(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

醇溶蛋白是存在于植物種子中的一種儲藏蛋白，目前對于小麥、玉米、高粱等植物醇溶蛋白的提取及應(yīng)用研究都有較多的報道[1-3]，但對豆類種子醇溶蛋白的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用2種不同的提取體系對大豆種子醇溶蛋白進(jìn)行提取，并進(jìn)行了SDS-PAGE體系的建立，旨在對豆類作物醇溶蛋白的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為墾農(nóng)16大豆種子，市購。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用2個混合提取體系提取大豆種子醇溶蛋白，每一體系均采用正交試驗(yàn)，設(shè)計三水平四因素試驗(yàn)(見表1)，提取大豆醇溶蛋白。提取后采用考馬斯亮藍(lán)G 250法[4]測定體系中醇溶蛋白濃度。

提取體系Ⅰ：A.55 mL乙二醇+15 mL正丙醇；B.65 mL乙二醇+15 mL正丙醇；C. 75 mL乙二醇+15 mL正丙醇，各加蒸餾水至100 mL；

提取體系Ⅱ：A.55 mL乙二醇+25 mL正丙醇、B.55 mL乙二醇+35 mL丙醇、C.55 mL乙二醇+45 mL正丙醇，各加蒸餾水至100 mL。

電泳實(shí)驗(yàn)為SDS-PAGE體系[4]，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為10%，上樣量為19μL。

表1 L9表

試管號固液比(g/mL)溫度(℃)時間(h)提取液濃度(%)11(1∶10)1(30)1(1)1(A)21(1∶10)2(40)2(2)2(B)31(1∶10)3(20)3(3)3(C)42(1∶15)1(30)2(2)3(C)52(1∶15)2(40)3(3)1(A)62(1∶15)3(20)1(1)2(B)73(1∶20)1(30)3(3)2(B)83(1∶20)2(40)1(1)3(C)93(1∶20)3(20)2(2)1(A)

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆醇溶蛋白提取分析

圖1是提取體系Ⅰ提取大豆種子醇溶蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過各因素對大豆種子醇溶蛋白提取的極差計算可知，4種因素對于提取的影響是不同的，其中對于提取有較大影響的因素是提取時間，影響較小的因素是提取溫度，固液比和提取液濃度對提取的影響相差無幾。圖2是提取體系Ⅱ各因素對大豆種子醇溶蛋白提取的極差計算，與提取體系Ⅰ相同，4個因素中同樣表現(xiàn)出提取時間對醇溶蛋白提取有較大影響，而溫度對于提取的影響較小。

圖1 提取體系Ⅰ提取大豆醇溶蛋白各因素極差

圖2 提取體系Ⅱ提取大豆醇溶蛋白各因素極差

2.2 SDS-PAGE分析

圖3、圖4分別是2個不同提取體系提取大豆醇溶蛋白SDS-PAGE圖譜，上樣量均為19μL。提取體系Ⅰ的電泳圖譜中每1個泳道條帶均較清晰，差別不大。而提取體系Ⅱ的電泳圖譜則表現(xiàn)出不同的泳道有所不同，并且清晰度較差。

圖3 提取體系Ⅰ電泳圖譜

圖4 提取體系Ⅱ電泳圖譜

3 討論與結(jié)論

醇溶蛋白被定義為可以溶于乙醇等醇類物質(zhì)的一類蛋白，通常是由分子量為30～90 kDa不同的亞基所構(gòu)成[5]。不同作物種子中所含的醇溶蛋白有不同的亞基構(gòu)成及結(jié)構(gòu)，因此在不同體系中溶解性是不同的。對于大豆種子醇溶蛋白的提取所設(shè)置的4個因素中，2個提取體系均表現(xiàn)為提取時間為較大影響因素，而提取溫度為較小影響因素，與之前的研究有所不同[6]。

在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，大豆種子醇溶蛋白在不同的提取劑中有不同的溶解性，其中用乙二醇提取大豆種子醇溶蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE效果較好[6]。本次研究采用了混合體系對大豆種子醇溶蛋白進(jìn)行提取，其中包括2種物質(zhì)：乙二醇和正丙醇。提取體系Ⅰ中正丙醇含量不變，均為15 mL，乙二醇含量分別為55，65 mL和75 mL；提取體系Ⅱ中乙二醇含量不變，均為55 mL，正丙醇分別為15，25 mL和35 mL，結(jié)果顯示，提取體系Ⅰ提取大豆醇溶蛋白SDS-PAGE效果較好，而提取體系Ⅱ提取大豆種子醇溶蛋白SDS-PAGE效果不佳。因此認(rèn)為，正丙醇的濃度對大豆種子醇溶蛋白的提取及SDS-PAGE有一定的影響，在一定的提取體系中正丙醇濃度相對較小的情況下有利于大豆種子醇溶蛋白的提取及SDS-PAGE，而正丙醇濃度相對較高時則不利于大豆種子醇溶蛋白提取及SDS-PAGE體系的優(yōu)化。