張 倩，黃敏文，F(xiàn)ANG Wang，張 玫，杭太俊，袁耀佐**

(1江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019；2中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 210019;3St Jude Children′s Research Hospital,Memphis,TN,USA)

硫酸新霉素(neomycin sulfate)是1949年從新霉素鏈霉菌(streptomyces fradiae)的代謝產(chǎn)物中分離得到的混合物[1](圖1)，含有A、B、C 3個(gè)成分，其中新霉素B和C為主要成分，新霉素A(即新霉胺)僅微量。其主要通過與細(xì)菌核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[2-3]。新霉素的耳、腎毒性較強(qiáng)，但當(dāng)局部應(yīng)用時(shí)，很少引起毒性或過敏性反應(yīng)，因此主要用于治療皮膚感染性疾??；新霉素口服極少吸收，在腸道內(nèi)濃度很高，與其他抗生素混合口服可用于對(duì)腸道微生物群系的控制，適合于手術(shù)前的腸道消毒等[4-5]。其原料藥在《中國(guó)藥典》(2015)(ChP2015)、歐洲藥典9.0(EP9.0)、國(guó)際藥典第五版(Ph.In 5th)、美國(guó)藥典40-國(guó)家處方集35(USP40-NF35)、日本藥局方17版(JP17)、韓國(guó)藥典第10版均有收錄[6-11]，含量測(cè)定均采用專屬性差、繁瑣耗時(shí)的抗生素微生物檢定法，但有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)除EP9.0外，其他藥典中均未設(shè)定。

Figure1 Chemical structures of neomycin B,neomycin C and neamine

脈沖安培電化學(xué)檢測(cè)器(pulsed amperometric detector，PAD)是通過測(cè)定電化學(xué)活性物質(zhì)在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的電流變化實(shí)現(xiàn)對(duì)其定量分析，其與HPLC聯(lián)用在氨基糖苷類抗生素質(zhì)量控制中已有很多應(yīng)用，因其靈敏度高、專屬性好、濃度與響應(yīng)呈線性等優(yōu)點(diǎn)越來越受到重視，并有多個(gè)品種被相關(guān)藥典收載[12]，在ChP2015版的硫酸依替米星原料藥的標(biāo)準(zhǔn)中，也首次將該技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)量控制。

EP9.0采用高效液相色譜-脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定硫酸新霉素的有關(guān)物質(zhì)，但在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，該方法還有一些不足之處。EP9.0采用三電位檢測(cè)波形(triple-potential waveform，TPW)施加電位的檢測(cè)模式，文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]及實(shí)踐表明，TPW模式存在電極耗損快，方法重復(fù)性、重復(fù)性及耐用性差等缺點(diǎn)，而四電位檢測(cè)波形(quadruple-potential waveform，QPW)能較好改善上述不足，已成為氨基糖苷類抗生素質(zhì)量控制的新手段，并在阿米卡星、依替米星等檢測(cè)時(shí)得到應(yīng)用。另外，在EP9.0色譜條件下，原料中的部分雜質(zhì)與主峰及各雜質(zhì)之間的分離欠佳。

因此，本研究在EP9.0方法的基礎(chǔ)上，采用QPW作為檢測(cè)波形，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，建立了HPLC-PAD法測(cè)定硫酸新霉素的含量和有關(guān)物質(zhì)的方法，與EP9.0方法相比，該方法在專屬性、靈敏度和重復(fù)性等方面均取得較大改善。

1 材 料

1.1 儀 器

Dionex ICS-5000+離子色譜儀(美國(guó)Dionex公司)；脈沖安培電化學(xué)檢測(cè)器(Ag-AgCl參比電極；金電極，3mm)；變色龍數(shù)據(jù)分析軟件(Chromeleon7.2 SR4)；PC10池(Pneumatic Controller)；XS205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)及Milli-Q IQ7000超純水發(fā)生裝置(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

新霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：130309-201512)、巴龍霉素(批號(hào)：130371-200305)、新霉胺標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：130411-200908)均來源于中國(guó)食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院。硫酸新霉素B精制品(以新霉素B計(jì)：66.007%，批號(hào)：180803)、硫酸新霉素C精制品(以新霉素C計(jì)：60.776%，批號(hào)：180801，宜昌三峽制藥有限公司)；新霉胺精制品(96.2%，無錫福祈制藥有限公司)。12批硫酸新霉素原料藥來源于A、B兩個(gè)不同企業(yè)2018年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)供研究用樣品。

五氟丙酸、50%無二氧化碳?xì)溲趸c水溶液(HPLC級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；三氟乙酸(HPLC級(jí)，J&K Scientific公司)；高純氦氣(南京天澤氣體有限責(zé)任公司)；超純水。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo AcclaimTMAmG (4.6 mm×150mm，3 μm)；以2%三氟乙酸溶液[含0.01%五氟丙酸+0.6%氫氧化鈉]為流動(dòng)相；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：25 μL。用積分脈沖安培電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)電極為金電極(推薦使用3 mm直徑)，參比電極為Ag/AgCl復(fù)合電極，鈦合金對(duì)電極，四波形檢測(cè)電位(圖2，0.2～0.4 s檢測(cè)信號(hào)積分)，柱后堿液：50%NaOH溶液(1.0 mL 50% NaOH加水制成25 mL溶液)，堿液推薦流速：0.3 mL/min。

Figure2 Settings of quadruple-potential waveform-time

2.2 溶液的制備

2.2.1 柱后堿液 量取超純水960 mL，以50 mL/min流量通氦氣脫氣8 min后，立即量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的氫氧化鈉溶液40 mL混合，繼續(xù)脫氣3 min，即得。

2.2.2 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取新霉胺精制品及新霉素標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解并稀釋成每毫升含新霉胺10 μg、硫酸新霉素30 μg的溶液，即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品采用硫酸新霉素B精制品及硫酸新霉素C精制品標(biāo)化)，加水溶解并稀釋成含新霉素B分別為0.14，0.34，0.69，1.38，3.4，6.89，13.79，27.89 μg/mL的溶液，及含新霉素C分別為0.14，0.28，0.70，1.41，2.82，4.69 μg/mL的溶液，精密稱取新霉胺精制品，加水溶解并稀釋成含新霉胺分別為0.36，0.76，1.51，3.03，6.06，12.11 μg/mL的溶液。

2.2.4 含量測(cè)定溶液 精密稱取硫酸新霉素供試品和新霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水溶解并稀釋制成30 μg/mL的溶液，分別作為供試品溶液和對(duì)照溶液。

2.2.5 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定溶液 精密稱定硫酸新霉素供試品，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成0.4 mg/mL的溶液為供試品溶液，精密量取2 mL，用流動(dòng)相稀釋制成8 μg/mL的溶液為對(duì)照溶液。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 系統(tǒng)適用性

取“2.2.2”項(xiàng)系統(tǒng)適用性溶液，按照“2.1”色譜條件下測(cè)定，出峰順序依次為：新霉胺、新霉素C及新霉素B。新霉素B、新霉素C與相鄰雜質(zhì)的分離度均符合規(guī)定。

3.2 專屬性

取硫酸新霉素原料藥，加水稀釋成含硫酸新霉素0.4 mg/mL的溶液，作為供試品溶液。取上述溶液，分別經(jīng)酸破壞(0.1 mol/L 三氟乙酸破壞10 min后，0.1 mol/L NaOH中和)、堿破壞(0.1 mol/L NaOH破壞10min后，0.1 mol/L 三氟乙酸中和)、氧化破壞(30% H2O2密閉環(huán)境放置1 h)、高溫(60 ℃、80 ℃水浴中水浴1 h)和光照破壞(254 nm紫外照射20 h)處理，結(jié)果見圖3。

結(jié)果表明，通過酸、堿、氧化、高溫、紫外光照射處理樣品后，照“2.1”項(xiàng)色譜條件下，主峰與雜質(zhì)之間，以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離良好，在酸破壞條件下，新霉胺峰面積略有增加，表明該方法的專屬性良好。

3.3 線性及新霉胺校正因子

新霉素B：在0.14～27.89 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=3.628 3X+1.952 6，r=0.998 5。

新霉素C：在0.14～4.69 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=3.280 9X+0.081 4，r=0.999 6。

新霉胺：在0.36～12.11 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=2.662 7X+1.405 2，r=0.998 0。

新霉素C對(duì)新霉素B的校正因子為1.11；新霉胺對(duì)新霉素B的校正因子為1.36。

因此，在計(jì)算有關(guān)物質(zhì)中新霉胺的量時(shí)應(yīng)采用加校正因子的自身對(duì)照法。樣品中存在的其他雜質(zhì)，含量較低，對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)制備較為困難，另外從結(jié)構(gòu)上看，基本含有新霉素的3個(gè)母環(huán)，推測(cè)這些雜質(zhì)響應(yīng)與新霉素B一致，故采用自身對(duì)照法對(duì)其他雜質(zhì)進(jìn)行計(jì)算。

Figure3 Chromatograms of specificity of HPLC-PAD

3.4 檢測(cè)限與定量限

當(dāng)新霉素B與新霉素C質(zhì)量濃度分別為0.07 μg/L時(shí)，信噪比均約為3；質(zhì)量濃度分別為0.14 μg/mL時(shí)，信噪比均約為10，按進(jìn)樣量25 μL換算，則新霉素B和新霉素C的檢測(cè)限均為1.75 ng，定量限均為3.5 ng。

3.5 重復(fù)性

取同一批號(hào)硫酸新霉素樣品6份以及新霉素標(biāo)準(zhǔn)品按照“2.2.4”項(xiàng)含量測(cè)定溶液方法配制，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，新霉素B含量的RSD(n=6)為0.6%，新霉素C含量的RSD(n=6)為0.6%。

取同一批號(hào)硫酸新霉素樣品6份按照“2.2.5”項(xiàng)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定溶液方法配制，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，各雜質(zhì)的含量的RSD均符合要求，雜質(zhì)總量RSD(n=6)為1.10%，方法重復(fù)性良好。

3.6 耐用性考察

取一批硫酸新霉素樣品，按“2.2.5”項(xiàng)下方法配制溶液，略微改變“2.1”項(xiàng)下色譜條件的參數(shù)如：柱溫、流速，分別進(jìn)樣。各峰分離良好，方法的耐用性良好。

4 方法的應(yīng)用

4.1 雜質(zhì)譜研究

采用本研究建立的色譜條件，運(yùn)用在線膜抑制技術(shù)[16]，實(shí)現(xiàn)了液質(zhì)聯(lián)用，對(duì)硫酸新霉素中的雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推定和來源分析，發(fā)現(xiàn)硫酸新霉素原料藥中除有新霉胺，還有核糖霉素、巴龍霉素及其異構(gòu)體、巴龍霉胺、乙酰新霉胺、乙酰新霉素B及其異構(gòu)體等其他雜質(zhì)，主要降解雜質(zhì)為新霉胺[17]，推定結(jié)果見表1。

Table1 Presumed results of mass spectrometry for impurities of neomycin sulfate

NumberPresumed resultsAImpurity related to neomycinBImpurity related to paromamycinCParomamineDUnknown 1ENeamineFAcetyl-neamineGRibostamycinHImpurity related to ParomamycinIUnknown 2JParomamycin IKParomamycin IILAcetyl-neomycin B isomerMAcetyl-neomycin B

4.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

按“2.2.5”項(xiàng)下方法制備有關(guān)物質(zhì)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，有關(guān)物質(zhì)典型色譜圖見圖4，結(jié)果見表2。有關(guān)物質(zhì)除新霉胺外采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算。

Figure4 Typical chromatogram of related substances for neomycin sulfate

Table2 Result of related substance in 12 batches of raw materials

ManufacturersSamplenumberA/%B/%C/%D/%E/%F/%G/%H/%I/%J/%K/%L/%M/%Total/%Maximum single impurity*/%A10.220.060.680.070.310.710.190.200.210.750.200.480.284.28J(0.75)20.290.110.530.061.830.420.120.090.150.640.110.320.124.79E(1.83)30.170.111.110.141.021.340.240.210.181.020.270.630.556.69F(1.34)40.170.110.270.060.610.370.430.100.160.720.260.320.233.64J(0.72)50.230.100.340.050.340.480.300.130.161.070.650.370.344.48J(1.07)60.160.211.020.101.101.220.180.120.121.440.390.600.436.79J(1.44)B70.060.261.330.190.691.680.130.260.261.981.360.460.478.96J(1.98)80.060.231.390.190.641.930.130.300.171.951.460.480.719.47J(1.95)90.050.171.410.070.671.670.120.350.181.611.170.510.768.58F(1.67)100.030.251.030.140.671.820.100.210.151.050.650.690.887.50F(1.82)110.030.110.930.060.561.280.080.190.220.980.740.580.786.41F(1.28)120.050.150.960.060.751.440.110.200.141.060.750.620.856.94F(1.44)

A:Impurity related to neomycin;B:Impurity related to Paromamycin;C:Paromamine;D:Unknown 1;E:Neamine;F:Acetyl- neamine;G:Ribostamycin;H:Impurity related to Paromamycin;I:Unknown 2;J:Paromamycin I;K:Paromamycin II;L:Acetyl-neomycin B isomer;M:Acetyl-neomycin B

*:Maximum single impurity of sample

Tip:The sample of enterprise B was over effective period for the research

由兩個(gè)企業(yè)各6批共12批原料藥的檢測(cè)結(jié)果可見，各批次檢出來的雜質(zhì)種類一致，僅雜質(zhì)量不同，各批原料藥樣品的單個(gè)雜質(zhì)量基本都大于0.1%，最大雜質(zhì)多集中在巴龍霉素Ⅰ；部分批次乙酰新霉胺為最大雜質(zhì)，其余新霉素相關(guān)雜質(zhì)、巴龍霉素相關(guān)雜質(zhì)和核糖霉素略低?？紤]本品為多組分發(fā)酵的抗生素，結(jié)合歐洲藥典雜質(zhì)限度要求和樣品的實(shí)際測(cè)定情況，將雜質(zhì)限度定為“新霉胺不得大于2.0%，單個(gè)雜質(zhì)不得大于5.0%，雜質(zhì)總量不得大于15.0%”。12批樣品有關(guān)物質(zhì)結(jié)果均符合規(guī)定。

4.3 含量測(cè)定結(jié)果及量效一致性研究

按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備含量測(cè)定溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，用經(jīng)標(biāo)化的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品以外標(biāo)法計(jì)算新霉素B和新霉素C的量(以干燥品計(jì))，測(cè)定結(jié)果見表3。

由于收錄硫酸新霉素的國(guó)內(nèi)外藥典中含量測(cè)定方法均采用抗生素微生物檢定法，測(cè)定結(jié)果采用效價(jià)單位表示，而儀器法測(cè)得的含量為質(zhì)量單位，兩個(gè)結(jié)果無法進(jìn)行簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)換，因此，需通過實(shí)驗(yàn)得到量效轉(zhuǎn)換系數(shù)，再通過計(jì)算將質(zhì)量含量轉(zhuǎn)換成效價(jià)含量，這一研究稱為量效一致性研究。參考USP[18-19]相關(guān)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則及文獻(xiàn)[20]中關(guān)于硫酸慶大霉素的研究思路，采用本研究建立的HPLC-PAD法對(duì)12批樣品中新霉素B和新霉素C的質(zhì)量含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)新霉素B和新霉素C的量效轉(zhuǎn)換系數(shù)計(jì)算，轉(zhuǎn)換為效價(jià)含量后，與采用微生物鑒定法測(cè)定的效價(jià)值對(duì)比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異，表明含量測(cè)定結(jié)果真實(shí)可靠，完成了儀器測(cè)定法對(duì)微生物效價(jià)測(cè)定法的替代。

Table3 Result of content of neomycin sulfate in 12 batches of raw materials

BreedManufacturerSampleContent of neomycin C/%(By dry substance)Content of neomycin B/%(By dry substance)Neomycin sulfateA114.949.9215.950.7316.049.4411.654.2511.053.3615.549.2Neomycin sulfateB78.052.387.053.197.851.4109.450.8118.751.4128.851.4

Tip：The sample of enterprise B was over effective period for the research

5 討 論

5.1 色譜柱的選擇

相比于其他氨基糖苷類抗生素，硫酸新霉素的極性較大，在一般的ODS柱上保留較弱，EP9.0中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法流動(dòng)相為含0.6%氫氧化鈉的2%三氟乙酸水溶液，不含有機(jī)相，pH約為1.2，對(duì)色譜柱的耐水性及耐酸性要求較高。本研究采用EP9.0的方法，考察了3種親水極性柱：Agilent Zorbax SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Waters Xselect T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Thermo AcclaimTMAmG C18(4.6 mm×250 mm，3 μm)對(duì)硫酸新霉素的分離情況。結(jié)果表明，Agilent Zorbax SB-Aq和Waters Xselect T3這兩根色譜柱對(duì)新霉素B、新霉素C及各雜質(zhì)間的分離較差，且檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)少。Thermo AcclaimTMAmG C18色譜柱為Thermo公司專門針對(duì)氨基糖苷類抗生素開發(fā)的色譜柱，其對(duì)新霉素B、新霉素C及各雜質(zhì)均能得到較好的分離，主峰峰形對(duì)稱，檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)較多，因此采用該色譜柱來進(jìn)一步優(yōu)化硫酸新霉素HPLC-PAD檢測(cè)方法。

5.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

在重復(fù)EP9.0有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)新霉素B與其前相鄰雜質(zhì)分離不佳(圖5)。嘗試在流動(dòng)相中降低三氟乙酸濃度，使新霉素B及其前相鄰雜質(zhì)出峰變慢，以改善二者的分離度，但此時(shí)新霉素B又會(huì)包裹其后相鄰的雜質(zhì)。同樣通過調(diào)整氫氧化鈉的濃度也未達(dá)到滿意的結(jié)果。參考硫酸依替米星[21-23]的研究思路，嘗試采用五氟丙酸替代三氟乙酸，但硫酸新霉素兩個(gè)主峰保留過強(qiáng)，分析時(shí)間太長(zhǎng)。進(jìn)一步在三氟乙酸存在的基礎(chǔ)上加入少量五氟丙酸，兩種離子對(duì)試劑對(duì)不同色譜峰保留時(shí)間形成協(xié)同影響，且因流動(dòng)相中存在氫氧化鈉提高了pH，對(duì)峰型及各雜質(zhì)間的分離均有改善。通過對(duì)兩種離子對(duì)試劑不同配比的考察，最終確定流動(dòng)相為含0.01%五氟丙酸及0.6%氫氧化鈉的2%三氟乙酸溶液，在此條件下，新霉素B與前后相鄰雜質(zhì)(雜質(zhì)L、雜質(zhì)M)的分離良好，其他雜質(zhì)分離度均符合要求，并且比EP9.0方法多分離出雜質(zhì)K，分離檢測(cè)能力有明顯改善。

Figure5 Chromatogram of related substances in EP9.0 by Thermo AcclaimTMAmG C18

6 結(jié) 論

本次建立的HPLC-PAD方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，將方法用于實(shí)際樣品的有關(guān)物質(zhì)及含量測(cè)定，方便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，該方法具有良好的應(yīng)用前景，可以作為補(bǔ)充中國(guó)藥典硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)的推薦方法。