]。 所以，定期隨訪是防治的必要措施。

既往文獻(xiàn)中有數(shù)例5號外顯子點突變導(dǎo)致IP的病例報道。Minic等[10]于2015年報道一個散發(fā)IP病例的致病基因測序結(jié)果顯示5號外顯子存在c.641_647delGC ATGGAinsAT，并且此突變未在其他正常人中檢測到。該患兒臨床表現(xiàn)為典型的IP皮膚病損，伴有圓錐形齒及牙齒發(fā)育延遲。Aradhya等[11]于2001年在357個IP病例中發(fā)現(xiàn)277個突變，NEMO測序結(jié)果顯示有7個突變發(fā)生在5號外顯子。其中，在c.570_574del突變的IP病例僅表現(xiàn)為牙齒病變，而另一個c.653_659dup突變的病例則在眼部和牙齒均出現(xiàn)病變。在本次研究中，先證者的基因測序結(jié)果也顯示在5號外顯子存在突變(c.723_c.724insCAGG)，并且患者出現(xiàn)明顯的三期IP皮膚病變。且此突變僅在先證者及家系患者被檢測到，在家系正常人及100名健康對照中均未被檢測到。且此突變尚未在既往文獻(xiàn)中被報道。

NEMO/IKBKG(inhibitor of κ polypeptide gene enchancer in B cells)突變是色素失禁癥(IP)主要致病因素。 Smahi等[3]第一次發(fā)現(xiàn)NEMO基因突變直接參與色素失禁癥形成。 NEMO基因位于X染色體，其編碼蛋白是IKK復(fù)合體調(diào)節(jié)亞基IKKγ(NEMO)[12]。NEMO蛋白有多個功能域，包含2個螺旋功能域(HLX1，HLX2)、2個卷曲功能域(CC1，CC2)、1個NEMO 泛素結(jié)合域(NUB)、1個亮氨酸拉鏈(LZ)和1個鋅指結(jié)構(gòu)域(ZF)[13]。本研究中，患者X染色體上NEMO基因5號外顯子發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，形成截短的NEMO蛋白，除了HLX1和CC1兩個功能域被保留，CC2至ZF功能域均缺失。既往研究表明，NEMO介導(dǎo)NF-κB 活化的途徑，都是通過NEMO的泛素結(jié)合功能域去識別非降解泛素鏈的蛋白[13]，該功能的實現(xiàn)的必需因素包括CC2低聚化和ZF功能域與K63-連接的聚泛素鏈連接等[13，14]。所以此突變損害NEMO活性，即NEMO二聚化和聚泛素鏈連接的能力會受到影響，進(jìn)而IKK復(fù)合體催化亞基活化及NEMO激活都不同程度受到影響。NF-κB是NEMO蛋白下游結(jié)合分子，參與許多生理活動，包括炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及胚胎發(fā)育等。NEMO活性損害導(dǎo)致NF-κB 活化受阻，進(jìn)而影響上述生理過程[15]。

色素失禁癥與NEMO蛋白功能障礙相關(guān)，盡管截短N(yùn)EMO能與IKK復(fù)合體其他亞基進(jìn)行功能聯(lián)系，但是不能參與激活NF-κB通路，同時，色素失禁癥患者的胚胎纖維母細(xì)胞在體外實驗中缺乏NF-κB活化表現(xiàn)也證實這一點[12]。雖然我們針對NEMO的外顯子及側(cè)翼序列進(jìn)行測序，但是不排除基因的其他調(diào)節(jié)作用的區(qū)域也包含潛在的致病突變位點，如啟動子區(qū)域和非編碼區(qū)域等。總之，此次結(jié)果進(jìn)一步擴(kuò)大色素失禁癥致病基因NEMO的突變譜，為探究突變NEMO蛋白的功能打下基礎(chǔ)。。