鄭俊賢， 王子淵， 楊套偉， 張 顯， 徐美娟， 饒志明

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

甲酸脫氫酶 （Formate dehydrogenase，F(xiàn)DH，EC 1.2.1.2）屬于D-2-羥基酸脫氫酶類，催化甲酸氧化成CO2，同時伴隨著NAD+還原為NADH[1-2]。大多數(shù)的甲基營養(yǎng)型微生物中都含有甲酸脫氫酶，如可以利用甲醇的酵母菌以及一些細(xì)菌、真核生物、高等植物等[1]。它是一種非常保守的酶，在所有來源的酶中，絕對保守的氨基酸殘基有60個[2]，且對于一些進(jìn)化距離比較遠(yuǎn)的微生物物種如：Pseudomonas sp.101、Hansenula polymorpha 和 Solanum tuberosum 來源的FDH，其氨基酸序列同源性高達(dá)45%，而與催化或輔酶和底物結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基在FDH中更為嚴(yán)格保守[3]。因此，參考大多數(shù)物種在關(guān)鍵區(qū)域的氨基酸序列，利用同源序列比對，對某種來源的FDH進(jìn)行改造，具有較高的可靠性。

FDH催化還原NAD+的反應(yīng)關(guān)鍵在于增強(qiáng)了NAD+的C4N部分的親電性質(zhì)。反應(yīng)中，負(fù)氫離子脫離甲酸并攻擊NAD+的帶正電荷親電C4N部分，結(jié)果產(chǎn)生了兩種中性物質(zhì)CO2和NADH[4]。該反應(yīng)需要在避免水分子干擾的密閉環(huán)境中進(jìn)行，同時FDH的結(jié)構(gòu)也為此提供了良好的疏水中心[4-5]。

隨著蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)的發(fā)展，越來越多的FDH三維結(jié)構(gòu)得到解析，對深入探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的聯(lián)系有著重要的作用；另外，對FDH催化機(jī)理的研究也在不斷增多，在酶催化過程中起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基位點也多有報道[6-8]，這有利于通過理性設(shè)計并利用蛋白質(zhì)工程對FDH的特性進(jìn)行改造。已報道對FDH的改造主要集中在以下幾個方面：改變輔酶特異性[9-11]、提高酶活[12-13]、提高酶的穩(wěn)定性等方面[14-15]。

由于FDH的催化反應(yīng)具有不可逆、底物廉價和副產(chǎn)物容易去除等優(yōu)勢，因此常被用作輔酶NADH再生酶與其他氧化還原酶組合用于羥基酸、手性醇、氨基酸等重要光學(xué)活性化合物的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，而這些產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及各種添加劑中[16]。最具代表性的是來源于博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）的甲酸脫氫酶CbFDH，在上世紀(jì)已經(jīng)被用來與亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)用于手性L-叔亮氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)[17]。然而，野生型CbFDH酶活低，與亮氨酸脫氫酶、乳酸脫氫酶及乙醇脫氫酶等組合時，輔酶NADH再生供應(yīng)不足，造成產(chǎn)品轉(zhuǎn)化效率不高[18]。

作者通過多種來源的甲酸脫氫酶序列比對獲得關(guān)鍵保守位置的差異點 （第93位氨基酸殘基），該位點位于底物的通道入口，其疏水性可能會影響FDH的催化活性，因此，對存在差異的CbFDH的V93位點進(jìn)行疏水性改造及分析，同時對獲得的突變體酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究及動力學(xué)參數(shù)研究。其中突變體酶V93I在酶活、比酶活和催化效率上均有所提高，該酶進(jìn)一步被用于L-正纈氨酸的不對稱合成，結(jié)果表明了該突變體酶能夠提高體系的轉(zhuǎn)化效率從而縮短底物完全轉(zhuǎn)化的時間，具有較強(qiáng)的開發(fā)和應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 表達(dá)宿主菌E.coli BL21和重組菌E.coli BL21/pET28a-fdh：由作者所在實驗室保存；表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（含卡那霉素抗性）：購自Novagen公司。

1.1.2 主要試劑 PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、E×Taq DNA聚合酶：均購于TaKaRa公司（大連）；ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒：購于南京諾唯贊；膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校壕徲贕eneray公司；Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒：購于生工（上海）生物工程有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨：購于OXOID（英國）；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（組分g/L）：酵母提取物 5， 胰蛋白胨 10，NaCl 10；pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；LB固體培養(yǎng)基為在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量濃度20 g/L的瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 基因定點突變和重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以實驗室已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-fdh為模板，設(shè)計點突變引物，見表1。通過重疊延伸PCR引進(jìn)突變點[19]。

表1 基因克隆及定點突變引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis and gene cloning

按照ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒說明書，將重疊延伸得到的PCR產(chǎn)物及表達(dá)質(zhì)粒pET28a的雙酶切（BamHI和HindIII）產(chǎn)物按一定的比例混合連接，然后導(dǎo)入感受態(tài)E.coli BL21中，挑單克隆提取質(zhì)粒，并進(jìn)行測序。保存含經(jīng)測序驗證正確的重組質(zhì)粒的菌株。

1.2.2 突變體酶的表達(dá)和純化 重組菌接種于10 mL含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。然后以1%的接種體積分?jǐn)?shù)將其接至50 mL含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，條件為37℃、180 r/min。之后加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)條件為30℃、160 r/min，誘導(dǎo)時間為16 h。離心收集細(xì)胞，并用 PBS（pH 7.5，濃度為0.05 mol/L）緩沖液洗滌2次后懸浮。然后使用超聲破碎儀對細(xì)胞進(jìn)行破碎，溫度控制在4℃。將破碎液在4℃、14 000 r/min條件下離心20 min去除細(xì)胞破碎雜質(zhì)，用于純化。

蛋白質(zhì)純化的方法是采用鎳柱親和層析，具體參照文獻(xiàn)[13]所述方法。

1.2.3 突變體酶酶活的測定 突變體酶酶活測定采用紫外分光光度法測定[13，20]。反應(yīng)預(yù)混液中含有濃度為0.167 mmol/L甲酸鈉溶液 （由PBS濃度為0.05 mol/L，pH 7.5配制）和濃度為 1.67 mmol/L NAD+。加入10 μL適量稀釋的待測樣品，啟動反應(yīng)并計時，在340 nm下每30秒記錄一次吸光值。以不同濃度的NADH做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每分鐘產(chǎn)生的NADH的量。酶活定義為：每分鐘產(chǎn)生摩爾質(zhì)量為1 μmol NADH所需的酶量為1個酶活單位。

1.2.4 突變體酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 最適溫度：在pH 7.0條件下，將10 μL適量稀釋純酶液添加到反應(yīng)預(yù)混液中，將反應(yīng)體系分別置于 35、40、45、50、55℃下反應(yīng)，按1.2.3.所述方法測定酶活。設(shè)定最高酶活為100%，計算各個溫度下的相對酶活，獲得該酶的最適反應(yīng)溫度。

最適pH：將10 μL適量稀釋純酶液添加到不同pH的緩沖溶液中（pH 5.0～6.0，濃度為0.05 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 7.0～8.0，濃度為0.05 mol/L 的 PBS 緩沖液；pH 9.0～10.0，濃度為 0.05 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液；pH 10.0～11.0， 濃度為0.05 mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液），于30℃下測定酶活。設(shè)定最高酶活為100%，計算各個pH下的相對酶活，獲得該酶的最適反應(yīng)pH。

溫度穩(wěn)定性：將適量稀釋純酶液于60℃下孵育，每2分鐘取樣。在最適條件下測定酶活，以初始酶活為100%，計算處理后各樣品的相對酶活，考察突變體酶的溫度穩(wěn)定性。

pH穩(wěn)定性：將適量稀釋純酶液加入到pH 3～12的緩沖溶液中（其中pH 3.0～5.0，濃度為0.05 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 11.0～12.0，濃度為0.05 mol/L的Na2HPO4-NaOH緩沖液，其余緩沖液同最適pH）于30℃下孵育1 h，然后在最適條件下測定各樣品的剩余酶活。以初始酶活為100%，計算處理后各樣品的相對酶活，考察突變體酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.5 動力學(xué)參數(shù)測定 對于底物NAD+的米氏常數(shù)Km測定，固定甲酸鈉的濃度為200 mmol/L，配制不同濃度的NAD+溶液，加入適量純酶液，在最適條件下檢測反應(yīng)初速度。同樣地，對于底物甲酸的米氏常數(shù)Km測定，固定NAD+的濃度為10 mmol/L配制不同濃度的甲酸鈉溶液，加入適量純酶液，在最適條件下檢測反應(yīng)初速度。利用Origin 8.0軟件擬合相應(yīng)測得的數(shù)據(jù)，從而獲得兩個底物的Km和kcat值。

1.2.6 圓二色譜分析 野生型酶CboFDH和突變體酶的圓二色性分析在圓二色譜儀（MOS-450/AF-CD-STP-A）上進(jìn)行。將待測樣品用超純水稀釋至質(zhì)量濃度為100 μg/mL，然后加入一個1 nm光徑的適量比色皿中，使用圓二色譜儀在光譜范圍為190～250 nm的紫外光譜區(qū)掃描蛋白質(zhì)樣品，掃描速度為120 nm/min。掃描結(jié)果在Dichroweb服務(wù)器上進(jìn)行分 析 （http：//dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）。

1.2.7 三維結(jié)構(gòu)模擬及分析 CbFDH的三維結(jié)構(gòu)PDB（5dn9）文件從RCSB數(shù)據(jù)庫獲得。使用Discovery Studio 2.5分析突變體酶的分子內(nèi)相互作用力的改變情況。利用PYMOL軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理和圖形制作。

1.2.8 L-正纈氨酸的不對稱合成 L-正纈氨酸的不對稱合成體系為25 mL的轉(zhuǎn)化體系，其中含有：濃度為20 mmol/L的2-氧代戊酸，濃度為20 mmol/L的甲酸胺，濃度為0.3 mmol/L的NAD+，體積酶活為2 U/mL的亮氨酸脫氫酶及質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的CbFDH或者是V93I。轉(zhuǎn)化條件為pH 7.5（濃度為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液），溫度為30℃，每間隔0.5小時取一次樣。底物和產(chǎn)物的濃度測定采用HPLC，具體方法參見文獻(xiàn)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點的選擇

如圖1，通過比對7種不同來源的甲酸脫氫酶，分 別 來 源 于 Glycine max、Arabidopsis thaliana、Thiobacillus sp、Mycobacterium vaccae、Ancylobacter aquaticus、Pseudomonas sp.101 和 Candida boidinii。發(fā)現(xiàn)其中來源于C.boidinii的甲酸脫氫酶（CbFDH）的第93位氨基酸殘基為纈氨酸（V）而其余6種來源的甲酸脫氫酶均為異亮氨酸（I）。同時該位點位于CbFDH的一個保守序列AGI/VGSDH區(qū)域中。有研究表明，氫質(zhì)子的轉(zhuǎn)移需要避免水分子的干擾，而FDH的催化本質(zhì)就是NAD+和甲酸離子之間的質(zhì)子轉(zhuǎn)移[4]。通過對CbFDH的PDB（5dn9）模型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，V93位點正好位于CbFDH的底物通道入口，保護(hù)著酶的催化反應(yīng)中心，見圖2。而CbFDH反應(yīng)中心入口的疏水性極有可能會影響NAD+的質(zhì)子接收及NAD+的結(jié)合，從而影響CbFDH的酶活和催化效率。因此，我們選擇對V93位點的疏水性進(jìn)行改造，設(shè)計了 4個突變體酶 V93I、V93A、V93L和V93G，其中氨基酸疏水性由大到小排序為：Ile＞Val＞Leu＞Ala＞Gly。

圖1 不同來源的甲酸脫氫酶氨基酸序列比較Fig.1 Sequences alignment of formate dehydrogenase from different bacteria

圖2 Candida Boidinii來源的甲酸脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Three-dimensional structure analysis of formate dehydrogenase from Candida boidinii

2.2 突變體酶的構(gòu)建、表達(dá)及純化

利用重疊延伸PCR獲得突變體酶基因，通過ClonExpress II One Step Cloning Kit將突變基因連接到表達(dá)載體pET28a（+）上，獲得重組質(zhì)粒pET28a-V93I、pET28a-V93L、pET28a-V93A 和pET28a-V93G，并通過PCR和測序驗證質(zhì)粒的正確性。然后將正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到E.coli BL21獲得重組菌株 E.coli BL21/pET28a-V93I、E.coli BL21/pET28a-V93L、E.coli BL21/pET28a-V93A 和E.coli BL21/pET28a-V93G。

按照1.2.2所述方法誘導(dǎo)表達(dá)，然后離心收集細(xì)胞，用超聲破碎儀破碎并離心去除細(xì)胞破碎沉淀，破碎上清液即為重組菌表達(dá)后的粗酶液。進(jìn)一步利用鎳柱純化，得到突變體酶和野生型的純酶樣品。所有樣品經(jīng)處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，見圖3。得到的突變體酶的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小為 40 300，符合 CbFDH 利用載體 pET28a（+）表達(dá)后的大小。同時可以看出，除了V93I，其余突變體酶的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度比野生型酶有所下降。進(jìn)一步對突變體酶的酶活、比酶活及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。表明突變體酶V93I的體積酶活為19.37 U/mL，比野生型提高34.7%，比酶活為6.39 U/mg，相比野生型提高22.6%。突變體酶V93A和V93相比野生型，酶活分別降低66%和92.9%，比酶活分別下降26.1%和79.8%。而V93G已經(jīng)完全失活，在之后酶學(xué)性質(zhì)研究中將不再涉及。上述結(jié)果可以看出，CbFDH酶活隨著V93位氨基酸殘基疏水性的增強(qiáng)而提高 （突變體酶V93L除外），其中V93I的酶活和比酶活均為最高，相比野生型酶更加有優(yōu)勢。

圖3 突變體酶及野生型酶純化后的蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified protein of the wild-type enzyme and its variants

表2 突變體酶的酶活及比酶活測定Table 2 Determination of enzyme activity and specific activity of mutant enzyme

2.3 突變體酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

對甲酸脫氫酶野生型及其突變體酶的最適pH進(jìn)行研究，結(jié)果見圖4。表明突變體酶V93I的最適pH與野生型保持一致，均為9，而突變體酶V93A、V93L最適pH為7。

圖4 突變體酶和野生型酶的最適pHFig.4 Optimal pH of the wild-type enzyme and its variants

同時對甲酸脫氫酶野生型及其突變體的最適溫度進(jìn)行研究，結(jié)果見圖5。突變體酶V93I與V93A的最適溫度與野生型酶相同，均為45℃，而突變體酶V93L的最適溫度有所下降，為40℃。

圖5 突變體酶和野生型酶的最適反應(yīng)溫度Fig.5 Optimal temperature of the wild-type enzyme and its variants

將突變體酶和野生型CbFDH孵育在不同pH溶液中1 h后，在最佳條件下測定殘余酶活來研究突變體酶的pH穩(wěn)定性。突變體酶V93I在酸性和堿性條件下的pH穩(wěn)定性強(qiáng)于野生型，而另外兩個突變體酶V93A和V93L則稍微有些下降，特別是V93L在堿性條件下穩(wěn)定性下降的幅度相對較大，見圖6。

圖6 突變體酶和野生型酶pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of the wild-type enzyme and its variants

由于甲酸脫氫酶在55℃下比較穩(wěn)定，24 h內(nèi)基本不失活[13]，因此為了在最短的時間能確定突變體酶的穩(wěn)定性是否提高，我們在60℃下測定野生型酶及其突變體酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖7。除了突變體酶V93A的熱穩(wěn)定性相比野生型略強(qiáng)外，其他兩個突變體的熱穩(wěn)定性則有所下降，但是不是特別明顯。

圖7 突變體酶和野生型酶的溫度穩(wěn)定性Fig.7 Thermostability of the wild-type enzyme and its variants

2.4 圓二色譜分析突變前后CbFDH二級結(jié)構(gòu)

利用圓二色譜分析檢測突變體酶和野生型酶，比較突變體酶的二級結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，結(jié)果見圖8。野生型酶及其突變體酶的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜（190～250 nm）基本一致，同時將圓二色譜數(shù)據(jù)提交到在線服務(wù)（Dichroweb server）分析，結(jié)果表明突變體酶的二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲等）均未發(fā)生明顯變化，說明V93位點突變基本不會對CbFDH的二級結(jié)構(gòu)造成影響。

圖8 突變體酶和野生型酶的圓二色譜分析Fig.8 Circular dichroism （CD） analysis of wild-type enzyme and its variants

2.5 突變體酶動力學(xué)參數(shù)分析

甲酸脫氫酶及其突變體酶的米氏動力學(xué)參數(shù)測定，結(jié)果見表3。突變體酶V93A和V93I對NAD+的Km值相比野生型基本沒有發(fā)生變化，而突變體酶V93L對NAD+的Km值則比野生型高3倍左右，說明V93L對底物NAD+的親和力明顯下降。而對于甲酸的Km值，突變體酶V93I和V93L變化不大，而突變體酶V93A卻比野生型高8倍左右，說明其對底物甲酸的親和力明顯下降。相比之下，突變體酶V93I對NAD+的催化效率是野生型酶的2.33倍 （即提高了133%），說明突變體酶V93I相比野生型和其他突變體更加具有優(yōu)勢。

表3 突變體酶和野生型酶的動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetics analysis of the wild-type enzyme and its variants

2.6 突變體酶三維結(jié)構(gòu)分析

根據(jù) CbFDH 的三維結(jié)構(gòu)（PDB：5dn9），利用軟件將其對應(yīng)的V93進(jìn)行突變，獲得相關(guān)突變體酶的三維模型，然后對這些模型的突變位點進(jìn)行分析，由于突變的氨基酸殘基側(cè)鏈變化的是甲基基團(tuán)的增減，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)突變沒有引起相關(guān)氫鍵和離子鍵的變化。酶活測定表明，突變體酶的酶活隨著第93位氨基酸殘基疏水性的增強(qiáng)而提高，而突變體酶V93L的活性反而下降。由圖9（c）可以看出，突變體酶V93L的第93位Leu的γ-碳原子上的兩個甲基基團(tuán)空間位阻過大，阻礙了NAD+的結(jié)合，進(jìn)而造成該突變體酶對NAD+的親和力明顯下降，從而也導(dǎo)致酶活下降。而對于突變體酶 V93A（圖 9（d）），由于第93位氨基酸側(cè)鏈甲基的減少，使得反應(yīng)中的疏水保護(hù)下降，可能影響了反應(yīng)中心的氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致對甲酸的親和力下降，進(jìn)一步酶活也隨之降低。對于正向突變體酶V93I，如圖9（b）所示，可以看出其第93位氨基酸的γ-碳原子相比野生型酶（圖9（a））多了一個甲基基團(tuán)，該基團(tuán)位于這個位置不僅使得底物通道入口的連接更加堅固，同時也進(jìn)一步加強(qiáng)了反應(yīng)中心的疏水性，這可能是該酶催化效率和酶活提高的主要原因。

結(jié)合酶學(xué)性質(zhì)中的最適pH、最適溫度以及穩(wěn)定性研究表明，第93位氨基酸的變化主要是影響到酶對底物NAD+的結(jié)合能力和酶反應(yīng)中心疏水環(huán)境的強(qiáng)弱，從而使得酶活和相應(yīng)動力學(xué)參數(shù)發(fā)生改變，而對其他性質(zhì)影響不大。

圖9 突變體酶及野生型酶三維結(jié)構(gòu)分析Fig.9 There-dimensional structure analysis of wild-type enzyme and its variants

2.7 突變體酶用于L-正纈氨酸的不對稱合成

由于突變體酶V93I的酶活和催化效率都比野生型CbFDH高，因此為了進(jìn)一步探索突變體酶V93I在應(yīng)用上是否也比野生型CbFDH更有優(yōu)勢，我們利用不對稱還原2-氧代戊酸合成L-正纈氨酸體系來進(jìn)行驗證，結(jié)果見圖10。在突變體酶V93I作為輔酶的情況下 （其他條件都一樣），濃度為20 mmol/L的底物2-氧代戊酸完全轉(zhuǎn)化時間由原來野生型酶的2 h縮短到了1.5 h，說明突變體酶V93I在輔酶NADH再生方面的能力確實比野生型酶CbFDH強(qiáng)，有待進(jìn)一挖掘使用。

圖10 突變體酶V93I和野生型酶作為輔酶再生酶用于L-正纈氨酸的不對稱合成Fig.10 Asymmetric synthesis of L-norvaline using mutant enzyme V93I and wild-type enzyme for NADH regeneration

3 結(jié) 語

作者通過定點突變對野生型酶CbFDH底物通道入口的氨基酸殘基位點(V93位點)的疏水性進(jìn)行改造，獲得的最佳突變體酶V93I的比酶活提高22.6%、催化效率(NAD+)提高了133%。在應(yīng)用于L-正纈氨酸不對稱合成的轉(zhuǎn)化體系中，相比野生型酶CbFDH，同等條件下的突變體酶V93I能夠提高體系的轉(zhuǎn)化效率、縮短底物完全轉(zhuǎn)化的時間，具有較強(qiáng)的開發(fā)和應(yīng)用潛力。