楊宇澤，侯卓成，常 卓，張 權(quán)

（1.北京市畜牧總站，北京 100101；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，北京 100193；3.廣東海洋大學農(nóng)學院，廣東湛江 524088）

地方鴨品種的遺傳多樣性十分豐富，是品種改良的遺傳基礎(chǔ)和原始素材。其中，北京鴨是我國優(yōu)良的地方品種，是世界水禽業(yè)中優(yōu)勢最大的品種之一，具有生長速度快、肉質(zhì)細嫩、繁殖力高、適應性強、適合圈養(yǎng)等優(yōu)點[1]，成為其保種的重要原因。因此，研究北京鴨群體遺傳結(jié)構(gòu)可為其保種及定向選育或遺傳改良提供重要依據(jù)。

微衛(wèi)星標記具有DNA 多態(tài)性雜合程度高、共顯性遺傳、易于鑒定、檢測重復性好等特點，在生物體整個基因組中廣泛分布[2]。微衛(wèi)星標記遺傳多態(tài)性能充分反映品種進化歷史[3]，廣泛應用于畜禽品種的遺傳多樣性研究。任康等[4]采用微衛(wèi)星標記研究了北京鴨群體遺傳多樣性。劉宏祥等[5]利用微衛(wèi)星標記分析表明，馬踏湖鴨、金定鴨和巢湖鴨3 個鴨群體存在明顯的遺傳差異。趙東偉等[6]利用微衛(wèi)星標記分析表明，徐海雞3個世代群體的遺傳多樣性豐富并保持了較好的遺傳穩(wěn)定性。于波[7]利用微衛(wèi)星標記分析得出，北京鴨微衛(wèi)星位點多態(tài)性與開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重和300 日齡產(chǎn)蛋量等產(chǎn)蛋性狀相關(guān)。由此可見，利用微衛(wèi)星標記技術(shù)在雞、鴨等家禽品種群體遺傳多樣性及其與生產(chǎn)性能的相關(guān)性研究中取得了許多有價值的研究成果。本研究選擇遺傳多樣性較為豐富的11 對微衛(wèi)星位點來分析北京鴨保種群體3 個世代的遺傳多樣性，旨在為北京鴨保種群體的遺傳資源保護及進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗動物由北京鴨保種場提供，分別采集F0、F1和F2世代北京鴨血樣120、100 只和100 只。3 個世代群體公母比例為1∶1。翅靜脈采集1 mL 血液，置于含有0.1 mL EDTA 抗凝劑的離心管中，混勻后置于-20℃低溫保存。

1.2 微衛(wèi)星引物 采用聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）和國際動物遺傳學會（ISAG）推薦的11 對微衛(wèi)星標記和引物序列用于北京鴨遺傳多樣性分析（表1）。為實現(xiàn)微衛(wèi)星多態(tài)性熒光半自動檢測，對11 對微衛(wèi)星上游引物進行HEX 和FAM 熒光修飾，ROX 為分子量內(nèi)標。微衛(wèi)星座位11 對熒光標記引物由北京閱微基因技術(shù)有限公司合成。

1.3 鴨血液DNA 提取與檢測 按照天根血液基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型，貨號：DP318-03）的提取步驟提取。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 樣本。

1.4 熒光標記多重PCR 擴增 根據(jù)熒光標記引物的顏色、擴增產(chǎn)物及退火溫度，對引物選擇組合，每組引物數(shù)量為2～4 對，對北京鴨DNA 樣本進行PCR 擴增。PCR 反應體系（15 μL）：10×BufferI 1.5 μL，2.5 mmol/L d NTP 1.2 μL，F(xiàn)-Primer（5 μmol/L）0.8 μL，R-Primer（5 μmol/L）0.8 μL，TaKaRa HSTaq 0.1 μL，DNA 模板 1.2 μL，ddH2O 補齊至15 μL。PCR 反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，50～60℃（表1）退火30 s，72℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.5 微衛(wèi)星基因掃描 選取1 μL PCR 產(chǎn)物、8.5 μL 甲酰胺和0.5 μL ROX-500 分子量內(nèi)標，3 000 r/min 離心1 min，95℃變性5 min，置于冰上10 min，離心后用ABI 3730XL DNA analyzer 進行基因掃描使用Genotyper3.7 軟件分析基因分型數(shù)據(jù)，標定DNA 擴增片段大小和基因型。

1.6 統(tǒng)計分析 根據(jù)PopGen32 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析[4]。計算等位基因/ 有效等位基因數(shù)量（Na/Ne）、等位基因頻率（allele frequency）、群體期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、Hardy-Weinberg 平衡檢驗、F 統(tǒng)計量，picale 軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）。采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 血液DNA 檢測結(jié)果 提取的DNA 樣品檢測結(jié)果（圖1）顯示，DNA 純度和亮度都比較高，無拖尾現(xiàn)象，可以滿足后續(xù)試驗要求。

圖1 部分北京鴨血液DNA 樣品檢測結(jié)果

2.2 PCR 產(chǎn)物檢測 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測結(jié)果滿足后續(xù)實驗條件（圖2）。PCR 產(chǎn)物在ABI 3730XL DNA analyzer 測序后基因分型如圖3 所示。各峰圖表示北京鴨微衛(wèi)星位點等位基因的大小及基因型。

2.3 北京鴨群體的遺傳多態(tài)性 表2 顯示，北京鴨群體11 個微衛(wèi)星座位Ne 的變化范圍為1.129 3～4.806 0，其中微衛(wèi)星座位CMO12 的Ne 最多（4.806 0），微衛(wèi)星座位SMO13 最少（1.129 3）。F0、F1和F2世代平均Ne分別為2.249 3、1.927 8 和2.177 4，3 個世代間的Na/Ne 差異不顯著。北京鴨群體11 個微衛(wèi)星座位PIC 較高，平均值為0.508 0。其中，微衛(wèi)星位點CMO12PIC 最高，達到0.758 7。北京鴨群體3 個世代的PIC 平均值以F0世代最高（0.441 3），F(xiàn)1世代最低（0.303 8），3 個世代間差異不顯著。

表1 微衛(wèi)星座位相關(guān)信息

圖2 部分微衛(wèi)星位點PCR 結(jié)果

圖3 部分微衛(wèi)星位點STR 分型峰圖

由表3 可知，北京鴨群體3 個世代的遺傳雜合度為0.432 3，微衛(wèi)星座位CMO11 的遺傳雜合度最高（0.700 9），微衛(wèi)星座位SMO13 最低（0.107 3）。北京鴨群體3 個世代的平均Ho 以F1世代最低（0.324 5），F(xiàn)2世代最高（0.444 6），3 個世代間差異不顯著；北京鴨群體3個世代的平均He 以F1世代最低（0.363 3），F(xiàn)0世代最高（0.487 7），3 個世代間差異不顯著。

2.4 北京鴨群體遺傳結(jié)構(gòu)檢驗（Hardy-Weinberg 平衡檢驗） 由表4 可見，北京鴨群體多數(shù)微衛(wèi)星座位偏離Hardy-Weinberg 平衡檢驗（P＜0.05），只有微衛(wèi)星座位APL78 處于平衡狀態(tài)（P＞0.05）。F0世代微衛(wèi)星座位APL36、APL78、APH10 和SMO11 等4 個 位 點 處于平衡狀態(tài)（P＞0.05）；F1世代微衛(wèi)星座位APH01、CMO11、APH78、APH10 和SMO13 等5 個位點處于平衡狀態(tài)（P＞0.05）；F2世代微衛(wèi)星座位APH01、APL36、SMO6、SMO7、APL78 等5 個位點處于平衡狀態(tài)（P＞0.05）。北京鴨F0、F1和F2群體在11 個微衛(wèi)星位點中均有50%以上的位點偏離Hardy-Weinberg 遺傳平衡，說明在北京鴨3 個世代群體內(nèi)存在較大的遺傳變異。

表2 北京鴨品種微衛(wèi)星座位等位基因數(shù)量與多態(tài)信息含量

表3 北京鴨品種微衛(wèi)星座位的雜合度

表4 北京鴨群體Hardy-Weinberg 平衡檢驗

2.5 北京鴨群體3 個世代間的遺傳分化（F 統(tǒng)計量檢驗） 由表5 可見，北京鴨群體3 個世代的群體內(nèi)近交系數(shù)（Fis）平均值為0.086 9，總體近交系數(shù)（Fit）平均值為0.279 7，群體間基因分化系數(shù)（Fst）平均值為0.211 1。微衛(wèi)星座位的基因流（Nm）變化范圍從微衛(wèi)星座位APH10 的0.250 2 到微衛(wèi)星座位APL78 的24.984 2，平均值為0.934 1。

3 討 論

家禽微衛(wèi)星標記位點等位基因數(shù)一般為2～20 個，大部分為2～7 個。PIC 和遺傳雜合度是衡量微衛(wèi)星基因座變異程度高低的指標，當PIC＞0.5 時，該基因座為高度多態(tài)性基因；當0.25＜PIC＜0.5 時，該基因座為中度多態(tài)，基因座能提供較為合理的信息；當PIC＜0.25，為低度多態(tài)性基因座，基因座可提供的信息較差；遺傳雜合度＞0.5 時，表明該群體沒有受到高強度的選擇，擁有豐富的遺傳多樣性；若遺傳雜合度＜0.5 時，表明該群體遺傳多樣性較低[3,8]。本實驗結(jié)果表明，11 個微衛(wèi)星位點在北京鴨群體F0世代平均Na/Ne 數(shù)量為4.6/2.249 4 個，F(xiàn)1世代為3.5/1.927 8 個，F(xiàn)2世代為4.5/2.177 4 個，每個微衛(wèi)星座位檢測到Na 為2～7 個，平均Na/Ne 數(shù)量為4.9/2.812 6 個，檢測到的Na 均高于Ne，說明等位基因分布不均勻，可能是由近交導致。北京鴨群體F0世代11個微衛(wèi)星座位測得的平均He 和平均PIC 分別為0.487 7、0.441 3；F1世代分別為0.363 3 和0.308 8；F2世代分別為0.415 0 和0.454 2，說明北京鴨群體具有較為豐富的遺傳多樣性。任康等[4]利用23 個微衛(wèi)星位點對北京鴨群體進行分析得出群體平均Na/Ne、PIC 和He 分別為8.5/3、0.525 和0.551。張揚等[9]利用12 個微衛(wèi)星位點對鳳頭白鴨和連城白鴨群體分析得出，鳳頭白鴨群體平均Na/Ne、He 和PIC 分別為5.42/2.86、0.54 和0.50，連城白鴨群體平均Na/Ne、He 和PIC 分別為3.83/2.24、0.48 和0.35。趙麗麗等[10]利用17 個微衛(wèi)星位點對金定鴨群體分析得出群體平均He 和PIC 分別為0.581 6和0.596 7。龔道清等[11]利用9 個微衛(wèi)星位點對高郵鴨群體分析得出群體平均Na、遺傳雜合度和PIC 分別為4.7、0.737 5 和0.670 7。微衛(wèi)星標記數(shù)量[12]、樣本量和性比影響微衛(wèi)星分析中的群體遺傳多樣性指標，He受樣本量變動的影響較小，可作為度量群體遺傳多樣性的一個最適參數(shù)[13]。本研究中，北京鴨群體3 個世代平均He 分別為0.487 7、0.363 3 和0.454 2，低于其他地方品種鴨，這可能與微衛(wèi)星標記數(shù)量、地方品種鴨保種及選育程度有關(guān)。北京鴨群體F1世代的平均He 和平均PIC 低于F0和F2世代，但3 個世代鴨群的Na/Ne、He、PIC 差異均不顯著，F(xiàn)1世代可能是群體基因頻率的隨機遺傳漂變導致遺傳多樣性降低。

表5 北京鴨群體3 個世代遺傳分化程度統(tǒng)計量

群體遺傳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是通過Hardy-Weinberg 平衡定律衡量。Hardy-Weinberg 平衡定律主要是在一個隨機交配的大群體中，除去選擇、突變和遷移等因素的影響，存在于常染色體上的等位基因頻率和基因型頻率隨世代的延續(xù)而應保持不變。本研究對所檢測的北京鴨群體3 個世代進行Hardy-Weinberg 平衡檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在11 個微衛(wèi)星座位上，F(xiàn)0、F1和F2世代分別有4、5、5 個微衛(wèi)星座位處于平衡狀態(tài)，其余位點顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡，這種偏離可能是這些位點與北京鴨重要經(jīng)濟性狀的基因之間連鎖較緊密。

本研究利用F-統(tǒng)計量來測量群體間遺傳分化程度，主要包括Fis、Fit 和Fst。Fis 和Fit 分別表示個體相對于它所在的亞群體和總?cè)后w的近交系數(shù)。Fis=0 表示配對方式為隨機配對；Fis＞0 表示近親交配；Fis＜0 表示異配生殖。本研究結(jié)果表明，北京鴨群體11 個微衛(wèi)星座位上的Fis 為0.086 9，F(xiàn)is 為0.279 7，說明北京鴨群體在每個世代內(nèi)的近交程度較低，但3 個世代間可能有近交現(xiàn)象。Fis 數(shù)值正負反映群體內(nèi)Ho 和He 之間的平衡關(guān)系，其值大小表明群體中雜合子缺失或過剩程度[9]。本研究中，北京鴨群體微衛(wèi)星位點APL36、APL78 和CMO11 3 個位點的Fis＜0，表明這些位點中的雜合子過剩，優(yōu)勢等位基因頻率降低。Fis 是反映各亞群體內(nèi)平均遺傳雜合度與總?cè)后w遺傳雜合度的差異程度，其值越大，表明各亞群體間遺傳分化越明顯[14]。本研究中，11 個微衛(wèi)星基因座Fis 平均值為0.211 1，表明北京鴨群體遺傳分化程度較低，群體中21.11%的遺傳變異由群體間的遺傳變異引起，78.89% 的遺傳變異由群體內(nèi)的個體差異引起。Nm 是阻止種群遺傳分化的重要進化因子[15]，也是影響遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素。當N m＜1 時，遺傳漂變是區(qū)分種群遺傳結(jié)構(gòu)的主導因素[16]。本研究結(jié)果表明，檢測的北京鴨群體微衛(wèi)星座位APH01、APH10、APL36和SMO7 的基因流均小于1，北京鴨群體間平均基因流為0.934 1，說明北京鴨群體可能有遺傳漂變的因素導致群體遺傳分化。

4 結(jié) 論

北京鴨群體具有較豐富的遺傳多樣性，保持了北京鴨群體的遺傳穩(wěn)定性。每個世代北京鴨個體近交程度較低，但在世代間近交程度逐漸加強，世代間平均基因流小于1，遺傳分化程度低，遺傳漂變是影響北京鴨群體遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素。