帥方舟，陳靖文，林華慶

(廣東藥科大學藥學院/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006)

在眾多類型的抗菌劑中，有機硅季銨鹽{二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨，SQ5700}是一種綜合性能比較理想的抗菌劑濃縮液，可與任何比例的水、醇類、酮類、酯類烴類和氯化烴類相混溶，保存于甲醇溶劑中。該抗菌劑也是一類新型的陽離子表面活性劑，它對人體皮膚無刺激、無致癌作用，各項指標符合國內(nèi)外對抗菌劑的要求[1]。甲醇有一定的毒性，長期使用對人體有一定的損害，而且甲醇易燃，其運輸成本和危險性都很高。如果把有機硅季銨鹽以水作為溶劑保存，不但可以降低對人體的危害，而且還可以降低成本。但是，有機硅季銨鹽在水中會被水解，因其分子中含有三甲氧基硅基，在水中水解為硅羥基，容易縮聚為不溶于水的網(wǎng)狀聚硅氧烷，在4～8 h內(nèi)就會失去活性，故只能保存于有機溶劑中。本研究旨在尋找一種有效的方法，使得有機硅季銨鹽可以在水中保持穩(wěn)定[1-5]。

環(huán)糊精(β-CD)包合可以有效提高藥物穩(wěn)定性，在藥品領域中應用廣泛。羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)是經(jīng)過修飾的β-CD，通過對β-CD的羥丙基化，破壞分子內(nèi)氫鍵，顯著提高了水溶性，具有局部刺激性、不良反應輕微等諸多優(yōu)點[6-7]。

Box-Behnken試驗設計法是響應面設計法的一種，它可以提供3到10個因素，高、中、低三水平的實驗設計及分析，可以考察各個因素對效應(包封率)的影響以及各因素間的交互作用，也能進行各個因素的最優(yōu)化。該方法使用方便，比單因素考察更全面客觀，而且預測實驗結果接近實際實驗結果，因此被廣泛地用于藥學研究中[8-10]。本研究采用溶液-攪拌法制備了有機硅季銨鹽-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物(SQ5700-HP-β-CD包合物)，通過Box-Behnken試驗設計對影響包合物制備的因素進行優(yōu)化考察，篩選出最佳的制備工藝。

1 儀器與材料

ZK-82A真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；C-MAG HS 4磁力攪拌器(德國艾卡 RCT basic)；DSC4000差示掃描量熱儀(美國珀金埃爾默儀器有限公司)；Spectrum100傅里葉變換紅外光譜儀(美國珀金埃爾默儀器有限公司)；BS224S萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；有機硅季銨鹽(SQ5700，湖南利潔生物集團股份有限公司)；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD，淄博千匯生物有限公司)；丙酮(天津大茂化學試劑廠)；去離子水(廣州亞飛水處理設備有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 SQ-5700-HP-β-CD包合物的制備

為避免在制備包合物的過程中SQ5700與水接觸導致水解失活，選擇無水乙醇作為溶劑溶解SQ5700；在制備方法上，由于乙醇的冰點為-117.3 ℃，冷凍干燥法中凍干機無法使無水乙醇到達冰點升華，選用溶液-攪拌法制備包合物[11]：精密稱取一定量的HP-β-CD于燒杯中，用無水乙醇配制成飽和溶液，攪拌并溶解。在一定溫度、一定轉(zhuǎn)速下，加入一定量的SQ5700，攪拌一定時間后，真空干燥，得SQ5700-HP-β-CD包合物粗品，丙酮洗滌，真空干燥揮去丙酮，既得SQ5700-HP-β-CD包合物。

2.2 SQ5700質(zhì)量分數(shù)的測定

2.2.1 0.004 mol/L十二烷基硫酸鈉標準溶液的配制 精密稱取十二烷基硫酸鈉0.288 5 g(精確至0.000 1 g)，置于250 mL容量瓶中，加入去離子水至刻度定容，搖勻，備用。

2.2.2 混合指示劑的配制 精密稱取溴化乙啶(0.5±0.005)g，置于50 mL燒杯內(nèi)，再精密稱取酸性藍(0.25±0.005)g置于另一個50 mL燒杯中，用體積分數(shù)10%乙醇20～30 mL于40 ℃左右攪拌使溶解。精密移取2種溶液至同一個250 mL容量瓶內(nèi)，用體積分數(shù)10%乙醇沖洗燒杯，洗液并入容量瓶，加入去離子水至容量瓶刻度線定容，搖勻后即得儲備液，備用。精密移取20 mL儲備液于500 mL容量瓶中，加適量蒸餾水，再精密移取245 g/L H2SO4溶液20 mL，用去離子水定容至刻度，搖勻，避光貯存。

2.2.3 SQ-5700質(zhì)量分數(shù)的測定 根據(jù)文獻[12]以及中華人民共和國國家標準GBT 5174-2004《表面活性劑洗滌劑陽離子活性物含量的測定》，選用溴化乙啶-酸性藍滴定法測定SQ-5700的質(zhì)量分數(shù)：常溫下，精密稱取SQ5700-HP-β-CD包合物10 g，置于100 mL容量瓶中，加入適量去離子水超聲15 min進行溶解，冷卻至室溫，繼續(xù)加入去離子水稀釋至容量瓶刻度線。精密移取樣品溶液5 mL至100 mL具塞量筒中。分別加蒸餾水2 mL，三氯甲烷3 mL，混合指示劑溶液2 mL，混合均勻。用十二烷基硫酸鈉標準溶液滴定，標準溶液滴加后加塞劇烈振動，然后靜置分離，當接近終點時，搖動而形成的乳濁液極易破乳，繼續(xù)逐滴滴定并反復猛烈搖動，直至藍色褪去，三氯甲烷層為淺灰-粉紅色即達終點。準確記錄滴加標準溶液的體積，按以下公式計算SQ-5700的質(zhì)量分數(shù)：

式中：X為SQ-5700的質(zhì)量分數(shù)；V為滴定消耗的十二烷基硫酸鈉標準溶液的體積，mL；C為十二烷基硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；M為有機硅季銨鹽的分子量，M=496.28；m為稱取樣品的質(zhì)量，g。

2.2.4 專屬性考察 根據(jù)文獻[9]，按“2.1”項方法在相同條件下制備6組等量且不含SQ5700的包合物，用“2.2.3”項方法進行測定，6組滴定試驗均為陰性。另制備6組含有SQ5700的包合物，但不經(jīng)過丙酮洗滌，對比未經(jīng)包合的相同質(zhì)量的SQ5700，結果測得包合物中SQ5700的平均質(zhì)量分數(shù)與未經(jīng)包合的SQ5700的相差小于0.2%，說明HP-β-CD對測量結果無影響，即可對SQ-5700-HP-β-CD包合物以同樣方法測定SQ5700的質(zhì)量分數(shù)。

2.2.5 精密度試驗 精密稱取同一批SQ5700原料藥2 g，6份，分別用“2.2.3”項下方法進行測定，記錄消耗標準溶液的體積，結果測得消耗標準溶液的RSD數(shù)值為0.45%，小于2%，說明方法精密度良好。

2.3 包封率的測定

包封率按公式“包封率=m/M×100%”計算，其中m為包合物中SQ5700的質(zhì)量，M為總投入的SQ5700的質(zhì)量。

2.4 包合物的工藝優(yōu)化

2.4.1 單因素考察 根據(jù)相關文獻報道，并在預試驗的基礎上，在考察最佳包合工藝時，選取包合溫度、攪拌時間、壁芯比(HP-β-CD∶SQ-5700，質(zhì)量比，下同)和轉(zhuǎn)速為主要影響因素，并以包封率為指標進行單因素考察。

2.4.1.1 壁芯比對包合效果的影響 固定包合溫度為40 ℃，攪拌時間為40 min，轉(zhuǎn)速為500 r/min，以包合率為指標，考察壁芯比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1時的包合效果。結果顯示，壁芯比由1∶1升高到2∶1時，包封率從82.36%增加至89.82%，但隨著壁芯比的進一步升高，包封率有所下降并逐漸趨于穩(wěn)定，最后選用壁芯比為1∶1、2∶1、3∶1。

2.4.1.2 包合溫度對包合效果的影響 固定攪拌時間為40 min，壁芯比為2∶1，轉(zhuǎn)速為500 r/min，以包合率為指標，考察包合溫度分別為30、35、40、45、50 ℃時的包合效果。結果顯示，包合溫度由30 ℃升高到40 ℃時，包封率從81.44%增高到90.04%，但隨著溫度的升高，包封率有所下降并逐漸趨于穩(wěn)定，最后選用包合溫度為35、40、45 ℃。

2.4.1.3 攪拌時間對包合效果的影響 固定包合溫度為40 ℃，壁芯比為2∶1，轉(zhuǎn)速為500 r/min，以包合率為指標，考察攪拌時間分別為20、40、60、80、100 min時的包合效果。結果顯示，攪拌時間由20 min到40 min時，包封率從78.42%增高到89.94%，但從40 min之后包封率開始下降并趨于穩(wěn)定，最后選用包合時間為20、40、60 min。

2.4.1.4 轉(zhuǎn)速對包合效果的影響 固定包合溫度為40 ℃，攪拌時間為40 min，壁芯比為2∶1，以包合率為指標，考察轉(zhuǎn)速分別為100、300、500、700、900 r/min時的包合效果。結果顯示，包合物的包封率無明顯變化。

2.4.2 Box-Behnken響應面法優(yōu)化包合物制備工藝

2.4.2.1 Box-Behnken響應面設計方案及結果 根據(jù)單因素考察的基礎，選擇壁芯比、攪拌時間、反應溫度作為考察對象，以包封率(Y)作為評價指標對制備工藝進行優(yōu)化，根據(jù)Box-Behnken試驗的設計原理采用三因素三水平響應面法優(yōu)化SQ5700-HP-β-CD包合物的包合條件，采用Design expert 8.0.6軟件設計三因素三水平的響應面試驗，共17組實驗，包括5組中心點實驗，求取最優(yōu)的提取工藝參數(shù)，試驗設計方案和結果見表1。

表1 Box-Behnken設計與結果Table 1 Box-Behnken design and results

2.4.2.2 模型擬合 根據(jù)包合物包封率指標對影響因素進行二次多項式數(shù)學模型擬合結果：Y=-18.82+2.706 5A+0.680 8B+4.552 2C+0.198 8AB+0.079 5AC+0.012 9BC-1.402 3A2-0.000 294 31B2-0.051 7C2。由表2的方差分析可知，該數(shù)學模型P值小于0.000 1，說明該模型極其顯著。失擬項P值大于0.05，表明不顯著，即該數(shù)學模型在被分析的整個回歸趨于內(nèi)擬合較好。該方程的多元相關系數(shù)R2為0.987 1，進一步說明模型有較好的擬合度。因素A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2為顯著影響因素，說明對包合物包封率影響較大。因此，回歸方程可以較好地描述各個因素與響應值(包封率)之間的關系，可以利用該回歸方程找出HP-β-CD包合SQ5700的最優(yōu)條件。

2.4.2.3 影響因素的響應面曲線圖 根據(jù)Box-Behnken軟件繪制不同影響因素對于響應值的三維曲圖：分別固定3個影響因素其中之一，考察其他2個因素對包合物包封率影響的響應曲面圖，結果見圖1。圖1A顯示，當壁芯比較低時，包封率隨包合溫度的升高而增大，但隨壁芯比的增加，包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。同理，在包合溫度較低時，包封率隨壁芯比的增大而增大，但到達一定溫度后，包封率又開始下降。圖1B顯示從包合開始，包封率隨壁芯比增加而變大，但時間到達一定值后，包封率開始下降。原因可能是在壁芯比量較高時，分子運動受阻，阻礙了包合過程的進行。圖1C顯示不同包合溫度下，包封率隨時間的延長呈先增大后減小的趨勢；不同的攪拌時間的情況下，隨包合溫度的升高，包封率也是同樣的出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。

表2 方差分析結果Table 2 The Analysis of variance

2.4.2.4 最佳工藝驗證試驗 根據(jù)Box-Behnken響應面試驗設計結果，并結合包合物的制備工藝，得到優(yōu)化條件為：壁芯比2.38∶1，攪拌時間31.22 min，包合溫度41.94 ℃。為了方便實驗，把參數(shù)調(diào)整為壁芯比2.4∶1，攪拌時間31 min，包合溫度42 ℃。按照優(yōu)化后的工藝參數(shù)，制備3批樣品分別測定其包封率，結果得理論包封率為90.49%，實測包封率為93.66%，實測值與理論計算值偏差小于5%，模型選用合理有效。

2.5 包合物的檢測

2.5.1 差示掃描量熱法

分別稱量HP-β-CD、SQ5700與HP-β-CD物理混合物和SQ5700-HP-β-CD包合物樣品4.00～7.00 mg，置坩堝中進行壓片密封，分別進行測定，測定條件為：N2流速30 mL/min，以10 ℃/min的升溫速率在30～300 ℃條件下測定樣品的熱性質(zhì)[13-15]，結果見圖2。

A.壁芯比和包合溫度對包封率的影響； B.壁芯比和攪拌時間對包封率的影響； C.攪拌時間和包合溫度對包封率的影響。

圖1各因素交互作用的響應面圖
Figure1Responsive Surface and contours of the interaction of each factors

圖2HP-β-CD、SQ5700、SQ5700與HP-β-CD物理混合物及SQ5700-HP-β-CD包合物的DSC圖譜

Figure2DSC spectra of HP-β-CD,SQ5700,HP-β-CD/SQ5700 mixture and HP-β-CD/SQ5700 inclusion complex

可見，SQ5700在210 ℃左右有吸熱峰；而HP-β-CD屬于無定型粉末，在50～110 ℃有吸熱峰，可能是由于HP-β-CD脫水引起的，而HP-β-CD物理混合物的圖譜，出現(xiàn)了HP-β-CD與SQ5700吸熱峰的簡單疊加，在250～300 ℃間出現(xiàn)了多個峰，可能是因為物理混合物中存在著兩者之間的物理相互作用的影響，說明物理混合物并不起包合作用。SQ5700-HP-β-CD包合物的圖譜表明在實驗溫度范圍內(nèi)沒有任何尖銳峰出現(xiàn)，所有的吸熱峰消失，證實了包合物的形成。

2.5.2 紅外光譜法

分別稱量HP-β-CD、SQ-5700與HP-β-CD物理混合物和SQ5700-HP-β-CD包合物樣品適量，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描，用KBr壓片繪制紅外光譜圖[16-17]，結果見圖3。

可見，SQ5700在779 cm-1附近有Si-O-C鍵的彎曲振動，在1 115 cm-1附近處有Si-O鍵的伸縮振動峰，在2 921、2 851 cm-1處為CH3和CH2的伸縮振動峰等，HP-β-CD的紅外光譜都顯示糖類的特征吸收峰，1 652 cm-1附近為O-H彎曲振動峰，2 926 cm-1為C-H 伸縮振動，708 cm-1為O-H彎曲振動等，949、854、757 cm-1左右存在葡萄糖環(huán)的特征吸收。SQ5700-HP-β-CD物理混合物的紅外光譜可以視為二者紅外的物理疊加。包合物的紅外圖譜與HP-β-CD類似，SQ-5700的1 115、2 921、2 851 cm-1吸收峰減弱，HP-β-CD的1 652 cm-1位置的吸收峰消失，因為SQ5700借助氫鍵等次級鍵作用包入HP-β-CD空腔中，受其約束，SQ5700相關基團振動消失、減弱，這也從間接驗證了包合物的形成。

圖3SQ5700(A)、HP-β-CD(B)、SQ5700與HP-β-CD物理混合物(C)及SQ5700-HP-β-CD包合物(D)的紅外圖譜

Figure3FTIR of SQ5700(A),HP-β-CD(B),HP-β-CD/SQ5700 mixture(C) and SQ5700-HP-β-CD inclusion complex(D)

2.6 包合物的水溶液穩(wěn)定性考察

精密稱取SQ5700-HP-β-CD包合物10 g，置于100 mL容量瓶中，加入去離子水適量進行超聲溶解，超聲30 min后，取出冷卻至室溫，繼續(xù)加入去離子水稀釋至刻度線進行定容。分別于1、4、7 d按“2.2”項方法測定其中SQ5700質(zhì)量分數(shù)的變化，重復測定3次，取平均值。結果發(fā)現(xiàn)，第1 d到第7 d，SQ5700平均質(zhì)量分數(shù)下降了0.39%，表明通過HP-β-CD的包合可提高SQ5700在水中的穩(wěn)定性。

3 討論

SQ5700可與任何比例的水、醇類、酮類、酯類烴類和氯化烴類相混溶，但它在水中容易被水解。本研究曾考察了SQ5700在水、無水乙醇、丙酮的穩(wěn)定性，結果顯示，在室溫放置第7 d后，SQ5700的平均質(zhì)量分數(shù)分別下降了5.40%、0.26%、0.43%，表明SQ5700在水中不穩(wěn)定，而在無水乙醇和丙酮中穩(wěn)定性良好；另外，SQ-5700可以與丙酮以任意比例互溶，制備的包合物對丙酮的溶解度小，丙酮可以洗脫游離未包封的SQ-5700。因此，本研究采用無水乙醇作為溶劑、丙酮作為洗滌溶劑制備包合物。

HP-β-CD具有內(nèi)疏水外親水的性質(zhì)，本研究中SQ5700為親水性藥物，但其結構中含有長鏈的烴基這類疏水基團，可通過包合手段進入到環(huán)糊精的內(nèi)部，又因為其化學結構的[R-Si-(OCH3)3]三甲氧基硅具有硅烷的特性，甲氧基(—OCH3)易發(fā)生脫甲醇反應(CH3OH)，而形成硅醇基[R-Si-(OH)3]，其多個羥基可與HP-β-CD空穴開口處的羥基形成分子間氫鍵，使SQ5700和HP-β-CD復合在一起，形成包合物，因此 DSC和紅外光譜在包合物中檢測不到SQ5700的特征峰。

本研究通過Box-Behnken響應面法優(yōu)化SQ5700-HP-β-CD包合物的制備工藝，結果表明，經(jīng)過工藝參數(shù)優(yōu)化后，理論預測的包合物包封率與實測值偏差在5%以內(nèi)，證明其相關性良好。

對載藥包合物穩(wěn)定性考察結果表明，原料藥的質(zhì)量分數(shù)下降5.4%，而包合物的下降0.5%以內(nèi)，證明包合物可以顯著提高藥物穩(wěn)定性。包合物的鑒別方法可以采用多種方法，本文采用DSC法和FTIR法鑒別包合物的形成，對于包合物的理化性質(zhì)將在后續(xù)的工作中進行進一步的研究。