初美靜,2，宮子惠,2，孫紀(jì)霞，張英杰，張京偉，郭文姣，房義福3，劉學(xué)慶

(1.煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 265500； 2.煙臺(tái)大學(xué)，山東 煙臺(tái) 264005；3.山東省林業(yè)科學(xué)研究院 園林花卉所，山東 濟(jì)南 250014)

蘭科是被子植物中進(jìn)化完全的類(lèi)群，其花部的結(jié)構(gòu)特征與昆蟲(chóng)傳粉有著極高的適應(yīng)性，傳粉方式多樣，因此，對(duì)蘭科植物的傳粉生物學(xué)研究有著廣闊的前景[1]。目前關(guān)于蘭科的傳粉生物學(xué)研究見(jiàn)于大序隔距蘭[2]、多葉斑葉蘭[3]、澤瀉蝦脊蘭[4]、春蘭[5]等。兜蘭屬(Paphiopedilum)植物隸屬蘭科(Orchidaceae)中最為原始，最具特色的類(lèi)群[6-7]，因其唇瓣呈高度特化的兜狀，故名兜蘭，又因形似拖鞋，故俗稱(chēng)拖鞋蘭、仙履蘭[8]。兜蘭屬的所有植物都可用于觀賞，經(jīng)過(guò)選育產(chǎn)生的栽培種和雜交種形態(tài)各異，具有極高的商業(yè)價(jià)值[9]。目前對(duì)兜蘭的研究大多集中在種質(zhì)資源保護(hù)[10]、無(wú)菌萌發(fā)[11-14]、綜合評(píng)價(jià)[15-16]、生產(chǎn)栽培[17-18]、葉片結(jié)構(gòu)[19-21]等方面，肉餅兜蘭的傳粉生物學(xué)研究未見(jiàn)報(bào)道，因此，本次試驗(yàn)主要針對(duì)肉餅兜蘭開(kāi)展研究，觀察其開(kāi)花進(jìn)程，檢測(cè)它的花粉胚珠比率與胚珠種子比率，探究其生長(zhǎng)周期與傳粉結(jié)實(shí)率，以期為肉餅兜蘭的花期調(diào)控與傳粉受精等提供參考。

圖1 綠肉餅兜蘭

1 材料與方法

1.1 研究植物與地點(diǎn)

本次試驗(yàn)開(kāi)展于山東省煙臺(tái)市福山區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花卉種植基地兜蘭種植區(qū)，所用綠肉餅兜蘭(Paphiopedilumpacific Cocoa Lovely)和紅肉餅兜蘭(P. pacific In-Charm Circle)取自兜蘭種植區(qū)。

1.2 花形態(tài)特征與開(kāi)花進(jìn)程觀察

1.2.1花形態(tài)觀察

取正在開(kāi)花的紅肉餅兜蘭與綠肉餅兜蘭各20株，觀察花葶長(zhǎng)度、顏色，花朵數(shù)量、直徑、顏色。

1.2.2開(kāi)花進(jìn)程觀察

選取葉片健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的紅肉餅兜蘭與綠肉餅兜蘭各20株，從花葶抽出開(kāi)始，每隔3 d觀察1次，待花苞開(kāi)始展開(kāi)時(shí)，每天觀察兜蘭開(kāi)花狀態(tài)，直至整朵花序完全綻開(kāi)，測(cè)量記錄花葶高度，花葶粗度，花徑。

1.3 開(kāi)花生物學(xué)特性檢測(cè)

1.3.1花粉量、種子數(shù)、胚珠數(shù)測(cè)定

選取即將開(kāi)放(花藥未開(kāi)裂)的紅肉餅兜蘭和綠肉餅兜蘭各10株，將花藥均勻涂抹于載玻片上，在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)視野中的花粉數(shù)，取其平均數(shù)，計(jì)算出每個(gè)花藥中的花粉數(shù)(花粉涂抹的面積×平均數(shù)/視野面積)，將每朵花的子房在解剖鏡下切開(kāi)觀察，統(tǒng)計(jì)出子房中的胚珠數(shù)；隨機(jī)選出10個(gè)即將成熟的果實(shí)，在解剖鏡下切開(kāi)觀察，統(tǒng)計(jì)數(shù)果實(shí)中的種子數(shù)，計(jì)算花粉胚珠比率(花藥中的花粉數(shù)/子房中的胚珠數(shù))和胚珠種子比率(胚珠平均數(shù)/種子平均數(shù))。

1.3.2花粉組織學(xué)檢測(cè)

隨機(jī)挑選紅肉餅兜蘭和綠肉餅兜蘭各10株，取其花粉，均勻涂抹于載玻片上，浸入蘇丹Ⅲ染液中片刻，取出在顯微鏡下觀察，若花粉呈橘黃色，則證明花粉中存在脂質(zhì)[22]，每朵花重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 花形態(tài)特征

肉餅兜蘭是波瓣兜蘭和紫毛兜蘭雜交形成的后代，花大圓潤(rùn)、質(zhì)地較厚[23]，色澤艷麗，一般為黃綠色和紅色2類(lèi)[24]。

黃綠色肉餅兜蘭：花葶一般為綠色或帶紅色絨毛，每朵花序一般只開(kāi)1朵花，極少數(shù)開(kāi)2朵，中萼片、花瓣及唇瓣主色多為黃綠色、有的帶有白色花邊或紫紅色條紋(見(jiàn)圖1)，花葶高6～19 cm，直徑0.3～0.6 cm，花徑為7～13 cm。

紅色肉餅兜蘭：花葶紫紅色帶紫紅色絨毛，每朵花序一般只開(kāi)1朵花，極少數(shù)開(kāi)2朵，中萼片色澤變化多樣、通常為紫紅色，邊緣白色、帶有暗紅色斑點(diǎn)、少數(shù)呈現(xiàn)綠色；花瓣通常為深紅色，邊緣黃色，唇瓣一般為紅色(見(jiàn)圖2)?；ㄝ愀?～17 cm，直徑0.3～0.6 cm，花徑為7～10 cm。

2.2 開(kāi)花進(jìn)程觀察

綠肉餅兜蘭：花葶長(zhǎng)至6～19 cm時(shí)，花開(kāi)始開(kāi)放，單花花期(60.4±19.1)d，花葶長(zhǎng)度為(11.739±3.324)cm，花葶直徑為(0.443±0.045)cm，花徑為(9.641±1.278)cm。

水利工程建設(shè)可以在一定程度上解決我國(guó)的防洪環(huán)境等方面的問(wèn)題，這將會(huì)直接影響我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和經(jīng)濟(jì)水平。因此，水利工程建設(shè)如果出現(xiàn)了問(wèn)題將會(huì)造成我國(guó)巨大的損失。在水利工程建設(shè)過(guò)程中，由于這個(gè)工程比較大，非常容易出現(xiàn)安全質(zhì)量問(wèn)題。所以，一定要重視其質(zhì)量問(wèn)題，加強(qiáng)對(duì)安全問(wèn)題的監(jiān)督，培養(yǎng)專(zhuān)業(yè)的技術(shù)、管理人才，構(gòu)建有效的水利工程質(zhì)量與安全監(jiān)督管理體系，為水利工程建設(shè)的發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，促進(jìn)我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

紅肉餅兜蘭：花葶長(zhǎng)至9～17 cm時(shí)，花開(kāi)始開(kāi)放，單花花期(59.7±13.6)d，花葶長(zhǎng)度為(13.177±2.574)cm，花葶直徑為(0.464±0.056)cm，花徑為(8.926±0.801)cm。

圖4 綠肉餅兜蘭的開(kāi)花進(jìn)程

圖2 紅肉餅兜蘭

2.3 開(kāi)花生物學(xué)特性

2.3.1花粉量、種子數(shù)、胚珠數(shù)測(cè)定

綠肉餅兜蘭單花花粉量和胚珠數(shù)的平均值為265 443.8±32 126和12 217.6±1 286.9；花粉/胚珠比率(P/O值)為20.9±4.4；每個(gè)蒴果種子量為11 281±197；胚珠/種子比率(O/S值)為1.083。紅肉餅兜蘭單花花粉量和胚珠數(shù)的平均值分別為255 693.8±54 265.5和11 768.9±2 173.8；花粉/胚珠比率(P/O值)為22.6±2.7；每個(gè)蒴果種子量為10 828.4±332.9；胚珠/種子比率(O/S值)為1.087。

圖3 2種肉餅兜蘭的開(kāi)花進(jìn)程

圖6 肉餅兜蘭花粉顯微圖

圖5 紅肉餅兜蘭開(kāi)花進(jìn)程

2.3.2花粉組織化學(xué)

將所測(cè)的綠肉餅兜蘭和紅肉餅兜蘭的花粉樣品浸入蘇丹Ⅲ染液后，顯微鏡下觀察花粉呈橘黃色，說(shuō)明花粉中存在脂質(zhì)(見(jiàn)圖7)。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

3.1.1花形態(tài)與開(kāi)花進(jìn)程觀察

兜蘭的花部形態(tài)較為特殊，由1枚中萼片、2枚花瓣、1枚合萼片、1枚唇瓣、雄蕊、退化雄蕊、花藥及柱頭構(gòu)成。其唇瓣結(jié)構(gòu)極為特殊，唇瓣呈兜狀，外側(cè)光滑，內(nèi)側(cè)布滿睫狀毛。

兜蘭的花期較長(zhǎng)，2種肉餅兜蘭的開(kāi)花進(jìn)程差別不大，從花葶抽出到花朵完全綻開(kāi)所需的時(shí)間稍長(zhǎng)，達(dá)60 d左右，從花朵完全綻開(kāi)至花瓣枯萎凋謝達(dá)60 d左右。

1) 花粉/胚珠比與胚珠/種子比率測(cè)定。綠肉餅兜蘭與紅肉餅兜蘭的花粉量、種子數(shù)與胚珠數(shù)差別較小。綠肉餅兜蘭單花花粉量和胚珠數(shù)的平均值分別為26 5443.8±32 126和12 217.6±1 286.9；每個(gè)蒴果種子量為11 281±197；花粉/胚珠比率(P/O值)和胚珠/種子比率(O/S值)分別為20.9±4.4和1.083。紅肉兜蘭單花花粉量和胚珠數(shù)的平均值為255 693.8±54 265.5和11 768.9±2 173.8；每個(gè)蒴果種子量為10 828.4±332.9；花粉/胚珠比率(P/O值)和胚珠/種子比率(O/S值)分別為22.6±2.7和1.087。

圖7 肉餅兜蘭花粉染色圖

圖8 兜蘭花部結(jié)構(gòu)

2) 花粉組織學(xué)。綠肉餅兜蘭與紅肉餅兜蘭的花粉經(jīng)蘇丹Ⅲ染液染色后，呈橘黃色，表明其花粉中含有脂質(zhì)。

3.2 討 論

3.2.1花形態(tài)與開(kāi)花進(jìn)程觀察

兜蘭特殊的兜狀唇瓣結(jié)構(gòu)，外側(cè)光滑，令落入兜中的傳粉者難以攀爬，內(nèi)側(cè)布滿睫狀毛，利于傳粉者攀爬，這種形態(tài)有利于昆蟲(chóng)的傳粉，當(dāng)傳粉昆蟲(chóng)被兜蘭鮮艷的顏色與凸起的退化雄蕊吸引后，會(huì)落在退化雄蕊上，因表皮光滑而滑入兜狀的唇瓣中，順著唇瓣中易攀爬處逃出時(shí)會(huì)擦碰兜蘭柱頭，然后碰觸雄蕊，將花粉帶出，再落到另一朵花中完成授粉過(guò)程(如圖8)。

兜蘭從抽葶至開(kāi)花所需時(shí)間較長(zhǎng)，兜蘭開(kāi)花先從花葶抽出開(kāi)始，當(dāng)花葶停止生長(zhǎng)后，花苞開(kāi)始綻放，而兜蘭的觀賞價(jià)值主要在其艷麗特殊的花部，因此，可以通過(guò)縮短抽葶至開(kāi)花所需的時(shí)間促使花苞提早綻放。

3.2.2開(kāi)花生物學(xué)特性

1) 花粉/胚珠比與胚珠/種子比率測(cè)定。Cruden在1977年提出，花粉/胚珠比(P/O值)反映了花粉到達(dá)柱頭產(chǎn)生的最大結(jié)實(shí)率，比值越低，柱頭面積越大，花粉傳遞越有效，產(chǎn)生最大結(jié)實(shí)率的可能性越高[25]。本試驗(yàn)中，綠肉餅兜蘭與紅肉餅兜蘭的P/O值較低，且具有較大的柱頭面積，結(jié)實(shí)率較高。

Cruden認(rèn)為，花的P/O值在2.7～6.7之間屬于閉花受精型；在18.1～39之間屬于專(zhuān)性自花傳粉型；在31.9～396.9之間屬于兼性自花傳粉型，在244.7～2 558.6之間屬于兼性異花傳粉型；在2 180～19 523之間屬于專(zhuān)性異花傳粉型[25]。綠肉餅兜蘭與紅肉餅兜蘭是通過(guò)吸引昆蟲(chóng)進(jìn)行異花傳粉進(jìn)行受精，這與Cruden所提出的專(zhuān)性自花傳粉的結(jié)果不同，這可能是因?yàn)槠渚哂休^大的柱頭且花粉具有粘性，傳粉機(jī)制復(fù)雜、特別引起的。

綠肉餅兜蘭與紅肉餅的胚珠/種子比(O/S)差別不大，且均接近于1，表明其花粉活力與胚珠的受精能力較高，具有高效的傳粉機(jī)制。

2) 花粉組織學(xué)。Baker等在1979年提出，花粉屬淀粉質(zhì)地的花具有風(fēng)媒傳粉的特性，花粉屬脂質(zhì)的花一般具有蟲(chóng)媒傳粉的特性[26]。由此可知，綠肉餅兜蘭與紅肉餅兜蘭為蟲(chóng)媒花且由蠅類(lèi)與蜂類(lèi)作為傳粉者，但并沒(méi)有將花粉作為對(duì)傳粉者的報(bào)酬，而是一種欺騙傳粉者的進(jìn)化特性。

傳粉生物學(xué)的研究對(duì)植物的保育具有很重要的意義。兜蘭具有極高的觀賞特性，野生狀態(tài)下繁殖困難，目前對(duì)于兜蘭的傳粉生物學(xué)研究報(bào)道甚少，而兜蘭在長(zhǎng)期的演化過(guò)程中又形成了幾近完美的傳粉模式，通過(guò)對(duì)不同品種兜蘭的傳粉系統(tǒng)進(jìn)行深入探索，了解其開(kāi)花進(jìn)程、傳粉機(jī)制的演化、交配系統(tǒng)以及繁殖系統(tǒng)等，將對(duì)兜蘭的花期調(diào)控，提高繁殖率等方面提供重要的理論依據(jù)與技術(shù)支持，對(duì)兜蘭的傳粉模式的進(jìn)化與保育具有重要的意義。