孫 艷，石新建，王振輝，馮麗凱，趙 靜，劉 政

(新疆農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎病(cottonVerticilliumwilt)是一種世界性土傳維管束萎蔫病害，近年來(lái)在我國(guó)主產(chǎn)棉區(qū)，尤其是在長(zhǎng)江流域、黃河流域和新疆棉區(qū)持續(xù)暴發(fā)為害，發(fā)病面積呈現(xiàn)出了高速擴(kuò)張趨勢(shì)，黃萎病的發(fā)生為害日趨嚴(yán)重，造成嚴(yán)重?fù)p失[1-3]，加強(qiáng)棉花黃萎病的研究對(duì)防治該病有實(shí)際意義。 【前人研究進(jìn)展】棉株體中分離獲得棉花黃萎病菌是開(kāi)展致病力分化和遺傳變異的基礎(chǔ)，而前人研究結(jié)果表明，棉花的根、莖和葉中含有600余種內(nèi)生菌和病原菌，約29個(gè)屬，43個(gè)種[4]。分離棉花黃萎病菌時(shí)，因?yàn)榇罅棵拗陿悠吩谶\(yùn)輸和保存過(guò)程中未能及時(shí)處理，使得棉株體表面存在大量寄/腐生菌和體內(nèi)存在大量?jī)?nèi)生菌而導(dǎo)致后續(xù)分離困難，選擇合適的滅菌材料和方法成為影響分離效率的關(guān)鍵因素。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)病原菌輪枝菌的滅菌分離方法均不盡相同，常用的表面消毒劑種類(lèi)有乙醇、次氯酸鈉和升汞等[5-7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】所選用的滅菌劑種類(lèi)不同，滅菌的時(shí)間和方法也各有差異，尤其是在發(fā)病棉株材料采集和樣品保存條件差異下，均對(duì)病原菌的成功分離有顯著影響。研究篩選一套標(biāo)準(zhǔn)的表面滅菌分離獲得棉稈內(nèi)黃萎病、病原菌的方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】根據(jù)棉花樣品材料腐爛程度的不同，以最大化分離出黃萎病菌為最終目的。選擇適合的滅菌劑種類(lèi)和滅菌方法流程。篩選出一套標(biāo)準(zhǔn)的較為適宜的分離棉稈黃萎病菌的滅菌材料和方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

選擇新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)棉花棉花種植區(qū)，一師16團(tuán)、七師125團(tuán)、八師142團(tuán)和新湖農(nóng)場(chǎng)重度發(fā)病棉花莖桿作為供試材料。根據(jù)棉稈在運(yùn)輸保存過(guò)程中的腐敗程度，劃分三個(gè)等級(jí)：Ⅰ、新鮮棉稈(棉稈表皮新鮮，完整；81團(tuán)五連)，Ⅱ、輕度腐敗棉稈(棉稈表皮輕度變黑褐色，表皮完整；新湖農(nóng)場(chǎng))，Ⅲ、重度腐敗棉稈(棉稈表皮完全變黑、腐爛；16團(tuán)14連)。將供試材料分別用流水反復(fù)沖洗，去除棉稈表面雜質(zhì)。剝皮，切成5 cm左右小段，備用。

選擇性PDA培養(yǎng)基制備：加熱PDA培養(yǎng)基至溶解，冷卻后加入抗生素(鏈霉素：氯霉素：青霉素m/m，1∶1∶1)混合液，分別制備含抗生素濃度100 、200 、300、400和500 mg/L的選擇性PDA培養(yǎng)基。

1.2 方 法

棉花植株體內(nèi)含有各種細(xì)菌和真菌，之間存在共生或拮抗的關(guān)系[8]。為排除細(xì)菌對(duì)分離輪枝菌的潛在影響，配置含不同濃度抗生素混合液的培養(yǎng)基進(jìn)行抑制細(xì)菌試驗(yàn)。

棉花莖桿內(nèi)生長(zhǎng)多種類(lèi)型真菌，真菌種類(lèi)不同，其寄生或共生的部位也不同[9]。試驗(yàn)用四種不同的表面滅菌方法和滅菌時(shí)間處理材料，確定對(duì)目標(biāo)病原菌大麗輪枝菌的最佳分離條件。

將已處理的三個(gè)等級(jí)的供試材料棉稈，各放入75%的乙醇、0.1%的升汞、5%次氯酸鈉和5%次氯酸鈉+75%乙醇(依次處理)溶液中，分別滅菌處理1、2、3、4和5 min，對(duì)Ⅲ型棉稈分別滅菌處理1、2、3、4、5、6、8和10 min無(wú)菌水沖洗2次。無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)陰干，縱向切取1 cm小段，四等分。

每個(gè)處理接種到含500 mg/L抗生素的選擇性PDA培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種6個(gè)棉稈小段，5次重復(fù)。10 d統(tǒng)計(jì)真菌生長(zhǎng)個(gè)數(shù)和細(xì)菌生長(zhǎng)個(gè)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為5次重復(fù)試驗(yàn)的平均值取標(biāo)準(zhǔn)差。利用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，應(yīng)用SPSS22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及LSD檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗生素濃度對(duì)棉稈內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)影響

隨著培養(yǎng)基中抗生素濃度的升高，三種棉稈類(lèi)型分離的細(xì)菌生長(zhǎng)率均呈下降趨勢(shì)。不添加抗生素(0 mg/L)的培養(yǎng)基內(nèi)，三種棉稈類(lèi)型的材料細(xì)菌生長(zhǎng)率均達(dá)90%以上，當(dāng)抗生素濃度為400 mg/L時(shí)，Ⅰ型棉稈接種的培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，當(dāng)抗生素濃度為500 mg/L時(shí)，三種棉稈類(lèi)型接種的培養(yǎng)基內(nèi)均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。圖1 用大麗輪枝菌分別接種含抗生素濃度0和500 mg/L PDA培養(yǎng)基，7 d后，該兩個(gè)處理間菌落大小無(wú)顯著差異。因此，可以確定，含500 mg/L濃度抗生素的PDA培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，并其對(duì)棉稈內(nèi)細(xì)菌抑菌率達(dá)100%。后續(xù)試驗(yàn)所有培養(yǎng)基均為含500 mg/L濃度抗生素的PDA培養(yǎng)基。

2.2 不同消毒處理對(duì)Ⅰ型棉花莖稈黃萎病菌分離和培養(yǎng)的影響

研究表明,在四種不同的表面消毒處理下，雜菌的生長(zhǎng)率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈降低趨勢(shì)，處理初期雜菌生長(zhǎng)率基本均為100%；而大麗輪枝菌的分離率隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)，分別在75%乙醇處理4 min、5%NaClO處理3和4 min、0.1%升汞處理1和2 min、75%乙醇+5%NaClO處理4 min時(shí)，大麗輪枝菌分離率最高，分別為70%、53.33%、16.67%和70%。圖2

2.3 不同消毒處理對(duì)Ⅱ型棉花莖稈黃萎病菌分離和培養(yǎng)的影響

研究表明,4種不同處理方式對(duì)Ⅱ型棉稈內(nèi)真菌分離率的試驗(yàn)結(jié)果與Ⅰ型類(lèi)似，雜菌生長(zhǎng)率隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，并在處理初期1 min內(nèi)與對(duì)照無(wú)顯著差異；大麗輪枝菌的生長(zhǎng)率隨著滅菌時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低趨勢(shì)，分別在75%乙醇處理4 min、5%NaClO處理3 min、0.1%升汞處理3 min、75%乙醇+5%NaClO處理3 min時(shí)分離率最高，分別為90%、76.67%、36.67%和43.33%。圖3

注：差異性顯著(P<0.05)用不同字母標(biāo)記

Note: Values followed by different lower case letters are significantly different at 0.05 level

圖1 含不同濃度抗生素的PDA培養(yǎng)基對(duì)棉稈內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)抑制
Fig.1 The growth inhibition of bacterial in cotton stalk with different concentration of antibiotics on PDA culture medium

注：不同的大小寫(xiě)字母分別表示雜菌或大麗輪枝菌之間差異性顯著(P<0.05)。下同

Note: Different upper and lower case letters indicate that there is a significant difference between the contaminating microorganism or theVerticilliumdahiaeKleb (P< 0.05).The same as below

圖2 不同消毒處理下Ⅰ型棉稈內(nèi)真菌分離率變化

Fig.2EffectsofdifferentdisinfectionmethodsonfungusseparationrateintypeⅠcottonstalk

圖3 不同消毒處理下Ⅱ型棉稈內(nèi)真菌分離率變化
Fig.3 Effects of different disinfection methods on fungus separation rate in typeⅡcotton stalk

圖4 不同消毒處理下Ⅲ型棉稈內(nèi)真菌分離率變化
Fig.4 Effects of different disinfection methods on fungus separation rate in typeⅢcotton stalk

2.4 不同消毒處理對(duì)Ⅲ型棉花莖稈黃萎病菌分離和培養(yǎng)的影響

研究表明，在四種不同滅菌處理下棉稈雜菌的生長(zhǎng)率隨著滅菌時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，但是在滅菌處理10 min時(shí)，除升汞處理下雜菌生長(zhǎng)率10%以外，其余3種滅菌處理的雜菌生長(zhǎng)率均在35%以上，且在滅菌初期75%乙醇和5%NaClO處理0～4 min、0.1%升汞處理0～1和2～4 min、75%乙醇+5%NaClO處理0～2和3～6 min彼此均無(wú)顯著差異；大麗輪枝菌在四種滅菌處理下分離率總體呈先升高后降低趨勢(shì)，分別在75%乙醇處理8 min、5%NaClO處理8 min、0.1%升汞處理5 min、75%乙醇+5%NaClO處理5 min時(shí)分離率最高，分別為36.67%、26.67%、30%和50%。圖4

3 討 論

棉花活體植株各個(gè)器官的表面或內(nèi)部均存在各種微生物，如棉花根、葉部位多存在赤霉屬(Gibberella)和青霉屬(Penicillium)，莖部表面多存在鐮刀屬(Fusarium)和鏈格孢屬真菌[10-12]。棉花黃萎病是典型的土傳維管束疾病，輪枝菌多存在于木質(zhì)部維管束部位[4]。傳統(tǒng)研究中分離黃萎病病原菌的材料，多數(shù)采用乙醇、次氯酸鈉和升汞對(duì)材料進(jìn)行表面滅菌，由于材料發(fā)病狀況的不同，對(duì)其進(jìn)行滅菌的程序亦不相同[13-14]。研究中，將這3種滅菌方法進(jìn)行四種不同滅菌組合，在不同的處理時(shí)間檢測(cè)其對(duì)三種材料中目標(biāo)病原菌的分離情況。結(jié)果表明，含500 mg/L混合抗生素的PDA培養(yǎng)基可完全抑制材料中細(xì)菌生長(zhǎng)。在四種不同表面滅菌處理下，Ⅰ型材料，75%乙醇和75%乙醇+5% NaClO處理4 min時(shí)，病原菌的分離率最高，病原菌生長(zhǎng)率70%，其中75%乙醇+5% NaClO處理可完全抑制雜菌生長(zhǎng)；Ⅱ型材料中75%乙醇處理4 min條件下病原菌分離率最高，為90%；Ⅲ型材料，75%乙醇+5%NaClO處理5 min時(shí)分離率最高，為50%。

4 結(jié) 論

添加了抑制棉稈內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)的最少混合抗生素(鏈霉素：氯霉素：青霉素 m/m，1∶1∶1)濃度為500 mg/L的PDA培養(yǎng)基；同時(shí)根據(jù)棉稈腐敗程度的不同，選擇不同的滅菌劑和滅菌時(shí)間，即新鮮棉稈材料和輕度腐敗棉稈材料表面滅菌的最佳條件為75%乙醇處理4 min，重度腐敗棉稈表面滅菌條件為75%乙醇+5%NaClO處理5 min。