曾英男，顧宇航，劉 佳

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林 132101）

0 引言

天然提取物抗氧化的機(jī)理在于其含有的R-OH可以形成氫自由基，并且可以通過(guò)消除一些自由基的活性[1]，起到良好的抗氧化作用。

近年來(lái)，研究人員逐漸從白芷中發(fā)現(xiàn)了新結(jié)構(gòu)的香豆素類(lèi)化合物[2]，香豆素類(lèi)成分主要存在白芷的根部，主要有歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素、白當(dāng)歸素等。金銀花中含有豐富的綠原酸等活性物質(zhì)。從金銀花和白芷提取活性成分并研究抗氧化性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型食品抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

白芷、金銀花，當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買(mǎi)；DPPH·，福州飛凈生物科技有限公司提供；歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）、ABTS+，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器

KQ-100DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；GFL-45型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Cary 60型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；A-88型組織粉碎機(jī)，常州市金壇晨陽(yáng)電子儀器廠產(chǎn)品；YRE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

精密稱(chēng)取歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品8.0 mg，甲醇溶解后定容至100 mL。搖勻后配制質(zhì)量濃度為0.002，0.004，0.008，0.012，0.016，0.020 mg/mL[3]。以甲醇作為空白對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)200～400 nm處進(jìn)行掃描，其標(biāo)準(zhǔn)品溶液于波長(zhǎng)300 nm處有最大峰值，所以于波長(zhǎng)300 nm處測(cè)定吸光度，記錄吸光度并計(jì)算與歐前胡素含量間的關(guān)系。

2.2 白芷提取物

白芷干燥根切片粉碎后過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取50.00 g，按料液比1∶20（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在超聲功率100 W，超聲時(shí)間20 min，常溫條件下，進(jìn)行超聲提取。過(guò)濾后減壓濃縮除去乙醇有機(jī)溶劑，提取液適當(dāng)稀釋用于測(cè)定香豆素的含量。最后在45℃恒溫烘箱中進(jìn)行干燥，制得白芷提取物。

式中：C——測(cè)定白芷提取液中歐前胡素質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液的體積，mL；

m——白芷粉末的質(zhì)量，g。

2.3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，用適量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解后定容至100 mL。取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL（相當(dāng)于 0.004，0.008，0.016，0.024，0.032，0.040 mg/mL） 溶液到 25 mL容量瓶，用70%乙醇定容后搖勻[4]。以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇作為空白對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～400 nm處進(jìn)行掃描，其標(biāo)準(zhǔn)品溶液在330 nm處有最大峰值，所以于波長(zhǎng)330nm處測(cè)定吸光度，記錄吸光度并計(jì)算其與綠原酸含量間的關(guān)系。

式中：C——測(cè)定金銀花提取液中綠原酸質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液的體積，mL；

m——金銀花粉末質(zhì)量，g。

2.4 金銀花提取物

金銀花粉碎后過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取50.00 g按料液比為1∶30（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，在浸提溫度為50℃，超聲時(shí)間為60 min，超聲功率為600 W的條件下進(jìn)行超聲提取。過(guò)濾后減壓濃縮除去乙醇有機(jī)溶劑，提取液適當(dāng)稀釋用于測(cè)定綠原酸的含量。最后在45℃恒溫烘箱中進(jìn)行干燥，制得金銀花提取物。

2.5 DPPH·清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[5]，準(zhǔn)確稱(chēng)取DPPH·20 mg，用無(wú)水乙醇溶解定容至50 mL，此時(shí)濃度為1.014 4 mmol/L。干燥后的白芷、金銀花提取物取0.01 g用水溶解后適當(dāng)稀釋制得樣品液；將0.01 g維C用水溶解適當(dāng)稀釋制得對(duì)照液，取樣品液與2 mL DPPH·溶液混合后避光反應(yīng)20 min，利用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度為Ai；取2 mL樣品液與2 mL水混合后避光反應(yīng)，同樣條件下測(cè)定吸光度為Aj；2 mL DPPH·溶液和水混合后避光反應(yīng)，測(cè)定吸光度為Ac，同樣條件下重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

2.6 ABTS+清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[5]，配制濃度為7 mmol/L ABTS+溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取ABTS+38.41 mg用水溶解后定容10 mL；濃度為140 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液的配制：過(guò)硫酸鉀378.45 mg用水溶解后定容至10 mL。取10 mL將ABTS+溶液和179μL過(guò)硫酸鉀溶液混合，避光保存12～16 h，再用pH值7.4 PBS溶液稀釋至適當(dāng)濃度，使其于波長(zhǎng)734 nm處的吸光度為0.70±0.02，即為ABTS+工作液。

干燥后的白芷、金銀花提取物取0.01 g用水溶解后適當(dāng)稀釋制得樣品液；將0.01 g維C用水溶解適當(dāng)稀釋制得對(duì)照液。PBS溶液調(diào)零，取樣品1 mL與ABTS+工作液4 mL室溫避光反應(yīng)6 min，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度為As，PBS 1 mL和以ABTS+溶液4 mL室溫避光反應(yīng)6 min測(cè)定吸光度為A0，同樣條件下重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用軟件Prism 7.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，歐前胡素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=56.298X+0.066 8，R2=0.991 9，在 0.002～0.020 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。其中，橫坐標(biāo)X為歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)Y為吸光度。

樣品通過(guò)測(cè)定吸光度后，計(jì)算出白芷提取香豆素得率為3.4 mg/g。

3.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=40.135X+ 0.009 5，R2=0.999 8，在0.004～0.040 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。其中橫坐標(biāo)X為綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度，縱坐標(biāo)Y為吸光度。樣品通過(guò)測(cè)定吸光度后，計(jì)算出金銀花提取的綠原酸得率為70.2 mg/g。

3.3 白芷和金銀花提取物對(duì)DPPH·的清除能力

白芷和金銀花提取物對(duì)DPPH·清除能力見(jiàn)圖3。

由圖4可知，白芷提取物和金銀花提取物在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL和0.5 mg/mL時(shí)，清除ABTS+自由基均高于同質(zhì)量濃度的維C，且金銀花清除自由基能力優(yōu)于白芷提取物。另外，提取物的質(zhì)量濃度在0.5 mg/mL時(shí)ABTS+清除率高于0.2 mg/mL，說(shuō)明在這個(gè)范圍內(nèi)，提取物的抗氧化作用與提取物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，與清除DPPH·的試驗(yàn)結(jié)論一致。

圖3 白芷和金銀花提取物對(duì)DPPH·清除能力

4 結(jié)論

由圖3可知，在白芷提取物DPPH·清除能力在0.2 mg/mL較弱，與維C較為相近，但是當(dāng)質(zhì)量濃度在0.4，0.6 mg/mL時(shí)清除效果優(yōu)于維C。金銀花提取物的抗氧化效果均優(yōu)于維C和白芷提取物。同時(shí)，金銀花和白芷提取物隨著質(zhì)量濃度升高清除作用增加，說(shuō)明抗氧化作用與提取物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

3.4 白芷和金銀花提取物對(duì)ABTS+的清除能力

在食品中抗氧化劑的應(yīng)用十分重要，而天然抗氧化劑與化學(xué)合成抗氧化劑相比，具有安全、低毒的優(yōu)點(diǎn)，甚至是可以作為功能性的添加劑。以白芷、金銀花為原料，分別用超聲方法以乙醇作為溶劑提取天然活性成分，其中白芷中的香豆素得率為3.4 mg/g，金銀花中的綠原酸得率為70.2 mg/g，提取液經(jīng)過(guò)濃縮后干燥并研磨為粉末，用水溶解后測(cè)定DPPH·，ABTS+的清除能力，發(fā)現(xiàn)在白芷提取物在質(zhì)量濃度為0.4，0.6 mg/mL清除DPPH·能力高于同質(zhì)量濃度的維C，而金銀花清除DPPH·能力較高。白芷提取物和金銀花提取物的質(zhì)量濃度分別在0.2 mg/mL和0.5 mg/mL時(shí)清除ABTS+能力均高于維C。以上試驗(yàn)結(jié)果均證明，白芷和金銀花的提取物均具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，抗氧化性較強(qiáng)，可作為天然的抗氧化劑。

圖4 白芷和金銀花提取物對(duì)ABTS+的清除能力