林偉龍，李兆安，蔡金艷

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.爽樂健康科技(中國)有限公司，廣東 廣州 510006)

靈芝種類繁多，其中藥用價值最高是紫靈芝，赤靈芝次之?，F(xiàn)代分析研究顯示靈芝中主要活性成分有多糖類、生物堿、氨基酸、三萜類化合物以及微量元素等[1-2]。靈芝在我國應(yīng)用歷史悠久，近年來研究發(fā)現(xiàn)靈芝能延緩疲勞，抗氧化功效顯著[3]。本研究以赤靈芝為主要原料并與具有滋補(bǔ)功能的藥材打粉混合制成的營養(yǎng)粉為研究對象，通過運(yùn)動實驗以及氧化損傷模型來考察該營養(yǎng)粉的抗疲勞、抗氧化功效，為進(jìn)一步深入開發(fā)赤靈芝保健產(chǎn)品提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級昆明小鼠80只，體質(zhì)量15～18 g，購自廣東省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.2 藥物及試劑

復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉由爽樂健康科技(中國)有限公司提供，每100 g中含有：赤芝50 g，菟絲子2 g，枸杞子2 g，五味子2 g，黃精2 g，桑葚2 g，油菜花粉20 g及羊奶粉20 g，產(chǎn)品的化學(xué)及微生物測試結(jié)果均符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)；生理鹽水(上海信裕生物科技有限公司)；溴代苯油、肝素鈉(上海麥克林生化科技有限公司)；MDA含量試劑盒(批號：20170725)、GSH-Px活性試劑盒(批號：20170725)、SOD活性試劑盒(批號：20170725)、BCA蛋白含量試劑盒(批號：20170725)，南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

全波長掃描酶標(biāo)儀(Multiskan GO，美國賽默飛世爾公司)；JXFSTPRP-32勻漿儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)；H1650R離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)；Secura213電子天平(北京賽利多斯)。

1.4 樣品處理及溶液配制

稱取營養(yǎng)粉1 kg，加6 L去離子水，攪拌均勻，超聲60 ℃水浴浸提6 h，每次6 L去離子水相同條件下進(jìn)行浸提，反復(fù)浸提3次，浸提液體經(jīng)濃縮得稠浸膏490.1 g，密封冷藏備用。

1.5 方法

1.5.1 抗疲勞功效實驗

1.5.1.1 動物分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)抽取39只小鼠分為3組：正常對照組、營養(yǎng)粉低劑量組和營養(yǎng)粉高劑量組，每組13只。各組每日自由攝食飲水，每日灌胃1次，低、高劑量組灌胃劑量分別為3 g/(kg·d)、9 g/(kg·d)，正常對照組每日灌胃等量生理鹽水。連續(xù)灌胃30 d。

1.5.1.2 抗疲勞實驗方法 第30天給藥1 h后，進(jìn)行爬桿實驗。將小鼠置于光滑玻璃棒的頂端，從實驗開始到小鼠無力支撐從玻璃棒上掉落的時間記為小鼠的爬桿時間，實驗結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)。第31天給藥1 h后，對3組小鼠進(jìn)行用時1 h的游泳適應(yīng)性訓(xùn)練，淘汰不適應(yīng)游泳的小鼠，確定每組10只共30只小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳實驗，繼續(xù)飼養(yǎng)給藥。第37天給藥1 h后進(jìn)行。實驗操作參照胡遠(yuǎn)等[4]的報道，實驗前所有小鼠稱質(zhì)量，每只小鼠的尾巴根部卷上重量為其自身體質(zhì)量5%的鉛皮，置于水溫為(23±1) ℃，水深為30 cm的水桶中進(jìn)行游泳實驗，小鼠從開始游泳到力竭(小鼠沉入水下10 s仍不能沖上水面)的時間記為小鼠的負(fù)重游泳時間。

1.5.2 抗氧化功效實驗

1.5.2.1 動物分組 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)抽取40只小鼠分為4組：正常對照組、氧化模型組、營養(yǎng)粉低劑量組和營養(yǎng)粉高劑量組，每組10只。飼養(yǎng)條件及給藥方式和劑量同“1.5.1.1”，連續(xù)灌胃38 d。

1.5.2.2 實驗方法 第38天給藥1 h后，除正常對照組外，對其余3組小鼠進(jìn)行氧化損傷造模。造模操作參照蘇德奇等[5]的報道，所有小鼠禁食過夜，次日末次給藥后1 h，除正常對照組外均給予0.40 mg/kg溴代苯油，灌胃量0.2 mL/kg。22 h后稱重記錄，摘眼球取血并處死小鼠，迅速取肝臟，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈，濾紙吸干后稱重記錄。取0.15 g組織放入2 mL EP管中，用眼科剪剪碎后按m∶v=1∶9的比例加入冰生理鹽水1.35 mL，勻漿后離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液得到10%肝勻漿，按后續(xù)實驗需要分裝為4管，-20 ℃冰凍備用。

1.5.2.3 試劑盒操作 肝組織中蛋白濃度測定運(yùn)用BCA法測定，血漿和10%肝勻漿中的MDA含量、SOD活力和GSH-PX活力的測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉的抗疲勞作用

由表1可知，與正常對照組對比，營養(yǎng)粉高、低劑量組的爬桿時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，爬桿時間明顯延長，負(fù)重游泳時間均有延長，高劑量組的負(fù)重游泳時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉的抗氧化作用

2.2.1 復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉對肝勻漿中MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影響 由表2可知，與正常對照組對比，模型組小鼠的MDA含量和SOD活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而GSH-Px活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示溴代苯誘導(dǎo)氧化損傷造模成功；與模型組比較，低劑量組與高劑量組的MDA含量均有所減少，其中低劑量組的MDA含量比高劑量的要低，低劑量組MDA含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，低劑量組和高劑量組SOD和GSH-Px的活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2 復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉對血漿中MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性的影響 由表3可知，與正常對照組對比，模型組MDA含量、SOD活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，GSH-Px活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組MDA含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，且低劑量組MDA含量比高劑量組含量低；高、低劑量組的SOD活性和高劑量GSH-Px活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉對小鼠爬桿時間和負(fù)重游泳時間的影響Table 1 Effect of compound Ganoderma lucidum powder on the climbing time and swimming time in mice

與正常對照組比較：**P<0.01。

表2復(fù)方赤靈芝營養(yǎng)粉對氧化損傷小鼠肝勻漿MDA含量和SOD及GSH-Px活性的影響

與正常對照組比較：**P<0.01； 與模型組比較：△△P<0.01。

表3復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉對氧化損傷小鼠血漿MDA含量和SOD及GSH-Px活性的影響

組別劑量/(g·kg-1)nc(MDA)/(mmol·L-1)SOD/(U·mL-1)nGSH-Px/(U·mL-1)正常對照組-109.78±1.6699.62±16.969355.30±24.86模型組-1010.46±1.3999.71±27.517319.07±31.54?赤芝營養(yǎng)粉 低劑量組3107.64±0.71△△97.26±25.056310.14±36.58高劑量組9108.29±1.42△101.20±35.389328.49±20.64

與正常對照組比較：*P<0.05； 與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

疲勞在中醫(yī)學(xué)中解釋為“虛勞”，是生物體日?；顒雍螽a(chǎn)生的正?，F(xiàn)象，即運(yùn)動性疲勞。長期的運(yùn)動性疲勞可能會影響機(jī)體正常功能甚至產(chǎn)生損傷。從傳統(tǒng)中醫(yī)理論的角度看，復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉中赤芝、黃精、五味子補(bǔ)腎氣，養(yǎng)陰生津；菟絲子、枸杞子滋補(bǔ)肝腎；桑葚補(bǔ)血滋陰、生津潤燥；油菜花粉補(bǔ)腎固本；羊奶粉補(bǔ)腎虛、益精氣。前有學(xué)者[6-8]研究表明，菟絲子、黃精、五味子等對小鼠有明顯的抗疲勞作用。本研究結(jié)果也顯示復(fù)方赤芝營養(yǎng)粉能夠延長運(yùn)動時間，且呈劑量依賴性，說明該營養(yǎng)粉可增強(qiáng)小鼠體質(zhì)，延緩疲勞，增強(qiáng)體力。

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA會對細(xì)胞膜造成功能性損傷，導(dǎo)致機(jī)體衰老甚至引發(fā)疾病，其含量反映機(jī)體脂質(zhì)的過氧化水平。體內(nèi)重要的抗氧化酶如SOD和GSH-Px在保護(hù)機(jī)體清除過氧化產(chǎn)物和自由基的過程中發(fā)揮重要作用，抗氧化能力是反映機(jī)體抗衰老能力的重要指標(biāo)[9-10]。本實驗所采用的溴代苯氧化模型是保健食品功能評價常用的模型之一，溴代苯使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化從而引起肝細(xì)胞氧化損傷。以往的研究表明，赤靈芝多糖能夠提高免疫抑制小鼠的抗氧化能力，降低小鼠體內(nèi)MDA的含量[11-12]；五味子多糖能夠提高小鼠的SOD活性并且降低MDA含量[13]；黃精多糖對心肌肥厚大鼠具有很好的體內(nèi)抗氧化作用[14]。本研究結(jié)果中，營養(yǎng)粉低劑量組小鼠體內(nèi)MDA的含量對比模型組明顯下降，高劑量組小鼠體內(nèi)MDA含量雖有下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；SOD以及GSH-Px的活性對比模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明復(fù)方赤靈芝營養(yǎng)粉具有一定的抗氧化功效，且服用低劑量的復(fù)方赤靈芝營養(yǎng)粉更能有效地減少機(jī)體過氧化產(chǎn)物，但對于抗氧化酶活性的影響及機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。