楊全略 陳榮鳳 梁冰玉 林兆森 勞飛翔 梁 浩 葉 力

(1 廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院、廣西醫(yī)科大學生命科學研究院、廣西艾滋病防治研究重點實驗室，南寧市 530021，電子郵箱：541887640@qq.com；2 廣西欽州市疾病預防控制中心，欽州市 535000)

自2010年實施防治AIDS攻堅工程以來，廣西地區(qū)AIDS的防治工作初見成效，實現(xiàn)了國家“十二五”的“降兩率”，即降低艾滋病每年的新發(fā)現(xiàn)報告率和當年的病死率的目標，因此人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)的傳播得到了控制[1]。隨著HIV-1分子流行病學研究的成熟，以及基于兩條序列間基因距離的分子傳播網(wǎng)絡分析方法的出現(xiàn)，宏觀感染者的社會網(wǎng)絡能夠盡可能地被還原，有關艾滋病傳播特征的研究也變得更加高效和可視化。欽州市地處廣西南部，北部灣經(jīng)濟區(qū)的中心位置，是廣西艾滋病疫情較為嚴重的地區(qū)之一[2]。為更好地了解欽州市AIDS的傳播特征，本研究以2014～2015年欽州市新發(fā)現(xiàn)的未治療HIV/AIDS人群為研究對象，結合人口學信息、測序、系統(tǒng)進化分析及分子傳播網(wǎng)絡等分子流行病學和生物信息學等方法，從流行病學及分子水平，分析該地區(qū)艾滋病的人口學特點、流行重組亞型、分子傳播網(wǎng)絡入網(wǎng)率及各分子傳播網(wǎng)絡之間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2014～2015年在欽州市各縣區(qū)疾病預防控制機構以短信、電話、同伴推薦等方式招募新報告的355例HIV感染者或AIDS患者，均經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實驗初篩及蛋白免疫印跡法確證HIV陽性，均未接受抗病毒治療，均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 流行病學問卷調(diào)查：采用面對面調(diào)查方法，由經(jīng)統(tǒng)一培訓的調(diào)查員以匿名調(diào)查的方式，收集研究對象的一般人口學特征、行為學特征及CD4+細胞計數(shù)等信息。

1.2.2 HIV-1 RNA的提取、巢式PCR擴增及測序：抽取所有研究對象外周靜脈血10 mL，使用核酸提取試劑盒(天隆公司，批號：E0118020181)提取HIV-1的病毒RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，批號：AI20777A)逆轉(zhuǎn)錄RNA后，應用Premix Ex Taq試劑(Takara公司，批號：AI20808A)在梯度PCR儀(德國Biometra公司，型號：T196)上對HIV-1 HXB2株的pol基因(>1 000 bp)進行巢式PCR擴增，包括整個蛋白酶編碼區(qū)和部分逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)。采用Sanger法對擴增后的DNA序列進行直接雙向測序。使用序列分析軟件Sequencer 5.1清理序列，使用BioEdit和HIV數(shù)據(jù)庫在線軟件Gene Cutter(http://www.hiv.lanl.gov/content/index)對序列進行對齊和編輯。

1.2.3 HIV-1流行重組亞型分析：將編輯好的HIV-1序列提交至HIV數(shù)據(jù)庫(http://www.hiv.lanl.gov)與參考株進行比對；同時使用MEGA v6.0軟件，選擇Kimura 2參數(shù)模型(Bootstrap=1 000)構建鄰接法系統(tǒng)進化樹，校驗值≥70%。根據(jù)HIV數(shù)據(jù)庫在線比對結果及下載的序列，用鄰接法系統(tǒng)進化樹確定序列亞型，其中以A1亞型(3條)、A2亞型(3條)、CRF02_AG亞型(2條)、B亞型(3條)、BC亞型(1條)、C亞型(3條)、D亞型(2條)、F1亞型(2條)、F2亞型(2條)、G亞型(3條)、H亞型(2條)、J亞型(2條)、K亞型(2條)、CRF01_AE亞型(25條)、CRF07_BC亞型(13條)及CRF08_BC亞型(6條)作為參考序列。

1.2.4 HIV-1分子傳播網(wǎng)絡分析：應用HyPhy 2.2.4軟件，選擇TN93模型計算基因距離，利用Cytoscape v3.6.1軟件根據(jù)最適基因距離(即當傳播簇最多且納入的樣本量最大時的基因閾值)構建分子傳播網(wǎng)絡，以識別潛在的傳播伙伴。其中度(degree)即關聯(lián)程度，表示分子傳播網(wǎng)絡中某節(jié)點(node)與其他節(jié)點通過邊(edge)連接的數(shù)目；入網(wǎng)率即進入分子傳播網(wǎng)絡的人數(shù)占總?cè)藬?shù)的百分比[3-4]。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用EpiData 3.1錄入問卷，采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)(構成比)表示；采用χ2檢驗進行兩分類變量間關聯(lián)分析；采用單因素Logistic回歸模型分析分子傳播網(wǎng)絡入網(wǎng)率的影響因素。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 研究對象的HIV-1 HXB2株pol基因擴增情況及人口學特征 成功擴增pol區(qū)序列的樣本共264例。以男性為主，年齡9～89歲，平均42.96歲，25～50歲人群構成比最大；以漢族人群為主，主要職業(yè)為農(nóng)民；傳播途徑以異性性傳播為主，其次為注射吸毒傳播；平均CD4+細胞計數(shù)為332(198.25，509.75)個/μL。見表1。

表1 成功擴增出pol區(qū)的研究對象的人口學特征

2.2 HIV-1亞型分布及其傳播途徑 納入研究的HIV-1亞型以CRF08_BC(52.27%)為主，其次為CRF01_AE(39.77%)，再次為CRF07_BC(6.06%)，此外B亞型、BC亞型、G亞型各有1例，2例為未知重組亞型(URF)，見圖1。 CRF01_AE亞型的主要傳播途徑為異性性傳播，CRF07_BC和CRF08_BC亞型主要為異性性傳播和注射吸毒傳播，見表2。

圖1 HIV-1亞型的鄰接法系統(tǒng)進化樹

表2 各HIV-1亞型的傳播途徑[n(%)]

2.3 HIV-1分子傳播網(wǎng)絡特征

2.3.1 HIV-1的入網(wǎng)率及其影響因素：在1.65%最適基因距離閾值下構建HIV-1分子傳播網(wǎng)絡，總共有154條序列進入分子傳播網(wǎng)絡，總?cè)刖W(wǎng)率為58.33%(154/264)，入網(wǎng)的亞型有CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC，其中CRF01_AE的入網(wǎng)率為56.19%(59/105)，CRF07_BC入網(wǎng)率為56.25%(9/16)，CRF08_BC入網(wǎng)率為62.32%(86/138)。將HIV-1是否進入分子傳播網(wǎng)絡作為因變量，以性別、年齡、民族、職業(yè)、傳播途徑、CD4+細胞計數(shù)和HIV-1亞型作為自變量，進行單因素Logistic回歸分析，賦值情況見表3。結果顯示以上因素均非HIV-1進入分子傳播網(wǎng)絡的影響因素(均P>0.05)，見表4。

表4 HIV-1進入分子傳播網(wǎng)絡的影響因素分析

2.3.2 HIV-1分子傳播簇特征及關聯(lián)程度：(1)進入分子傳播網(wǎng)絡的HIV-1未治療人群根據(jù)基因距離各自形成傳播簇，其中擁有分子傳播簇最多的亞型為CRF01_AE(共14個)，最大的分子傳播簇由CRF08_BC聚合而成(共包含76條序列，見圖2)。(2)分子傳播網(wǎng)絡中不同亞型的關聯(lián)程度分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=18.398，P=0.005)，其中高關聯(lián)程度以CRF08_BC為主，其次為CRF01_AE；低關聯(lián)程度(0～4度)以CRF01_AE和CRF08_BC為主。見表5。

圖2 HIV-1流行重組亞型在分子傳播網(wǎng)絡中的分布

表5 HIV-1不同關聯(lián)程度流行重組亞型分布[n(%)]

3 討 論

近年來，國外已將分子傳播網(wǎng)絡廣泛應用于HIV-1傳播、耐藥動力學和高危人群等方面的研究[5-8]，尤其是HIV-1耐藥情況的長期監(jiān)測和實時預防干預[9-10]。而國內(nèi)有關HIV-1基于分子簇的傳播網(wǎng)絡研究尚處于初級階段，僅部分地區(qū)有相關報道[11-13]。在基于傳統(tǒng)的問卷調(diào)查、同伴追蹤、疾病監(jiān)測等流行病學手段的基礎上，分子傳播網(wǎng)絡分析方法的出現(xiàn)豐富了HIV-1傳播關系的研究。HIV-1分子傳播網(wǎng)絡可以根據(jù)研究人群的入網(wǎng)情況、成簇特點、在網(wǎng)絡中的相互連接特點等[3]在一定程度上反映HIV-1的社會傳播網(wǎng)絡。

本研究結果顯示，在廣西欽州市新報告的HIV/AIDS病例中，HIV-1的流行亞型主要為CRF08_BC(52.27%)，其次為CRF01_AE(39.77%)，再次為CRF07_BC(6.06%)；主要傳播途徑為異性性傳播(62.12%)，其中CRF01_AE主要通過異性性傳播，CRF08_BC主要通過異性性傳播和注射吸毒傳播。研究表明，我國HIV-1的主要傳播途徑已由注射吸毒傳播轉(zhuǎn)化為異性性傳播[14-15]，2007年以后CRF01_AE也逐漸成為我國優(yōu)勢毒株[16]；2012～2013年廣西HIV-1最主要的基因亞型為CRF01_AE[14]。雖然欽州地區(qū)HIV-1的主要傳播途徑與全國一致，但是HIV-1最主要的流行重組亞型與全國均不同?？赡艿脑蚴菤J州地處廣西沿海地區(qū)，與越南邊境相鄰，吸毒現(xiàn)象嚴重，由注射吸毒方式感染的CRF08_BC亞型的HIV感染者和AIDS患者的基數(shù)大，該人群除了通過注射吸毒等方式傳播給社交伙伴，更多的通過性傳播方式傳播給配偶、同居者、臨時性伴或性工作者，從而導致CRF08_BC亞型成為該地區(qū)HIV-1最主要的流行重組亞型。針對上述現(xiàn)象，應加強該地區(qū)的AIDS宣傳工作和禁毒戒毒工作，將兩者結合，特別重視既往有吸毒史的HIV感染者和AIDS患者的美沙酮治療和針具交換工作，改善安全套的正確使用和濫交等行為。

本研究中，基于1.65%的最適基因距離閾值，HIV-1分子傳播網(wǎng)絡的總?cè)刖W(wǎng)率為58.33%，性別、年齡、民族、職業(yè)、傳播途徑、CD4+細胞計數(shù)和HIV-1亞型等均非HIV-1分子傳播網(wǎng)絡入網(wǎng)率的影響因素(均P>0.05)。相對于未入網(wǎng)個體，入網(wǎng)的個體相互間存在推斷的傳播關系，其傳播風險更高。關聯(lián)程度越高，與越多的人存在或潛在傳播關系，傳播風險越高[4]。本研究結果顯示，進入分子傳播網(wǎng)絡的CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC這3種亞型間不存在相互連接，彼此各自成簇，說明CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC彼此間的基因距離大于最適基因距離，相互間的傳播風險小于各亞型內(nèi)部的傳播風險。CRF01_AE亞型的傳播簇比CRF07_BC和CRF08_BC的傳播簇多，說明CRF01_AE亞型的突變多導致了基因多樣性從而形成多個傳播簇。CRF08_BC的分子傳播簇和關聯(lián)程度相較于CRF01_AE和CRF07_BC大，說明CRF08_BC在分子傳播網(wǎng)絡內(nèi)存在的推斷傳播關系更多，傳播風險更高。因此，在該地區(qū)構建HIV-1分子傳播網(wǎng)絡時應對CRF08_BC亞型進行長期監(jiān)測，動態(tài)監(jiān)測其變化趨勢，以能夠迅速高效地采取針對性的防治措施阻斷其傳播。

綜上所述，廣西欽州市新報告未治療HIV/AIDS人群HIV-1亞型以CRF08_BC為主，其傳播風險高于其他亞型，應加強該亞型中吸毒人群的禁毒戒毒和危險性行為的改善工作，同時構建分子傳播網(wǎng)絡進行長期監(jiān)測，為HIV-1傳播的防治提供依據(jù)。