王元紅，魯智敏，張學(xué)琪，劉自敏，胡子慧，楊侃侃，劉紅梅，潘 玲，彭開松，李永東，王 勇，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2.寧波市疾病預(yù)防控制中心，浙江 寧波 315010)

禽白血病病毒(avian leucosis virus，ALV)為反轉(zhuǎn)錄病毒科α反病毒屬成員，能夠引起禽類特別是雞的多種腫瘤性疾病[1]。根據(jù)病毒囊膜蛋白與病毒的宿主特異性相關(guān)的gp85蛋白抗原性不同，ALV可分為A-J 10個(gè)亞群。進(jìn)一步又可分為兩大類：一類為A、B、C、D和J亞群等外源性病毒，具有致病性，以A、B和J亞群為主；另一類屬內(nèi)源性病毒，大多數(shù)整合在宿主的基因上，主要以前病毒的形式存在，對(duì)雞幾乎不致病，但普遍存在于雞群中，可以加重ALV其他亞群的感染[2-4]。

1991年英國(guó)學(xué)者首次在肉雞中發(fā)現(xiàn)一種新型禽白血病病毒ALV J，其在雞群中的致病性和傳染性最強(qiáng)[5]。ALV J基因組主要含有g(shù)ag、pol和env3個(gè)基因，其gag和pol基因相對(duì)保守，而包括gp85在內(nèi)的env基因上存在著較大變異，其亞群特異性主要是由gp85基因編碼表面囊膜蛋白所決定[6]。我國(guó)自1999年分離出第一株ALV J亞型病毒以來，陸續(xù)可見從商品肉雞和蛋雞中分離出該病毒的報(bào)道[7-9]。禽白血病的凈化較為困難，其垂直和水平傳播引起臨床和亞臨床感染對(duì)我國(guó)禽類養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究為確定安徽巢湖某養(yǎng)雞場(chǎng)的疑似禽白血病的病原，通過RT-PCR、透射電鏡及組織病理學(xué)的方法進(jìn)行鑒定，確診病原為J亞型禽白血病。同時(shí)以gp85基因?qū)υ摲蛛x株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。本試驗(yàn)為了解安徽土雞種群中禽白血病的分子流行病學(xué)特點(diǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

rTaqDNA 聚合酶、pMD19-T 載體、SolutionⅠ、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司；DF-1細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自北京Tiangen公司；青霉素-鏈霉素溶液(100×)購(gòu)自上海Beyotime公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液及FBS胎牛血清購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；銅網(wǎng)、國(guó)產(chǎn)網(wǎng)碳支持膜及磷鎢酸染液購(gòu)自北京Zxbairu技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病料采集及處理

2018年3月安徽巢湖某養(yǎng)雞場(chǎng)疑似暴發(fā)禽白血病，對(duì)臨床癥狀明顯的疑似禽白血病的病禽進(jìn)行剖檢，無菌采集病禽的心臟、肝臟、腺胃和脾臟。取部分病料以PBS漂洗3次后，剪碎，加入5 mL PBS研磨充分并按1 000 U·mL-1加入青霉素-鏈霉素溶液，8 000 r·min-1離心3 min，取上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后置于-80 ℃冰箱待用。

1.3.2 病毒分離及增殖培養(yǎng)

取1 mL 1.3.1節(jié)中的病料上清接種于細(xì)胞密度約為80%的DF-1細(xì)胞，置于37 ℃含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1.5 h后棄去病毒液，PBS輕洗3次，加入含1% FBS的DMEM細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)7 d。7 d后將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，收毒，置于-80 ℃保存。

1.3.3 透射電鏡負(fù)染觀察

取1.3.2節(jié)中的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行超速離心濃縮，吸取20 μL上清滴于封口膜，銅網(wǎng)吸附3～5 min，以10 g·L-1磷鎢酸(pH 6.8～7.4)負(fù)染1 min，透射電鏡下觀察并拍照。

1.3.4 RNA的提取與RT-PCR

取1 mL ALV 細(xì)胞培養(yǎng)液提取病毒RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-80 ℃待用。

1.3.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上公布的gp85基因序列(No. Z46390)，通過Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物用于gp85基因的擴(kuò)增。上游引物為5’-GGAGTTCATCTGTTGCGA-3’；下游引物為5’-CGCGGATCCGCGCCTGCTACGGCGGT-3’。預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)約928 bp。引物委托南京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.6gp85基因的PCR 擴(kuò)增

利用合成的引物，對(duì)gp85基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：rTaqDNA聚合酶Mix 10 μL，ALV cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，補(bǔ)加滅菌ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布氨芐抗性的LB平板上。37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落，通過菌液PCR篩選陽性克隆。再將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒送往南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.7 組織病理學(xué)觀察

采集病雞心、肝、脾及腺胃的組織塊，用10%中性福爾馬林固定。然后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行HE染色，用顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)觀察病理組織學(xué)變化并拍照。

1.3.8gp85基因序列分析

將獲得的基因序列進(jìn)行BLAST檢索，用DNASTAR軟件將分離毒株的gp85基因序列分別與GenBank中已發(fā)表的ALV不同亞群代表株進(jìn)行核苷酸同源性比較。采用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行多序列匹配排列，運(yùn)用Mega 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過1 000次的自舉分(Bootstrap)進(jìn)行置信度檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病雞外觀及剖檢病理變化

發(fā)病雞表現(xiàn)為極度消瘦、貧血，雞冠肉髯蒼白萎縮，剖檢可見肌肉顏色偏淺；肝臟、脾臟和腎臟腫大，質(zhì)脆易碎，表面與切面均見有大小不等的白色或灰白色結(jié)節(jié)；心臟顏色蒼白，心肌疲軟；肺臟顏色蒼白；胰腺潮紅；腺胃出血、糜爛；卵泡變性、壞死(圖1)。

2.2 ALV的透射電鏡負(fù)染觀察

透射電鏡負(fù)染觀察可見完整的病毒粒子，呈球形，大小約100 nm，有核心，電子密度較高，核心外包有一層囊膜(圖2)。

A，雞冠肉髯蒼白萎縮；B，肌肉顏色偏淺；C，肝臟、脾臟和腎臟腫大，質(zhì)脆易碎，表面有大小不等的白色或灰白色結(jié)節(jié)；D，腺胃出血、糜爛。A， The cockscomb was pale and atrophy; B， Light muscle tissue; C， The liver， spleen and kidney were swollen， brittle and fragile with white nodulesoccurred; D， Glandular hemorrhage and erosion.圖1 病雞的臨床剖檢病理變化Fig.1 Pathological changes of sick chicken by clinical anatomy

圖2 ALV的透射電鏡負(fù)染觀察Fig.2 Negative staining observation of ALV by transmission electron microscope

2.3 gp85基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約928 bp左右特異性條帶，與預(yù)期相符(圖3)。序列測(cè)定結(jié)果未發(fā)現(xiàn)堿基突變和缺失。

2.4 組織學(xué)病理變化

病理切片觀察結(jié)果顯示，心臟組織可見彌漫性淋巴樣瘤細(xì)胞，心肌纖維間隙有出血；肝組織中肝細(xì)胞消失，可見腫瘤結(jié)節(jié)灶，腫瘤細(xì)胞多為形態(tài)各異的成淋巴細(xì)胞和淋巴樣瘤細(xì)胞，并多見病理性核分裂相；脾臟組織脾小體消失伴有數(shù)量不等局灶性或彌漫性腫瘤細(xì)胞增生灶；腺胃肌層及腺胃乳頭間隙有彌漫性淋巴樣瘤細(xì)胞，腺胃乳頭出血(圖4)。

M，DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，gp85基因的RT-PCR產(chǎn)物；2，陰性對(duì)照。M， DL2000 DNA marker; 1， gp85 gene RT-PCR product; 2，Negative control.圖3 gp85基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 RT-PCR amplification of gp85 gene

2.5 gp85基因的遺傳進(jìn)化分析

AHCH-2018株的gp85基因長(zhǎng)度為928 bp。該序列與GD1401J相似度最高，達(dá)99.5%。核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果表明：分離株與廣東J亞群GD1401J的同源性最高，達(dá)99.5%；與美國(guó)J亞群ALV經(jīng)典代表株HPRS-103同源性為98.1%；與A亞群代表株RAV-1同源性為49.1%；與B亞群代表株RSV-B同源性為46.9%；與C亞群代表株RSV-C同源性為48.7%；與D亞群代表株RSV-D同源性為49.7%；與E亞群代表株ALVE-B11核苷酸同源性為46.5%(圖5)。

繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，ALV的J亞群與A、B、C、D、E亞群在進(jìn)化樹分為兩大分支，分離株與GD1401J處于同一分支；與美國(guó)J亞群ALV經(jīng)典代表株HPRS-103有一定的遺傳距離(圖6)。

A，心臟組織可見彌漫性淋巴樣瘤細(xì)胞，心肌纖維間隙有出血(HE×400)；B，肝組織中肝細(xì)胞消失，可見腫瘤結(jié)節(jié)灶，并多見病理性核分裂相(HE×400)；C，脾臟組織脾小體消失伴有數(shù)量不等局灶性或彌漫性腫瘤細(xì)胞增生灶(HE×400)；D，腺胃肌層及腺胃乳頭間隙有彌漫性淋巴樣瘤細(xì)胞，腺胃乳頭出血(HE×400)。A， Foci of tumor cell proliferationoccurred in the heart tissue， the myocardial fibrosis hemorrhage (HE×400); B， The structures of liver were difficult to identify， foci of tumor cell proliferation and pathological mitotic phaseoccurred in liver(HE×400); C， Foci of tumor cell proliferation occurred in spleen， splenic corpuscles demolished and disappeared (HE×400); D， Foci of tumor cell proliferation occurred in glandular gastric muscle and glandular papillary space， gland gastric papillary hemorrhage (HE×400).圖4 組織病理學(xué)變化Fig.4 Histopathological changes

圖5 分離株gp85基因與不同ALV亞群經(jīng)典株和參考株的核苷酸序列同源性分析Fig.5 Similarity analysis of nucleotide sequences of gp85 gene within different ALV subtypes

▲，本試驗(yàn)分離株?！?， stains isolated in this study.圖6 分離株gp85基因與不同ALV亞群代表株核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Nucleotide phylogenetic tree of gp85 gene and representative strains of different ALV subpopulations

3 討論

21世紀(jì)初，自中國(guó)境內(nèi)首次于白羽雞體內(nèi)分離出J亞群的ALV，該病毒在2008—2009年對(duì)商業(yè)雞養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的損害[10]。隨著我國(guó)不同品種雞的飼養(yǎng)呈現(xiàn)規(guī)?；⒓s化發(fā)展，蛋雞、地方品種雞感染J亞群ALV的病例報(bào)道不斷增多[11]。王波等[12]通過檢測(cè)種蛋中禽白血病病毒得出皖南黃父母代肉種雞群存在的外源性ALV感染主要為ALV J；2009—2010年對(duì)中國(guó)部分地區(qū)進(jìn)口雞群禽白血病流行病學(xué)調(diào)查顯示，在進(jìn)口蛋雞品系和中國(guó)進(jìn)口祖代雞群中存在較高的ALV感染率，且J抗體陽性率普遍高于A/B抗體陽性率[13]。本試驗(yàn)亦是一例典型案例，從安徽地方品種分離鑒定出的一株J亞型ALV提示了亟需加強(qiáng)安徽地區(qū)J亞群ALV凈化工作。

ALV同一亞群的毒株gp85基因同源性較高，一般應(yīng)在90%左右，而與其他亞群的同源率只有40%左右[14-16]。因此，針對(duì)J亞群禽白血病原型株HPRS-103前病毒基因DNA gp85囊膜糖蛋白基因的一段序列作為引物，可用于檢測(cè)ALV J[17]。本試驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)成功從安徽地方品種雞的腫瘤中擴(kuò)增出長(zhǎng)928 bp的gp85基因，通過透射電鏡觀察可見有囊膜的病毒粒子，確診該雞場(chǎng)存在禽白血病。結(jié)合臨床剖檢及組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)該患病雞只肝臟、脾臟顯著腫大，表面均有腫瘤結(jié)節(jié)，HE染色后均可見大量或成灶性或彌漫性淋巴樣瘤細(xì)胞增殖并伴有出血現(xiàn)象，表明分離出的AHCH-2018株可以不同程度地侵害雞只各組織器官。

通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)AHCH-2018株gp85核苷酸序列與GenBank已發(fā)表的10株ALV J序列的核苷酸同源性為94.1%～99.5%，進(jìn)一步證實(shí)本試驗(yàn)分離到的AHCH-2018株屬于J亞群，同時(shí)也預(yù)示ALV的變異一直處于緩慢的演化中。近年來的研究推斷，中國(guó)的ALV可能最初來源于國(guó)外的進(jìn)口肉種雞，而后傳播到中國(guó)地方品種和進(jìn)口蛋種雞品種[18]。J亞型禽白血病在安徽地方品種的出現(xiàn)，說明J亞型禽白血病正在向中國(guó)地方品種雞群中傳播蔓延，這提示我們?cè)诩訌?qiáng)對(duì)西方引種祖代雞群中ALV監(jiān)測(cè)的同時(shí)，應(yīng)提高我國(guó)自繁自養(yǎng)的地方品系雞群ALV的系統(tǒng)凈化。本研究結(jié)果為了解安徽土雞種群中禽白血病的分子流行病學(xué)特點(diǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。