高 懸，鄒建中*，蔣冰蕾，徐 蝶，羅 勇，

(1.重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學工程學重點實驗室 重慶微無創(chuàng)醫(yī)學協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所，重慶 400010)

HIFU已廣泛用于治療實體腫瘤。由于超聲波在傳播過程中能量衰減較大，當腫瘤體積較大或其位置深在時，HIFU療效會受到較大影響[1]。在靶區(qū)引入碘油、微泡等物質(zhì)，可通過改變組織的聲環(huán)境來增強HIFU消融效果；但這些物質(zhì)的靶向性不強，在腫瘤及其周圍組織器官內(nèi)均存在，輻照時易導致聲通道組織損傷[2-5]。近年來，研發(fā)體內(nèi)滯留時間長且靶向性強的HIFU增效劑逐漸受到關(guān)注。本研究探討HIFU生物靶向增效的可行性，以雙歧桿菌[5-7]作為載體，聯(lián)合包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒，觀察其增強HIFU消融的效果。

1 材料與方法

1.1 雙歧桿菌培養(yǎng)及鏡下觀察 將長雙歧桿菌ATCC15707(重慶醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系提供)于37℃、厭氧條件下，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，4℃條件下以1 000 r/min離心10 min。將細菌濃度調(diào)整至6×107/ml備用。革蘭氏染色后于光學顯微鏡下觀察雙歧桿菌形態(tài)，并采用Malvern ZEN3600型分析儀測量其表面電位。

1.2 包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒制備及鏡下觀察 將二棕櫚?；蚜字?1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine， DPPC；Avanti公司)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-氨基{1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG2000-Amine；Avanti公司}、膽固醇鹽酸鹽(DC-cholesterol hydrochloride， DC-CHOL；Avanti公司)按5∶2∶2的比例溶于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑成膜，加入雙蒸水洗脫后，滴加100 μl液態(tài)氟碳全氟己烷(perfluorohexanes， PFH；沸點56℃)，均質(zhì)乳化后獲得包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒，4℃保存?zhèn)溆?。于光學顯微鏡下觀察陽離子脂質(zhì)納米粒形態(tài)，并采用Malvern ZEN3600型分析儀測量其粒徑及表面電位。

1.3 雙歧桿菌與陽離子脂質(zhì)納米粒體外連接 將100 μl綠色熒光染料異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)標記的雙歧桿菌(濃度1×106/ml)加入300 μl紅色熒光染料細胞膜紅色熒光探針(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate， DiI)標記的陽離子脂質(zhì)納米粒(濃度1 mg/ml)中，孵育10 min后，稀釋200倍備用。采用Nikon A1R型激光共聚焦顯微鏡觀察雙歧桿菌與陽離子脂質(zhì)納米粒的連接情況，以CytoFLEX PN B49007AD型流式細胞儀檢測連接率。

1.4 建立荷瘤鼠模型 選取4周齡雌性BALB/c裸鼠48只(重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物實驗審查批準號：CQLA-2016-406)，體質(zhì)量18～24 g，平均(21.14±2.04)g。將0.2 ml培養(yǎng)至對數(shù)生長期的濃度調(diào)為4×106/ml的人乳腺癌MDA-MB231細胞(重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所提供)接種于每只裸鼠左側(cè)臀部皮下，之后常規(guī)飼養(yǎng)，待瘤體最大徑達0.8 cm時用于后續(xù)實驗。

1.5 HIFU輻照

1.5.1 分組處理 選取48只荷瘤鼠隨機均分為A組[磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)組]、B組(雙歧桿菌組)、C組(陽離子脂質(zhì)納米粒組)和D組(雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組)，每組12只。首先對A、C組荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2 ml PBS，B、D組荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2 ml雙歧桿菌(濃度1×106/ml)；而后于首次注射后72 h，對A、B組再注射0.2 ml PBS，C、D組再注射0.2 ml陽離子脂質(zhì)納米粒(濃度0.1 mg/ml)。

1.5.2 HIFU輻照及評價 采用海扶JC200型聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)，于第2次注射完成后24 h在超聲監(jiān)控下行HIFU輻照。消融參數(shù)：治療頭頻率0.94 MHz，焦距145 mm，換能器直徑220 mm；輻照方式為點輻照，功率150 W，輻照時間2 s。輻照后即刻，通過聲像圖觀察荷瘤鼠腫瘤組織灰度變化，與輻照前對照，系統(tǒng)自動測得灰度變化值。

1.6 組織學觀察 HIFU輻照前1 h，從各組中各隨機選取2只處死，完整剝離腫瘤并摘取荷瘤鼠心、肝、脾、肺、腎組織，以4%多聚甲醛固定，革蘭氏染色后于光學顯微鏡下觀察腫瘤組織及重要臟器中雙歧桿菌的生長情況，驗證雙歧桿菌的腫瘤靶向性。HIFU輻照后1天，將荷瘤鼠全部處死，完整剝離腫瘤后，沿最大面切開，用2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride， TTC)染色，肉眼觀察其大體組織學情況，并測算各組荷瘤鼠腫瘤組織凝固性壞死體積和HIFU消融能效因子(energy efficiency factor， EEF)。凝固性壞死體積(mm3)=(π/6)×長度(mm)×寬度(mm)×深度(mm)，EEF(J/mm3)=聲功率(W)×輻照時間(s)/凝固性壞死體積(mm3)。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 雙歧桿菌和陽離子脂質(zhì)納米粒的表征 雙歧桿菌革蘭氏染色呈藍紫色的長棒狀(圖1A)，表面電位為-29 mV(圖1B)。陽離子脂質(zhì)納米粒呈球形，分布均勻(圖2A)，粒徑220～340 nm，平均(280.21±60.20)nm(圖2B)，表面電位為25 mV(圖2C)。

圖1 雙歧桿菌表征 A.光學顯微鏡下觀察(革蘭染色，×400)； B.表面電位檢測圖2 包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒表征 A.光學顯微鏡下觀察(×400)； B.粒徑檢測； C.表面電位檢測

2.2 體外連接情況 雙歧桿菌與陽離子脂質(zhì)納米粒體外連接后，激光共聚焦顯微鏡下可見FITC標記的雙歧桿菌表面附著大量被DiI標記的陽離子脂質(zhì)納米粒(圖3)。流式細胞儀檢測其連接率為99.9%(圖4)。

2.3 HIFU消融效果

2.3.1 灰度變化值 HIFU輻照后，4組荷瘤鼠腫瘤組織聲像圖均可見不同程度灰度變化(圖5)。各組間灰度變化值差異有統(tǒng)計學意義(F=143.40，P<0.001，表1)，A組

2.3.2 凝固性壞死體積 HIFU輻照后，4組荷瘤鼠腫瘤組織內(nèi)均可見凝固性壞死，壞死區(qū)呈灰白色，而未壞死區(qū)切面呈紅色(圖6)。各組間凝固性壞死體積差異有統(tǒng)計學意義(F=243.20，P<0.001，表1)，A組

表1 各組荷瘤鼠腫瘤組織灰度變化值、EEF及凝固性壞死體積(±s)

表1 各組荷瘤鼠腫瘤組織灰度變化值、EEF及凝固性壞死體積(±s)

組別灰度變化值凝固性壞死體積(mm3)EEF(J/mm3)A組10.44±2.7437.48±7.13816.62±3.65B組18.78±3.5348.91±7.4512.57±2.19C組26.44±3.7173.62±8.588.26±1.04D組43.33±3.94131.60±10.464.59±0.40F值143.40243.2056.33P值<0.001<0.001<0.001

注：A組：PBS組；B組：雙歧桿菌組；C組：陽離子脂質(zhì)納米粒組；D組：雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組

2.3.3 EEF 各組間EEF差異有統(tǒng)計學意義(F=56.33，P<0.001，表1)，A組>B組>C組>D組，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05，表2)。

2.3.4 靶向性 4組荷瘤鼠心、肝、脾、肺、腎組織中均無雙歧桿菌生長；A、C組腫瘤組織中無雙歧桿菌，B、D組腫瘤組織中可見大量雙歧桿菌(圖7)。

3 討論

微泡、羥基磷灰石納米復合物等現(xiàn)有HIFU增效劑存在靶向性不強的問題，對HIFU消融增效有限；目前仍在不斷探索，以提升HIFU消融效率。本研究利用雙歧桿菌能夠靶向腫瘤乏氧區(qū)的特性，將其與具有HIFU增效作用的包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒相結(jié)合，克服了傳統(tǒng)HIFU增效劑靶向性不強的問題。本研究結(jié)果顯示，表面帶有負電荷的雙歧桿菌與陽離子脂質(zhì)納米粒在體外可通過靜電吸附的方式有效連接，連接率達99.9%。本研究中C組荷瘤鼠HIFU輻照后腫瘤組織灰度變化值及凝固性壞死體積均明顯高于A組(P均<0.001)，表明包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒具有增效HIFU的作用，與周洋等[8]研究結(jié)果相符；此外，D組灰度變化值及凝固性壞死體積均明顯高于C組(P均<0.001)，分析其原因：①雙歧桿菌增殖可能改變了腫瘤組織局部聲環(huán)境，使超聲能量沉積增加，進而增強HIFU消融腫瘤效果；②包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒在腫瘤中的滯留量增加，增強了HIFU消融腫瘤的效果。腫瘤組織中陽離子脂質(zhì)納米粒滯留量增加的原因可能包括：①雙歧桿菌在腫瘤組織中生長72 h后，通過靜電吸附作用可連接數(shù)量較多陽離子脂質(zhì)納米粒；②雙歧桿菌在腫瘤組織中增殖，不僅可提高巨噬細胞的吞噬功能，還能通過提高局部一氧化氮水平而增強滯留效應(enhanced permeability and retention effect， EPR)效應和腫瘤血管通透性[9-11]，使陽離子脂質(zhì)納米?！奥┤搿蹦[瘤組織中的數(shù)量增多。

表2 荷瘤鼠腫瘤組織灰度變化值、EEF及凝固性壞死體積組間兩兩比較的P值

注：A組：PBS組；B組：雙歧桿菌組；C組：陽離子脂質(zhì)納米粒組；D組：雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組

圖5 HIFU輻照后各組荷瘤鼠腫瘤組織聲像圖 A.A組(PBS組)； B.B組(雙歧桿菌組)； C.C組(陽離子脂質(zhì)納米粒組)； D.D組(雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組)

圖6 HIFU輻照后各組荷瘤鼠腫瘤組織大體病理圖，箭示凝固性壞死 A.A組(PBS組)； B.B組(雙歧桿菌組)； C.C組(陽離子脂質(zhì)納米粒組)； D.D組(雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組)

圖7 雙歧桿菌的腫瘤靶向性(革蘭染色，×400)，箭示雙歧桿菌 A.A組(PBS組)； B.B組(雙歧桿菌組)； C.C組(陽離子脂質(zhì)納米粒組)； D.D組(雙歧桿菌+陽離子脂質(zhì)納米粒組)

此外，EEF也可反映HIFU消融腫瘤的效果，EEF越小，表明消融效果越強，本研究中D組EEF明顯低于其他各組(P均<0.05)。

本研究通過動物實驗證實，雙歧桿菌聯(lián)合包裹液態(tài)氟碳的陽離子脂質(zhì)納米粒具有增效HIFU消融腫瘤的作用；但本研究為初步探索，具體機制有待進一步研究。