陳亮，周沫希，嚴(yán)雅麗，張英

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程研究中心，杭州 310058)

傳統(tǒng)的“竹鹽”是將粗的海鹽(又稱原鹽)放入新鮮的楠竹筒中，在800～1300 ℃的高溫下反復(fù)烤制而成，著名的“紫竹鹽”就是通過(guò)9次循環(huán)填充、烤制得到的，故又稱九烤竹鹽，以韓國(guó)產(chǎn)的“仁山紫竹鹽”最為有名[1,2]。已有研究表明，竹鹽具有保護(hù)胃腸道[3]、減輕肝腎負(fù)擔(dān)[4]、抑菌消炎[5,6]、護(hù)膚養(yǎng)顏等功效[7,8]。筆者科研團(tuán)隊(duì)前期的研究工作也已證明，紫竹鹽能夠防止血液酸化，對(duì)慢性代謝性酸中毒大鼠的腎臟疾病具有良好的防護(hù)效果。

本文所涉及的“植物功能鹽”是筆者科研團(tuán)隊(duì)近年來(lái)發(fā)明的新產(chǎn)品，是將原鹽與不同的植物提取物適量混合后，采用特殊的高溫熔煉技術(shù)得到的不同色澤的功能性鹽，如紫色的竹鹽、粉色的松鹽和綠色的梅鹽，即是由竹、松、梅等植物提取物與原鹽在高溫下共融后重結(jié)晶而成。調(diào)整植物提取物的種類及其與原鹽的比例關(guān)系、烤制的溫度和時(shí)間、不同溫度下的保溫時(shí)間及其升降溫速率等工藝參數(shù)，即可獲得不同形態(tài)、不同風(fēng)味和不同功能的植物鹽系列產(chǎn)品[9]。

眾所周知，肝臟是人體最大的代謝和解毒器官，因而也是最容易遭受毒物攻擊的靶標(biāo)[10]。近年來(lái)，急性肝損傷的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，藥物濫用約占臨床急性肝損傷發(fā)病率的50%[11,12]，占非病毒性慢性肝炎患者的20%～50%[13,14]，占爆發(fā)性肝功能衰竭患者的15%～30%[15]；急性肝損傷更易對(duì)兒童造成永久性傷害，臨床上約有20%的肝功能衰竭者為兒童[16]。當(dāng)前，治療化學(xué)性肝損傷的主要藥物有肌醇、肝泰樂(lè)、聯(lián)苯雙酯等。其中，聯(lián)苯雙酯(Bifendatatum)是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷的常用藥物，認(rèn)為能保護(hù)肝細(xì)胞、增加肝臟解毒功能，尤其是能顯著抑制轉(zhuǎn)氨酶活性的升高，且毒性低，副作用小。

本文擬采用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的急性小鼠肝損傷模型，以仁山紫竹鹽為陽(yáng)性食物對(duì)照、聯(lián)苯雙酯為陽(yáng)性藥物對(duì)照，評(píng)價(jià)3種植物鹽(竹鹽、松鹽和梅鹽)對(duì)小鼠急性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用，以期為這種新型植物功能鹽在食品、健康、醫(yī)療、保健領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原材料與儀器設(shè)備

原鹽(日曬海鹽)來(lái)自山東濰坊，實(shí)測(cè)NaCl含量為93.36%。3種植物功能鹽：竹鹽(外觀藍(lán)紫色，NaCl含量為88.83%)、松鹽(粉紅色，NaCl含量為90.32%)和梅鹽(亮綠色，NaCl含量為91.74%)均由筆者實(shí)驗(yàn)室自制，即將原鹽與不同比例的竹鹽、松鹽、梅鹽提取物混合均勻后，在800～1400 ℃的高溫下熔煉而成；仁山紫竹鹽為市售產(chǎn)品，韓國(guó)Insan竹鹽有限公司出品；聯(lián)苯雙酯滴丸，北京協(xié)和藥廠生產(chǎn)；化學(xué)純NaCl，Sigma產(chǎn)品。

5周齡雄性C57BL/6小鼠，平均體質(zhì)量為(16.0±2.0) g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，由上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站鑒定，合格證號(hào)為SCXK(滬) 2017-0005。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理認(rèn)證編號(hào)為10319#(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。小鼠常規(guī)飼料(含2%食鹽)由南通特洛菲飼料科技有限公司提供，同時(shí)委托其專門加工了無(wú)鹽基礎(chǔ)飼料。

丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒(羥胺法)、還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒(微板法)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒(比色法)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

全自動(dòng)生化檢測(cè)儀 日本Hitachi儀器公司；Thermo Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；CKX41顯微鏡 日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取5周齡的SPF級(jí)C57BL/6健康雄性小鼠45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成9組，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及劑量配制見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物試驗(yàn)分組及給藥劑量Table 1 Grouping and dosing of animal test

注：為了確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比性，正常對(duì)照組分別設(shè)置了含2%食鹽的常規(guī)飼料組(1#)和灌胃等質(zhì)量的純NaCl水溶液、同時(shí)攝食無(wú)鹽飼料的對(duì)照組(2#)。

除正常對(duì)照組(1#)采用常規(guī)飼料外，其余8組均使用無(wú)鹽基礎(chǔ)飼料。給藥階段，根據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的每人每日食鹽攝入量5 g及標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物等效劑量折算法得出小鼠的口服劑量[17]，每日灌胃1次，連續(xù)21天。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，相對(duì)濕度為50%～70%。

1.2.2 急性肝損傷動(dòng)物造模

末次給藥1 h后，模型對(duì)照組和試驗(yàn)組(3#～9#)小鼠均腹腔注射0.1% 的CCl4橄欖油溶液，CCl4劑量為10 mL/kg·bw，正常對(duì)照組(1#～2#)給予等體積的橄欖油，禁食過(guò)夜[18]。

1.2.3 試樣采集及生化指標(biāo)測(cè)定

在注射CCl4橄欖油溶液16 h后，脊椎脫臼處死小鼠，立刻摘眼球取血，同時(shí)解剖小鼠取肝臟。

血液樣本，經(jīng)3500 r/min離心10 min后，吸取上層血清用于血生化指標(biāo)測(cè)定。取出完整肝臟后，剪取0.4 g肝臟組織1份，放入裝有PBS(pH為7.4)的凍存管中勻漿，其余肝臟組織放入凍存管中，于-80 ℃冰箱中保存留用。將剪取的0.4 g肝臟勻漿后置于超低溫離心機(jī)中離心(4000 r/min、20 min)，取上清液，測(cè)定其丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)的活性(考馬斯亮藍(lán)法)[19]。

1.2.4 肝組織的病理觀察

取各組試驗(yàn)鼠相同部位的肝組織，冷生理鹽水沖洗干凈后用中性福爾馬林固定，制作4 μm的石蠟切片，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(x±s)表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)；組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(ANOVA)中的Duncan檢驗(yàn)分析顯著性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物功能鹽對(duì)試驗(yàn)小鼠體重的影響

在為期21天的試驗(yàn)周期內(nèi)，各試驗(yàn)組小鼠的體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，均未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05)；同時(shí)觀察到各組小鼠皮毛光滑，臨床活動(dòng)表現(xiàn)均正常，健康狀況良好。試驗(yàn)周期中不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)采集的各組試驗(yàn)小鼠的體質(zhì)量情況見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)周期中各試驗(yàn)組小鼠的體質(zhì)量比較Table 2 Comparison of body weights of mice in each experimental group during the experiment period

注：同一列兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(P<0.05)。

2.2 植物功能鹽對(duì)化學(xué)性肝損傷小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

表3 各試驗(yàn)組小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的比較Table 3 Comparison of activities of ALT and AST in serum of mice in each experimental group

注：同一列兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(P<0.05)；模型對(duì)照組(3#)與NaCl對(duì)照組(2#)相比，“#”表示P<0.01；各試驗(yàn)組(4#～9#)與模型對(duì)照組(3#)相比，“*”表示P<0.01。

由表3可知，模型組(3#)小鼠血清谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性均極顯著地高于正常對(duì)照組(2#和1#)(P<0.01)，表明造模成功。3種植物功能鹽均表現(xiàn)出不同程度的降低血清轉(zhuǎn)氨酶的活性，而原鹽幾乎無(wú)作用。與模型組相比，3種植物功能鹽抑制ALT活性升高的作用極其顯著(P<0.01)；在抑制AST活性升高上，3種植物功能鹽也有極顯著(P<0.01)的作用，表明竹鹽、松鹽和梅鹽具有一定的保肝護(hù)肝功效。松鹽對(duì)CCl4所致的急性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶急劇升高的抑制作用優(yōu)于竹鹽和梅鹽。然而，陽(yáng)性藥物對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯)雖然具有最強(qiáng)的抑制ALT活性的功效，但卻對(duì)AST無(wú)作用。市售的仁山紫竹鹽也和原鹽一樣，未表現(xiàn)出對(duì)急性化學(xué)性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的抑制作用。

2.3 植物功能鹽對(duì)化學(xué)性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

試驗(yàn)動(dòng)物受到化學(xué)毒物攻擊時(shí)，急性肝損傷的一個(gè)重要表征是強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，即，伴隨著肝臟組織中脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致的MDA含量升高、GSH水平降低、SOD活力下降等。由表4可知，同樣攝入無(wú)鹽飼料，并同時(shí)灌胃4%純NaCl的兩組(2#和3#)用CCl4造模以后，各項(xiàng)氧化應(yīng)激指標(biāo)都發(fā)生了顯著變化，尤其是GSH和MDA水平的改變極其顯著(P<0.01)，表明灌胃CCl4后動(dòng)物的肝臟受到了氧化損傷。

表4 各試驗(yàn)組小鼠肝臟組織的抗氧化活性比較Table 4 Comparison of antioxidant activity in liver tissue of mice in each experimental group

注：同一列兩兩之間若字母完全不同，則兩者之間存在顯著差異(P<0.05)；模型對(duì)照組(3#)與NaCl對(duì)照組(2#)相比，“#”表示P<0.01；各試驗(yàn)組(4#～9#)與模型對(duì)照組(3#)相比，“*”表示P<0.01。

由表4可知，3種植物功能鹽均可一定程度地升高，受損肝臟的GSH含量，其中梅鹽表現(xiàn)出極顯著(P<0.01)的提升作用；且均能降低受損肝臟的MDA含量，其中作用最強(qiáng)的是梅鹽(P<0.01)，其次是仁山紫竹鹽和松鹽(P<0.05)；聯(lián)苯雙酯組也表現(xiàn)出升高GSH和降低MDA含量的作用，但效果均不如梅鹽。在提升受損肝臟內(nèi)源性抗氧化酶活性方面，3種植物功能鹽均表現(xiàn)出一定作用，其中竹鹽表現(xiàn)出對(duì)T-SOD活性的顯著提升作用(P<0.05)。

2.4 試驗(yàn)動(dòng)物肝臟損傷及其修復(fù)的組織病理學(xué)觀察

各組小鼠肝組織病理切片的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

1#和2#是正常小鼠的肝組織，可見(jiàn)肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核型正常，無(wú)明顯異常；3#NaCl模型組的肝細(xì)胞索排列紊亂，細(xì)胞核型發(fā)生明顯變化，中央靜脈中有大量細(xì)胞浸潤(rùn)；4#聯(lián)苯雙酯組的肝細(xì)胞索排列較清晰，細(xì)胞核型正常，有少量空泡變性，表明聯(lián)苯雙酯滴丸對(duì)急性肝損傷有治療作用；5#仁山紫竹鹽組的肝細(xì)胞索排列較清晰，細(xì)胞核型正常，有少量空泡變性和水樣變性；6#原鹽對(duì)照組的肝細(xì)胞索排列不整齊，細(xì)胞核型發(fā)生明顯變化，中央靜脈中有大量細(xì)胞浸潤(rùn)；7#竹鹽試驗(yàn)組的肝細(xì)胞索排列較清晰，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核型正常，有少量空泡變性；8#梅鹽試驗(yàn)組的肝細(xì)胞索排列清晰，細(xì)胞核型正常，有少量空泡變性；9#松鹽試驗(yàn)組的肝細(xì)胞索排列較清晰，細(xì)胞核型正常，有少量空泡變性，中央靜脈中有少許細(xì)胞浸潤(rùn)。根據(jù)肝臟組織病理切片的形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果，可見(jiàn)竹鹽、松鹽、梅鹽均對(duì)CCl4所致的小鼠急性肝損傷有一定的防護(hù)作用。

圖1 植物功能鹽對(duì)試驗(yàn)小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響(×400)Fig.1 Effect of plant functional salts on liver histopathology in experimental mice(×400)

注：1#為常規(guī)飼料對(duì)照組；2#為NaCl對(duì)照組；3#為NaCl模型組；4#為聯(lián)苯雙酯組；5#為仁山紫竹鹽組；6#為原鹽對(duì)照組；7#為竹鹽試驗(yàn)組；8#為梅鹽試驗(yàn)組；9#為松鹽試驗(yàn)組。

3 討論

我國(guó)是世界肝病大國(guó)，預(yù)測(cè)到2020年，慢性肝病人數(shù)將達(dá)4.5億。肝病高發(fā)的國(guó)情在很大程度上與食物來(lái)源、飲用水、飲食習(xí)慣和餐飲方式等有關(guān)。我國(guó)居民的食用鹽主要來(lái)自海鹽，日曬海鹽(原鹽)即海水的濃縮物，海洋中所有的污染物都有可能留存其中，帶來(lái)一定的食品安全隱患。本研究結(jié)果顯示，攝入原鹽的試驗(yàn)小鼠(6#)肝臟中GSH水平極顯著地(P<0.01)低于攝入同等劑量純NaCl的組(2#)，(871.63±4.67)～(919.71±32.44) nmol/g prot，表明原鹽中的確可能存在一些對(duì)肝臟不利的危害因素，引起了肝臟的氧化應(yīng)激。與此同時(shí)，3種植物功能鹽均可顯著抑制ALT(P<0.01)和AST(P<0.05)的活性升高，而原鹽卻無(wú)作用。

在本研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，為了排除小鼠日糧中食鹽的干擾，專門定制了無(wú)鹽的基礎(chǔ)飼料用于2#～9#小鼠喂養(yǎng), 除聯(lián)苯雙酯的陽(yáng)性藥物對(duì)照組外，各試驗(yàn)組的食鹽攝入量均為800 mg/kg·bw·d左右。在為期21 天的干預(yù)試驗(yàn)后，最終結(jié)果顯示，仁山紫竹鹽(5#)與原鹽(6#)對(duì)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性無(wú)明顯影響，說(shuō)明采用傳統(tǒng)方法烤制的竹鹽從竹筒中吸收到的有效成分是有限的。然而，2013年有文獻(xiàn)報(bào)道[20]，傳統(tǒng)方法烤制的竹鹽可以抑制CCl4誘導(dǎo)的SD大鼠急性肝損傷，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用常規(guī)含鹽飼料作為大鼠(7周齡)日糧，并在此基礎(chǔ)上灌胃400 mg/kg·bw·d的試樣精鹽、原鹽、一烤竹鹽和九烤竹鹽(即紫竹鹽)，連續(xù)灌胃14 天，結(jié)果表明竹鹽可顯著降低SD大鼠血清中的ALT和AST水平(P<0.05)，且九烤的效果優(yōu)于一烤，與此同時(shí)原鹽對(duì)照組也表現(xiàn)出了一定的活性。導(dǎo)致本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道不符的原因可能是多方面的，譬如：原鹽來(lái)自不同的海域，其附帶的成分具有顯著差異；試驗(yàn)劑量的不同，文獻(xiàn)[21]并未排除日糧中食鹽的干擾，常規(guī)日糧以2.0 %的含鹽量計(jì)，大鼠通過(guò)日糧攝入的食鹽約為1000 mg/kg·bw·d，再加上400 mg/kg·bw·d的試驗(yàn)鹽，其總攝入量為1400 mg/kg·bw·d，遠(yuǎn)高于本研究的試驗(yàn)劑量(約800 mg/kg·bw·d)；采用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的竹鹽難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，故不同來(lái)源的竹鹽樣品可能存在顯著差異。

筆者認(rèn)為，植物功能鹽的保肝護(hù)肝作用主要源自兩個(gè)方面：一是與原鹽共融的植物提取物，二是高溫熔煉的過(guò)程。對(duì)于植物功能鹽來(lái)說(shuō)，雖然所添加的某種植物化學(xué)素(或植物提取物)原型物具有保肝護(hù)肝的作用，但經(jīng)過(guò)800～1300 ℃的高溫熔煉，其中的有機(jī)質(zhì)應(yīng)已完全失去，可能僅是剩余的無(wú)機(jī)物與原鹽發(fā)生了反應(yīng)，從而使得食鹽的晶體結(jié)構(gòu)、理化特性等隨之發(fā)生改變, 進(jìn)而影響其生物學(xué)功效。如陳湄沁測(cè)得5%的竹鹽水溶液的pH值為10.98，而同等濃度的原鹽水溶液為5.99；同時(shí)竹鹽較原鹽含有更多的鉀、鈣、鈉、鎂、銅、鋅和鐵等元素；并由此通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了竹鹽對(duì)慢性酸中毒以及胃腸道癌癥的作用。文獻(xiàn)[21]測(cè)得10%的竹鹽水溶液的pH達(dá)11.04，且比原鹽和精制鹽含更多的鉀、鈣、鎂和錳元素；同時(shí)竹鹽還表現(xiàn)出更高的電位還原能力，含有更多的羥基，有更好地清除自由基的能力。以上文獻(xiàn)中提到的竹鹽理化特性的變化均引起了生物學(xué)效應(yīng)的改變，而對(duì)于晶體結(jié)構(gòu)與生物學(xué)效應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)，還有待進(jìn)一步的研究，文獻(xiàn)[22]表明食鹽的顏色與NaCl晶格的著色中心有關(guān)?？傊?，鑒于食鹽與人類健康之間的高度關(guān)聯(lián)性，這是一個(gè)亟待進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究和探索的領(lǐng)域。