李戌清，張敬澤，張 雅，吳根良

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024； 2.浙江大學 農(nóng)業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 310058)

自1914年美國弗吉尼亞州首次發(fā)現(xiàn)棉花黃萎病以來，該病傳播到了世界各地，并成為了生產(chǎn)中發(fā)生普遍、造成損失嚴重、且防控難度較大的病害之一[1]。據(jù)報道，黃萎病病菌能侵染蔬菜、花卉、大田作物等逾200多種植物[2-3]，也有報道認為可侵染約660種植物[4]。我國黃萎病病菌于1935年隨引進美國棉種而傳入[5]。20世紀50年代初，我國東北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)茄子黃萎病發(fā)生危害[6]，后隨著茄果類蔬菜種植面積的擴大而迅速蔓延，發(fā)病范圍日益南擴[7]。茄田黃萎病流行后，發(fā)病率通常為40%～50%，嚴重時達70%以上，甚至絕收，不僅給茄農(nóng)增加了種植管理難度，而且造成了嚴重的經(jīng)濟損失[8]。目前，人們對茄子黃萎病的研究大多集中在病害田間危害癥狀觀測、病原菌種類鑒定、菌株致病力測定、菌株生物學特性研究、病害防控技術研究及茄子種質資源對黃萎病菌抗性鑒定等方面[9-11]。而對大麗輪枝菌的鑒定主要集中在棉花黃萎病上，而利用PCR特異性引物對病菌進行分子檢測，確定其屬于D致病型或ND致病型，極有利于病害的管理和防控決策的制定[12-13]。

就浙江省而言，隨著近年來茄子生產(chǎn)的基地化和規(guī)?；l(fā)展，田間輪作倒茬頻率減緩，土壤中病原菌積累增多，加之溫暖濕潤的氣候條件，使得黃萎病對茄子生產(chǎn)的危害逐年加重。2017年1月12日浙江省紹興市上虞區(qū)茄子專業(yè)合作社設施大棚中茄子黃萎病始發(fā)生(此時茄子處于首花開花結果期)，1月18日調查結果顯示田間茄子病株維管束變褐且植株萎蔫枯死，發(fā)病率在5.65%左右，且呈蔓延態(tài)勢。茄子黃萎病已成為制約當?shù)厍炎由a(chǎn)的重要因素和急需解決的問題。本文通過對茄子黃萎病病菌的致病型鑒定及其生物學特性的分析，初步探明病害發(fā)生流行的成因，為進一步研究病害的發(fā)生規(guī)律和病害防控策略提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2017年1月，在浙江省紹興市上虞區(qū)的溫室大棚內，采集具典型癥狀的茄子病株，帶回實驗室，用于病原菌的分離。

1.2 病原菌的分離和純化

采用常規(guī)組織分離培養(yǎng)方法對上述采集樣品進行病原菌分離[14]，然后進行單孢純化。采用菌餅加30%甘油的保藏方法，將單孢菌株保藏在-70 ℃低溫冰箱中。分離到的菌株通過形態(tài)學特征觀察、微菌核產(chǎn)生情況及分子序列特征的分析(數(shù)據(jù)未顯示)，被鑒定為大麗輪枝菌。本研究選用5個代表性菌株(VD-sy1、VD-sy2、VD-sy3、VD-sy4和VD-sy5)進行研究。其中1株非落葉型參考菌株BP2來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學研究院植物保護研究所棉花植株。

1.3 病原菌的培養(yǎng)和DNA的提取

選擇上述5個代表性菌株，接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)平板上進行活化，用直徑0.5 cm打孔器在菌落邊緣打取菌碟，后轉接到PDA培養(yǎng)基平板中，置于25 ℃、24 h黑暗條件下培養(yǎng)2周。在超凈工作臺中，刮取收集菌體，用液氮冷凍干燥，然后研磨成粉，后采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[15]。

1.4 特異性引物的合成和擴增

D致病型菌株和ND致病型菌株序列擴增所采用的特異性引物對分別為INTD2f(5′-ACT GGG TAT GGA TGG CTT TCA GGA CT-3′)和INTD2r(5′-TCT CGA CTA TTG GAA AAT CCA GCG AC-3′)[16]、INTND2f(5′-CTC TTC GTA CAT GGC CAT AGA TGT GC-3′)和INTND2r (5′-CAA TGA CAA TGT CCT GGG TGT GCC A-3′)[11，17]，分別可擴增出462 bp和824 bp片段。上述引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

用上述合成的引物對6個菌株的基因組DNA進行PCR擴增。其中，PCR擴增反應體系(50 μL)為：模板DNA 1 μL、10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL、2.5 mmol·L-1dNTP 1 μL、10 pmol·μL-1引物各2 μL、5 U·μL-1Taq酶0.3 μL、ddH2O 38.7 μL；PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min、30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 病原菌的生物學特性測定

1.5.1 溫度對菌株生長速率的影響

采用菌碟接種法，即用直徑為12 mm的打孔器，從預培養(yǎng)7 d的病原菌菌落邊緣打出菌碟，將菌碟接種于新的PDA平板中央，分別置于10、15、20、25、28、30、32、35 ℃生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每個處理3次重復，培養(yǎng)至第7天時采用直尺十字交叉法測量菌落生長直徑，至第14天時再測一次，進而計算菌絲日平均生長速率。

1.5.2 光照對菌株生長速率的影響

菌碟接種于PDA平板上，25 ℃下分別置于24 h光照、12 h光照/12 h黑暗、24 h黑暗培養(yǎng)，每個處理3次重復。菌落直徑的測量和生長速率的計算方法同1.5.1節(jié)。

1.5.3 pH對菌株生長速率的影響

菌碟接種于不同pH值(pH 4.0～9.0)的PDA平板上，置于25 ℃下培養(yǎng)，每個處理3次重復。菌落直徑的測量和生長速率的計算方法同1.5.1節(jié)。其中，將配制好的PDA培養(yǎng)基高壓滅菌，后在熱凝固前分別用0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH調節(jié)培養(yǎng)基pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0，倒平板，即得到不同pH值的PDA平板。

1.5.4 不同碳源對菌株生長速率的影響

以查氏培養(yǎng)基(KNO32.00 g，K2HPO41.00 g，KCl 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30.00 g，加水定容至1 L)為基礎培養(yǎng)基。以KNO3為氮源，以半乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、果糖、麥芽糖、葡萄糖、山梨醇、乙醇等量替換基礎培養(yǎng)基中的蔗糖，置于25 ℃下培養(yǎng)，測定各碳源對菌株生長的影響，每個處理3次重復。菌落直徑的測量和生長速率的計算方法同1.5.1節(jié)。

1.5.5 不同氮源對菌株生長速率的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基。以蔗糖為碳源，以甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酵母膏、硫酸銨、牛肉浸膏、胰蛋白胨、氯化銨等量替換基礎培養(yǎng)基中的KNO3，置于25 ℃下培養(yǎng)，測定各氮源對菌株生長的影響，每個處理3次重復。菌落直徑的測量和生長速率的計算方法同1.5.1節(jié)。

2 結果與分析

2.1 菌株致病型的檢測結果

用大麗輪枝菌落葉型特異性引物對INTD2f/INTD2r對6個黃萎菌(包括5個茄子黃萎病菌和1個棉花黃萎病菌)供試菌株進行PCR檢測，除菌株BP2外，均擴增到大小約460 bp的特異性片段。而用大麗輪枝菌非落葉型特異性引物對INTND2f/INTND2r對上述6個黃萎菌供試菌株進行PCR檢測，結果表明，僅菌株BP2擴增到一大小約820 bp的特異性片段(圖1)。即，分離自浙江省紹興市的5個菌株(VD-sy1、VD-sy2、VD-sy3、VD-sy4和VD-sy5)均被鑒定為落葉型。

2.2 病原菌的生物學特性

大麗輪枝菌VD-sy1在10～32 ℃均能生長，且在25 ℃菌落生長最快，日平均生長速率為4.31 mm·d-1，而在35 ℃菌落停止生長(圖2)。

菌株VD-sy1在不同光照條件下菌落的生長速率不同，在24 h黑暗條件下菌落生長略優(yōu)于12 h光照/12 h黑暗下，兩者間差異不顯著，但均顯著優(yōu)于24 h光照條件下。在連續(xù)光照的條件下，逐漸增加黑暗培養(yǎng)的時間可促進菌株VD-sy1菌落的生長(圖3)。

不同pH條件對菌株VD-sy1生長速率的影響不同，其中pH 4.0時菌落生長最慢，為2.34 mm·d-1，顯著低于pH 5.0～9.0。在試驗pH范圍內，隨著pH值的升高，菌落生長速率先急劇升高后緩慢下降，在pH 5.0時菌落生長最快，為4.71 mm·d-1(圖4)。

M，DNA marker D (100～2 000 bp)；泳道1-5，依次為落葉型特異性引物對INTD2f/INTD2r對菌株VD-sy1、VD-sy2、VD-sy3、VD-sy4和VD-sy5 PCR擴增所得條帶；泳道6，為非落葉型特異性引物對INTND2f/INTND2r對菌株BP2 PCR擴增所得條帶；泳道7，清水對照。M， DNA marker D (100-2 000 bp); Lanes 1-5， PCR products of isolates VD-sy1， VD-sy2， VD-sy3， VD-sy4， VD-sy5 amplified by INTD2f/INTD2r， respectively; Lane 6， PCR product of isolate BP2 amplified by INTND2f/INTND2; Lane 7， CK.圖1 落葉型和非落葉型特異性引物PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agrose gel electrophoresis of PCR products of defoliating and nondefoliating pathotype isolates obtained with the specific primer pairs

第7天和第14天分別進行差異顯著性分析。不同的小寫字母表示處理之間的差異顯著(P<0.05)。下同。Significant difference analysis was done based on date of seventh day and fourteenth day， respectively. The different lowercase letters meant significant difference at 0.05 level among treatments. The same as below.圖2 溫度對菌株VD-sy1菌落生長的影響Fig.2 Effect of temperature on mycelial growth of strain VD-sy1

圖3 光照條件對菌株VD-sy1菌落生長的影響Fig.3 Effect of photoperiod on mycelial growth of strain VD-sy1

圖4 pH對菌株VD-sy1菌落生長的影響Fig.4 Effect of pH of medium on mycelial growth of strain VD-sy1

菌株VD-sy1以蔗糖培養(yǎng)基上菌落生長最快，為4.25 mm·d-1，與乙醇和甘露醇培養(yǎng)基上菌落生長相當，顯著優(yōu)于果糖、麥芽糖和半乳糖(圖5)；以酵母膏培養(yǎng)基上菌落生長最快，為4.06 mm·d-1，其次為脯氨酸、胰蛋白胨、甘氨酸、谷氨酰胺，再次是硝酸鉀，均顯著優(yōu)于硫酸銨、牛肉浸膏和氯化銨(圖6)。

1，半乳糖；2，可溶性淀粉；3，甘露醇；4，果糖；5，麥芽糖；6，葡萄糖；7，山梨醇；8，乙醇；9，蔗糖。1， Galactose; 2， Starch; 3， Mannitol; 4， Fructose; 5， Maltose; 6， Glucose; 7， Sorbitol; 8， Ethanol; 9， Sucrose.圖5 不同碳源條件對菌株VD-sy1菌落生長的影響Fig.5 Effect of carbon sources on mycelial growth of strain VD-sy1

1，甘氨酸；2，谷氨酰胺；3，脯氨酸；4，酵母膏；5，硫酸銨；6，牛肉浸膏；7，胰蛋白胨；8，氯化銨；9，硝酸鉀。1， Glycine; 2， Glutamine; 3， Proline; 4， Yeast; 5， Ammonium chloride; 6， Beef extract; 7， Casein tryptone; 8， Ammonium chloride; 9， Potassium nitrate.圖6 不同氮源條件對菌株VD-sy1菌落生長的影響Fig.6 Effect of nitrogen sources on mycelial growth of strain VD-sy1

3 討論

目前，多數(shù)研究認為茄子黃萎病的病原菌為大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)[11，18-22]，但也有文獻報道為黑白輪枝菌(Verticilliumalbo-atrum)[23]。本研究中，將分離自浙江省紹興市茄子田黃萎病病株的病原菌鑒定為大麗輪枝菌(數(shù)據(jù)未顯示)，且利用大麗輪枝菌落葉型和非落葉型特異性引物對對病原菌菌株進行了PCR擴增，結果顯示，5個菌株均屬于落葉型。

大麗輪枝菌是土壤中常見的一種真菌，適應性極強。張輝[11]認為，茄子黃萎病病菌揚州菌株VD9-yz1和VD9-yz2在20～25 ℃生長較快，30 ℃略有生長，33 ℃生長停止；張武軍等[18]認為，四川雅安株系在10～30 ℃均可生長，且在22.5 ℃時生長最快；董國菊[24]認為山西晉中株系在5～30 ℃均可生長，適溫范圍為20～25 ℃，最適溫度為25 ℃，超過30 ℃則不能生長。本研究結果表明，大麗輪枝菌浙江紹興株系VD-sy1在10～32 ℃均能生長，在25 ℃菌落生長最快，而在35℃菌落停止生長，與上述研究的報道結果基本一致。張輝[11]研究表明，江蘇揚州株系pH適應范圍很廣，在pH 5.5和pH 8.0時菌絲仍能快速生長，且在pH 6.5～7.0時最好；張武軍等[18]認為，四川雅安株系的菌絲在pH 4.0～9.0均可生長，以pH 7.0時生長最快，pH 4.0～7.0范圍內菌落直徑隨pH增大逐漸增大，pH 7.0～9.0菌落直徑隨pH增大逐漸減?。欢瓏誟24]研究認為，山西晉中株系的pH適應范圍很廣，在pH 4.5～9.0均可生長，且以pH 6.0～7.0最佳，這與本研究結果略有出入，本研究的浙江紹興株系有較寬的酸堿度范圍，在pH 4.0～9.0均能較好生長，且在pH 5.0～9.0差異不顯著，但均顯著快于pH 4.0。張武軍等[18]報道四川雅安株系對碳源的利用以蔗糖較好，對氮源的利用以KNO3最好；董國菊[24]報道山西晉中株系在以蔗糖和乳糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長最好，而在氮源利用上，無論是硝態(tài)氮、氨態(tài)氮中菌絲均能生長，且以蛋白胨生長最好，而在本研究的浙江紹興株系則以蔗糖為碳源和以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長較快，在以半乳糖為碳源和以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基上生長較慢，這可能與菌株差異、菌株采集地理或生理性差異、所選擇的碳、氮源不同等有關。

目前，大麗輪枝菌引起的茄子黃萎病在世界各地均有發(fā)生，且曾在日本和美國大面積發(fā)生及流行，防治非常困難，造成的經(jīng)濟損失慘重[25-26]?，F(xiàn)有病害防控試驗表明，水旱輪作、與豆科或瓜類等旱旱輪作3年以上、土壤熱處理、嫁接、植株落葉前拔除病株等措施均可防控該病害[11，27]，而用石灰氮和稀硫酸調節(jié)土壤pH效果不明顯(pH 4.0以下發(fā)病減少，但亦明顯影響了茄苗生長，而pH 5.0～9.0對病害防控效果不大)[27]。本文通過對茄子黃萎病病菌溫度、光照、pH、碳源、氮源等生物學特性的分析，為進一步研究浙江省該類病害的發(fā)生規(guī)律和防控策略提供了參考依據(jù)。